Abstract

E-caderina é fundamental para a manutenção da arquitetura do tecido devido ao seu papel na adesão célula-célula. mutações caderina-E são a causa genética da difuso hereditário Câncer Gástrico (HDGC) e mutações missense representam um fardo clínico, devido à incerteza do seu papel patogênico. In vitro e in vivo, a maioria das mutações levam a perda de função, embora o factor causal é desconhecida para a maioria. Nossa hipótese é que a desestabilização poderia explicar a patogenicidade de mutações missense E-caderina em HDGC, e testou nossa hipótese usando in silico e em ferramentas in vitro. FoldX algoritmo foi utilizado para calcular o impacto de cada mutação de E-caderina-estabilidade estado nativo, e a análise foi complementada com a conservação evolutiva, por SIFT. Curiosamente, os pacientes que albergam hdgc linha germinal de E-caderina mutantes desestabilizando apresentar uma idade de diagnóstico ou morte, o que sugere que a perda de estabilidade de estado nativo de contas da caderina-E o fenótipo da doença. Para elucidar a importância biológica da desestabilização de E-caderina em HDGC, nós investigamos um grupo de mutações recentemente identificadas HDGC-associados (E185V, S232C e L583R), dos quais L583R está previsto para ser desestabilizador. Nós mostramos que esta mutação não é funcional in vitro, apresenta menor meia-vida e é incapaz de amadurecer, devido à degradação dependente de proteassoma prematuro, um fenótipo revertido pela estabilização com a mutação artificial L583I (estruturalmente tolerada). Aqui relatamos modelos estruturais de E-caderina adequados para prever o impacto da maioria das mutações de sentido trocado associados ao cancro e que mostram que a E-caderina desestabilização leva à perda de função in vitro e aumento da patogenicidade in vivo.

Citação: Simões Correia-J, J Figueiredo, Lopes R, Stricher F, Oliveira C, Serrano L, et al. (2012) E-caderina Contas desestabilização para a patogenicidade de missense mutações no difuso hereditário câncer gástrico. PLoS ONE 7 (3): e33783. doi: 10.1371 /journal.pone.0033783

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 09 de novembro de 2011; Aceito: 17 de fevereiro de 2012; Publicação: 21 de março de 2012

Direitos de autor: © 2012 Simões-Correia et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia, Portugal (PTDC /SAU-OBD /64319/2006, PTDC /SAU-OBD /104017/2008, SFRH /BPD /48765/2008), EMBO (ASTF comunhão de curto prazo 60- 2009) e da UE Perspectivas de subvenção (HEALTH-F4-2008-201648). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

e-caderina é uma glicoproteína de adesão célula-célula composta por cinco repetições do tipo caderina extracelulares, uma região transmembranar e uma cauda citoplasmática altamente conservado [1], [2]. E-caderina é expressa principalmente em células epiteliais e é o componente principal de Junções Aderentes (AJ). Estas junções de cluster, através de interacções homofílicas, através dos domínios extracelulares de moléculas de caderina-E dependentes de cálcio, sobre a superfície de células vizinhas homotípicos.

O papel da E-caderina no desenvolvimento do tumor é bem descrito, e os seus perda de expressão é uma característica marcante em carcinomas [3]. A evidência experimental apoia um papel para o complexo caderina-E tanto na supressão de invasão e metástase formação [4]. A perda da expressão de E-caderina está frequentemente associada a acontecimentos genéticos, tais como local de splicing e mutações de truncagem causadas por inserções, deleções e mutações nonsense, além de mutações missense [5]. No cancro gástrico difuso esporádica, alterações no gene que codifica E-caderina (CDH1) encontram-se, preferencialmente, em exons 7-9 [5], enquanto que em cancros da mama lobular eles estão espalhados ao longo do gene, sem ponto de acesso preferencial [6]. Mutações são encontradas nestes dois tipos de câncer esporádico e também no sarcoma sinovial [7].

A agregação familiar de Câncer Gástrico Difuso (DGC) representa 10% dos casos de câncer gástrico (GC), e só 1-3% são hereditários [8]. A partir desses casos familiares, difuso hereditário Câncer Gástrico (HDGC) é definida por critérios rigorosos que foram definidos pela Linkage Consortium Internacional de Câncer Gástrico (IGCLC) em 1999: (1) dois ou mais casos documentados de câncer gástrico difuso no primeiro segundo grau /parentes, com, pelo menos, uma diagnosticados antes dos 50 anos; ou (2) três ou mais casos de cancro gástrico difuso documentado em primeiro, segundo parentes /grau, independentemente da idade. Início precoce difusa Câncer Gástrico (EODGC) é considerado quando um indivíduo isolado é diagnosticado com DGC com menos de 45 anos de idade. mutações da linha germinativa CDH1 são encontrados em 30% dos casos hdgc [9]. A associação de mutações CDH1 e câncer gástrico familial foi primeiramente descrita por Guilford

et al

em 1998 [10] e, desde então, muitos estudos relataram diferentes tipos de mutações CDH1 em HDGC [11], [12], [13 ]. Entre todos os

CDH1

mutações germinativas relatados, 77,9% são nonsense, splice local e mutações frameshift (previstos para produzir códons prematuros de terminação) e 22,1% são mutações missense [9]. As mutações que geram PTC normalmente são deletérios, os pacientes são considerados portadores de alto risco, e são aconselhados a ter gastrectomia total profilática [14]. A patogenicidade de mutações missense não é simples, e essas alterações são comumente referidos como não Classificada Sequence variantes (USVs), devido à falta de critérios rigorosos para avaliar o seu impacto. Vários parâmetros foram tidas em conta para a classificação de USVs E-caderina em HDGC: 1) co-segregação da mutação com DGC (dentro de pedigrees); 2) frequência de mutação na população controle saudável; 3) recorrência mutação (em famílias independentes). A análise de segregação é muitas vezes impossível, com um pequeno número de casos afectados disponíveis para diagnóstico molecular [15], e a ausência de informação clínica é um passo limitante para inferir o significado patogénico desses mutações. Para contornar esta limitação, temos desenvolvido anteriormente

in vitro

ensaios funcionais para avaliar o impacto funcional da E-caderina mutações germinativas missense [16], [17]. No entanto, estes estudos implicam condições experimentais específicas de laboratório, ou seja, ensaios de biologia celular, e eles são demorados para uso na rotina.

In silico

previsões são fiáveis ​​e análise rápida que se pode usar para prever o impacto de mutações pontuais, especialmente quando a informação estrutural está disponível [18], [19].

Neste trabalho, exploramos o potencial da estrutura baseada em

in silico

previsões para avaliar o impacto das mutações missense e-caderina, encontrados em câncer hereditário e esporádica. Nossa análise foi baseada no cálculo das alterações de estabilidade no estado nativo induzidos por cada variante (ΔΔG = ΔG

WT-ΔG

Mut), obtida pelo algoritmo de proteína FoldX concepção [20], [21]. Curiosamente, o grupo de pacientes com mutações desestabilizando (ΔΔG 0,8 kcal /mol) é caracterizada por uma menor idade no momento do diagnóstico ou morte por DGC, sugerindo que a perda de E-caderina estabilidade em estado nativo contribui para o fenótipo da doença. Usando um modelo celular, analisou-se o fenótipo da desestabilização de E-caderina, e descobriram que, quando uma mutação induz diminuiu nativa-estado de estabilidade, a E-caderina for prematuramente degradado pelo proteassoma, exibe mais curta meia-vida, o que resulta na perda do adesivo função. Ao todo, os nossos resultados sugerem que a desestabilização explica a patogenicidade de mutações missense E-caderina encontrado em HDGC.

Materiais e Métodos

Recolha de sequência E-caderina variantes e PDBs

variantes e-caderina associados à HDGC ou EODGC foram coletados a partir da literatura, e as variantes somáticas foram coletadas a partir do Catálogo do Somatic Mutações em Câncer (COSMIC) de banco de dados (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cósmico/). Três nova sequência de E-caderina variantes onde relatou para o nosso laboratório para a análise funcional: E185V, S232C e L583R. Recentemente, foi relatado L583R, com dados funcionais associados [22].

PDBs-E-caderina relacionados foram identificados através da busca automática com a Swiss repositório de modelos (https://swissmodel.expasy.org). Alinhamento de sequências de E-caderina humana e cada uma das sequências utilizadas para os diversos modelos foi realizada com M-café [23], [24] (https://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/play?name=mcoffee ). As imagens foram preparadas com PyMOL. Após a análise de sequência e homologia estrutural, três PDBs foram seleccionados para utilização como modelos:. Ectodomínio de Xenopus C-caderina (APO 1L3W), prodomínio rato E-caderina (APO 1OP4) e o domínio de ratinho β-catenina interagindo (APO 1I7X)

FoldX cálculos e peneirar análise

Usando o comando FoldX (https://foldx.crg.es/)

Buildmodel

nós construímos três modelos diferentes (prodom�io, extracelular e citoplasmático); as três estruturas foram humanizados por substituição de cada aminoácido diferente. A estrutura resultante foi otimizado usando o comando

RepairPDB Comprar e as energias foram analisadas com o

Estabilidade

ou

AnalyseComplex

comandos. As mutações associadas à doença foram gerados com o

Buildmodel

comando, cada mutação repetido em cinco corridas. As energias são uma saída automática no FoldX, ea mudança estabilidade em estado nativo, ΔΔG, entre WT e mutante (ΔΔG = ΔG

WT-ΔG

Mut) também é gerado em um arquivo separado, com o padrão correspondente desvios, e todas as penalidades energéticos associados para cada mutação. Somente mutações com ΔΔG 0,8 kcal /mol foram consideradas prejudiciais

Nós usamos SIFT (https://sift.jcvi.org/, Classificação intolerante De Tolerant) para avaliar a conservação de cada substituição de aminoácidos, como anteriormente. descrito [25], usando o recurso de Blink de GI:. foram considerados 31073. Somente mutações com uma pontuação abaixo de 0,05 para ser intolerante

pROP (https://www.cbs.dtu.dk/services [26] /prop /) foi utilizado para avaliar se as mutações poderia ter um efeito sobre a clivagem prodom�io.

cultura celular e transfecções

e-caderina cDNA WT foi clonado em pIRES2-EGFP vector de acordo para a fabricação de instruções (Clontech, Takara Bio) e mutações E185V, S232C, L583R e L583I he-caderina foram induzidas por mutagénese dirigida, como descrito anteriormente [27]. O vector vazio (Mock) foi utilizado como controlo células

CHO (Ovário de Hamster Chinês) (número ATCC: CCL-61). Foram cultivadas em meio Alfa-MEM (Gibco, Invitrogen) suplementado com 10% de fetal de bovino soro (FBS; Gibco, Invitrogen) e 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, Invitrogen). As células foram esporadicamente avaliadas quanto à contaminação mycoplasm pelos testes de imunofluorescência com DAPI. As células foram transfectadas com 1 ug de cada um dos vectores que codificam as diferentes formas de E-caderina (WT, E185V, S232C, e L583R L583I) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acordo com o procedimento de fabrico. Para o estabelecimento linha celular estável, as células foram seleccionadas por resistência aos antibióticos para 5 ug /ml de blasticidina (Gibco, Invitrogen). Todas as linhas celulares foram mantidas num incubador humidificado com 5% de CO

2 a 37 ° C

Os ensaios funcionais

células de CHO transfectadas transientemente (Ovário de Hamster Chinês) (número ATCC:. CCL -61) foram sujeitas a citometria de fluxo, usando medição de fluorescência da GFP, para avaliar a eficácia de transfecção antes de cada experiência. Para o ensaio de agregação lenta, poços de 96 poços de placa foram revestidas com 50 ul de solução de ágar (100 mg de Bacto-Agar em 15 ml de PBS estéril). As células foram descoladas com tripsina e suspensas em meio de cultura. Uma suspensão de 1 × 10

5 células /ml foi preparada e 2 × 10

4 células foram semeadas em cada poço. A placa foi incubada a 37 ° C numa câmara humidificada com 5% de CO

2 durante 48 h. A agregação foi avaliada num microscópio invertido (ampliação de × 4) e fotografada com uma câmara digital.

Western blotting

Os lisados ​​celulares foram obtidos com tampão de lise Catenina (1% de Triton X-100, 1 % de Nonidet P-40 em PBS), suplementado com um cocktail inibidor de protease (Roche) e cocktail de inibidores de fosfatase (Sigma). quantificação de proteínas foi feito por um ensaio de Bradford modificado (Bio-Rad). Para cada amostra, 25 ug de proteína foi carregada, separados em 7,5% SDS-PAGE e electrotransferidas para uma membrana de nitrocelulose (GE Healthcare Life Sciences). As membranas foram bloqueadas com leite seco sem gordura 5% e 0,5% de Tween-20 em PBS. A imunotransferência foi realizada com anticorpos contra a E-caderina (1:1000; BD Biosciences), actina (1:1000; Santa Cruz Biotechnology), e α-tubulina (1:10000; Sigma). Sheep anti-rato (GE Healthcare Life Sciences) ou de burro anti-cabra (Santa Cruz Biotechnology) foram utilizados como anticorpos secundários, seguido por detecção ECL (GE Healthcare Life Sciences). As imunotransferências foram quantificadas em software Quantity One (Bio-Rad).

de células activadas por fluorescência (FACS)

As células foram cultivadas a uma monocamada confluente, individual com Versene (Gibco, Invitrogen) e ressuspensas em PBS gelado com 0,05 mg /ml de CaCl

2. Uma suspensão de 5 × 10

5 células foi centrifugada durante 5 minutos a 1500 rpm, 4 ° C, e lavadas em PBS com 0,05 mg /ml de CaCl

2 3% de BSA. As células foram incubadas durante 60 minutos com um anticorpo primário contra a E-caderina, HECD1 (Zymed Laboratories) em 1:100 diluição. As células foram lavadas duas vezes e depois incubadas com anti-ratinho biotinilado (Dako) a 1:100 diluição. As células foram lavadas duas vezes e, em seguida, incubadas com estreptavidina-PE CY5 (BD Pharmingen) em diluição 1:40. Finalmente, as células foram lavadas, ressuspensas em 500 ul de PBS, e 50000 células foram analisadas num citómetro de fluxo (Coulter Epics XL-MCL). Os dados foram analisados ​​com o software WinMDI.

imunofluorescente coloração

para imunofluorescência e microscopia, as células foram semeadas em lamelas de vidro e cultivadas até cerca de 80% de confluência, fixadas em metanol arrefecido com gelo durante 15 minutos, lavou-se 2 vezes com PBS, e incubadas com o anticorpo primário, diluído em PBS, BSA a 5%, durante 60 minutos à temperatura ambiente. Os anticorpos primários utilizados: monoclonal anti-E-caderina (BD Biosciences); coelho anti-Calnexina (Stressgen). Os anticorpos secundários utilizados: Alexa Fluor 488 anti-rato (1:500; Invitrogen); Alexa Fluor 594 anti-coelho (1:500; Invitrogen). As lamelas foram montadas em lâminas de vidro, utilizando Vectashield com DAPI para detecção nuclear (Vector Laboratories). A aquisição de imagens foi realizada em Carl Zeiss ApoTome Axiovert 200 M microscópio de fluorescência utilizando 40 × objetivos. As imagens foram adquiridas com câmara de Axiocam HRM e processados ​​pelo software Axiovison versão 4.8.

Os tratamentos com células

Para a inibição da síntese de proteína, as células foram tratadas com 25 mM de Cycloheximide por 8 h e 16 h, e a quantidade total de e-caderina foi analisada por WB como descrito anteriormente. Para o ensaio de inibição de proteassoma, as células foram semeadas em placas de 6 poços, cultivadas a cerca de 80% de confluência e foram incubadas durante 16 h com 10 uM MG132 (Calbiochem). lisados ​​celulares foram analisados ​​por WB como descrito anteriormente.

Resultados

1. modelos estruturais da caderina-E

Existem poucas estruturas humano E-caderina (HE-cad) disponíveis, e eles cobrem apenas pequenas porções da proteína (Tabela S1). Usando a pesquisa automática de Swiss repositório Modelo, descobrimos que PDB 1L3W, anotada para o domínio extracelular de comprimento total de Xenopus EP-caderina (EP-cad), é altamente homólogo ao mesmo domínio no E-caderina humana. Analisamos homologia da sequência de alinhamento usando M-café, um alinhamento múltiplo de sequências que combina a saída de vários vários pacotes de alinhamento de sequências (PCMA, Poa, mafft, músculo, T-café, ClustalW, ProbCons, DialignTX) [23], [24 ]. A Figura 1A mostra o alinhamento das duas sequências de domínio extracelular. As regiões de tijolos vermelhos representam perfeita concordância entre os métodos utilizados, representando sequências altamente semelhantes. Para construir a estrutura do modelo, removemos regiões sem similaridade (Figura 1A, estrelas), e limitou o modelo para regiões com o alinhamento confiável (seta preta, Figura 1A). A estrutura de Xenopus foi humanizado, conforme descrito no Material e Métodos e Figura 1B mostra o alinhamento estrutural dos domínios EC1-EC2 He-cad (a partir de PDB 2O72) e domínios EC1-EC2 da Xenopus derivada do modelo estrutural. As duas estruturas são quase sobrepostos, o que indica que a similaridade entre os domínios extracelulares da E-caderina humana e Xenopus EP-caderina é não só ao nível da sequência, mas também ao nível estrutural. A estrutura do modelo de E-cad humano exibe energias compatíveis com a estrutura de Xenopus, com uma ligeira queda de energia livre (ΔG) obtido para o modelo (ΔG

real = 559,99 kcal /mol e ΔG

model = 531,77 kcal /mol), indicando que a humanização não introduz confrontos extra. Recentemente, uma estrutura do domínio extracelular do mouse foi lançado (PDB 3Q2V, Tabela S1), e também utilizado esta estrutura como um modelo, como uma forma de refinar os resultados obtidos com o modelo de Xenopus.

A) alinhamento de sequências dos domínios extracelulares de e-cad humana e Xenopus EP-cad. As sequências extracelulares foram obtidos em UniProt com as referências correspondentes (E-caderina humana, P12830; Xenopus EP-caderina, P33148). H-regulares de café foi utilizado para realizar o alinhamento, um pacote que combina diferentes métodos de alinhamento. regiões de tijolos vermelhos estão em perfeita concordância em todos os métodos, as regiões verdes e amarelas são regiões de nenhum acordo entre os diferentes métodos de alinhamento. A pontuação média consistência obtida foi de 98, o que confirma a fiabilidade do alinhamento. As estrelas azuis identificar os aminoácidos que foram removidos a partir da estrutura 1L3W antes de humanização. A seta preta indica o fim do modelo estrutural obtido. B) A estrutura humana de domínios CE1-CE2 (APO 2O72, azul) foi alinhada com as mesmas áreas do modelo humano gerado a partir da estrutura de Xenopus (APO 1L3W, vermelho). Imagem criada com o PyMOL. C) representação esquemática de domínios E-caderina humanos, destacando a cobertura dos três modelos estruturais diferentes obtidos com FoldX (modelos de prodom�io, domínio extracelular ea Catenina domínio de ligação).

Nós estabelecemos dois outros modelos, cobrindo o prodominio (APO 1OP4, a partir de N-caderina de rato) e o domínio citoplasmático β-catenina (APO 1I7X, de rato e-caderina), usando a mesma metodologia. Ao todo, os três modelos de cobrir a maior parte da estrutura da proteína (Figura 1C): o modelo prodom�io abrange as posições 28-117, os modelos extracelulares posições 155-697 e o domínio citoplasmático β-catenina abrange 782-838. Ao nível do domínio justamembrana, uma estrutura é anotada, que compreende a superfície de interacção entre a E-caderina e p120 [28]. Esta estrutura contém um pequeno peptídeo de 18 aminoácidos de comprimento (cobrindo posições 756-773 em He-cad), com muito baixo conteúdo estrutural, fatores que diminuem a confiabilidade dos cálculos de energia, de modo que nós descartamos essa estrutura da análise.

2.

In silico

previsão do impacto dos associados ao câncer USVs E-caderina

mutações caderina-E não são apenas a causa genética da HDGC, mas eles também são freqüentemente encontrados em diferentes tipos de esporádica cancros. Analisamos

in silico

o impacto de todas as mutações E-caderina missense associados ao câncer que localizam nas regiões abrangidas pelos modelos estruturais gerados: 22 mutações germinativas encontrados nas configurações do HDGC e EODGC, e 57 encontrados em cancros esporádicos. USVs-caderina E germinativas foram coletados a partir da literatura, e alguns são comunicações pessoais de nosso laboratório. Algumas mutações HDGC /EODGC não são possíveis para modelar, devido à falta de informação estrutural (por exemplo os localizados no domínio justamembrana de caderina-E), e não foram incluídos na análise. mutações somáticas foram coletadas a partir do banco de dados do Cancer Genome Project, e contêm mutações encontradas no cancro gástrico e lobular de mama (os dois únicos tipos de câncer associados à HDGC), mas também outros tipos de câncer, como o sarcoma sinovial ou carcinoma do ducto biliar (Tabela S2 ).

Usando os modelos estruturais descritas anteriormente, foram utilizados FoldX para gerar cada um dos USVs câncer associado, e avaliada a sua estabilidade em estado nativo, ΔG (comumente referido como energia total para simplificar) [20]. A diferença energética entre a referência WT e mutante correspondente (ΔΔG = ΔG

WT-ΔG

Mut) foi calculada para os 22 hdgc /EODGC USVs E-caderina localizadas nas regiões abrangidas pelas estruturas modelo, eo os resultados estão listados na Tabela 1. Quando ΔΔG é negativo, isto reflecte um aumento de estabilidade de estado nativo sob a forma mutante; quando é positivo, isso implica que o mutante é menos estável, em seguida, a referência WT. Estudos anteriores em outras proteínas têm mostrado que as alterações de estabilidade calculadas com algoritmo FoldX abaixo de 0,8 kcal /mol estão dentro do erro de alteração do software, e são, portanto, considerado não significativo [21]. mutações Nesse sentido, só consideradas desestabilizadoras quando induzir mudanças de energia acima de 0,8 kcal /mol. Na Figura 2A, as mutações acima do esquema são desestabilizador, enquanto os de fundo são estruturalmente tolerada. É evidente que as mutações são desestabilizando spead ao longo da proteína, sem domínio preferencial afectada.

A) Representação esquemática dos domínios de E-caderina, o mapeamento de todas as mutações da linha germinativa modelados encontrados no ambiente de HDGC ou EODGC. Acima do esquema são as mutações que resultaram em destabilização, como previsto por FoldX (ΔΔG 0,8 kcal /mol) e a seguir o esquema de todos os não-destabilizar mutações (ΔΔG 0,8 kcal /mol). As mutações recentemente identificadas estão sublinhados. B) FoldX e peneirar foram utilizadas para avaliar o impacto das mutações presentes em A) e as previsões foram classificados como: verdadeiros positivos (TP), quando o software de alto impacto e prevê a exposição na perda de mutantes in vitro da função; Verdadeiros negativos (TN), quando o software prevê nenhum impacto e o mutante é funcional in vitro; Falsos resultados positivos (FP), quando o software prediz alto impacto, mas os mutantes é funcional in vitro; e falsos negativos (FN) quando o software prevê nenhum impacto e os mutantes exposições em perda de função vitro. Os resultados de ambos os preditores resultar em 70% de sobreposição com a função da proteína E-caderina testados in vitro (TP + TN). C) Box-plot representando a mediana e interquartis das alterações de estabilidade no estado nativo (ΔΔG) das mutações desestabilizadora e não-desestabilizadores, como previsto por FoldX. D) Box-plot representando a mediana e intervalos interquartis de idades de gástrico detecção do câncer ou morte associadas, correspondentes aos portadores de mutações desestabilizadora e não-desestabilizadora. Todos os dados foram coletados a partir da literatura. O grupo de pacientes com mutações desestabilizando é caracterizada por uma idade mais jovem clara do diagnóstico ou morte, sugerindo a contribuição de desestabilização da caderina-E para o fenótipo da doença.

O prodom�io de He-cad é clivada durante a maturação, e se isso não for feito, a função adesiva e-caderina é prejudicada [29], [30]. Para as mutações localizadas nesse domínio, foi avaliado o impacto no total de energia com FoldX, a conservação com SIFT e também avaliou se a interferência com o local de clivagem prodom�io com PROP (detalhes em Materiais e Métodos). Descobrimos que tanto hereditária (G62V e T118R) e esporádica mutações localizadas no prodomínio E-caderina (P30T, G62D, H92Y, H121R e H123Y) são estruturalmente tolerado, como previsto por FoldX (Tabela S3). Quando analisamos o impacto baseado na conservação usando SIFT, também encontramos que nenhuma das mutações foi considerado prejudicial, porque o seu grau de conservação é baixa (Tabela S3). Estes resultados indicam que a patogenicidade de USVs E-caderina localizada no prodomínio não é provavelmente dependente de desestabilização. Também encontrou nenhum efeito sobre a clivagem do pró-péptido, como previsto por PROP (dados não mostrados). Dessa forma, acreditamos que a patogenicidade de mutações E-caderina neste domínio podem resultar da interferência com a ancoragem de proteínas envolvidas no processamento prodom�io, impossível prever

in silico

.

hereditária E USVs -cadherin abrangem o comprimento total do domínio extracelular, enquanto que mutações pontuais são predominantemente encontrados em EC2 EC3-, como de acordo com o ponto de acesso previamente descrito em exons 7-9 [5]. Do total de 18 mutações da linha germinativa HDGC /EODGC localizadas neste domínio, verificou-se que 10 possuem um impacto estrutural significativa na proteína (Tabela 1). Aproximadamente metade das mutações pontuais são também desestabilizar (Tabela S3), independentemente do domínio CE onde elas são localizadas, o que sugere que a desestabilização do estado nativo pode ser associado a uma fracção substancial de cancros esporádicos, com a perda de E-caderina através de mutação pontual.

Apenas três mutações estão localizadas na região mapeada pelo modelo do domínio citoplasmático de ligação β-catenina (P799R, V832M, S838G): os primeiros dois identificados na configuração HDGC /EODGC e o outro um esporádica, encontrado em carcinoma dos ovários [31]. Por estas mutações foram analisadas a energia de ligação entre a E-caderina e β-catenina e descobriram que nenhum deles altera significativamente a afinidade de ligação de β-catenina, de acordo com a previsão FoldX. Isto está de acordo com o

In vitro

resultados que mostram que a mutação hereditária V832M eficientemente se liga β-catenina e a sua patogenicidade parece ser dependente da incapacidade do complexo E-caderina /catenina β-se ligar α -catenina, [33] [32].

Foram coletadas todas as previsões e funcional

in vitro

dados de mutações HDGC /EODGC e analisou a fiabilidade dos preditores utilizados (Tabela 1). Classificamos os resultados das previsões como: verdadeiro positivo (TP) quando a mutação está previsto como deletéria

in silico

(seja por FoldX ou SIFT) e apresentam perda da função

in vitro

; Verdadeiro negativo (TN), quando a mutação está previsto, conforme tolerado

in silico

e é funcional

in vitro

; Falso Positivo (FP), quando a mutação é previsto como deletéria

in silico

mas é funcional

in vitro

; e falso negativo (FN), quando a mutação está previsto, conforme tolerado

in silico

mas exposições

in vitro

perda de função. TP e TN são resultados positivos, o que significa que os preditores são capazes de detectar o impacto mutação em função; FP e FN representar o seu grau de deficiência. Verificou-se que ambos os algoritmos são capazes de prever o impacto funcional de até 70% da linha germinal mutações HDGC /EODGC (11 de 16 mutações), com as previsões de sobreposição para metade das mutações (Tabela 1, Figura 2B).

Foram analisados ​​os dados disponíveis para os germinal hdgc EODGC mutações portadores e /, embora a informação é limitada, descobrimos que o conjunto mais completo de dados é a idade de início ou morte associada a DGC. Quando box-plot esses dados, o agrupamento “Desestabilizar” e “Non-desestabilizar” portadores da mutação, observamos uma idade mais jovem evidente do início da doença (diagnóstico ou morte) para o primeiro grupo (Figura 2D), sugerindo que a desestabilização-estado nativo contas para o desenvolvimento anterior do DGC.

3. significado biológico de desestabilização E-caderina

Para determinar o significado biológico de desestabilização E-caderina, foi utilizado como sistema modelo três mutações missense da caderina-E germinativas recentemente identificados relatados para o nosso laboratório para caracterização funcional: E185V, S232C e L583R, a posterior recentemente descrito na literatura [22]. O

in silico

análise descrita anteriormente foi realizada para estes três novas mutações e os resultados estão incluídos na Tabela 1 (abaixo da linha de escuro). As mutações E185V e S232C são estruturalmente tolerado, com ΔΔG = 0,29 kcal /mol e -0.9 kcal /mol, respectivamente (Tabela 1), considerado insignificante em relação ao impacto na estrutura. A mutação S232C promove a redução da energia, a estabilização da proteína, e isto é devido à perda de energia elevada de uma serina enterrado grupo OH, o que não está envolvido numa ligação-H, e para o alojamento da cadeia lateral de Cisteína. Mutação L583R induz desestabilização, com ΔΔG = 2,72 kcal /mol, refletindo a mudança dramática de um hidrofóbica para aminoácido hidrofílico, que resulta em uma arginina não são capazes de formar ligações de H, sendo desfavoravelmente enterrado.

n vitro

ensaios funcionais foram realizados para as mutações HDGC /EODGC acima mencionados, e encontramos uma correlação perfeita entre a funcionalidade

in vitro

ea presença /ausência de impacto estrutural: E185V e S232C mantêm a função adesiva de e-caderina, e são capazes de formar agregados celulares apertadas, enquanto L583R exibe um padrão disperso clara, assemelhando-se células Mock (Figura 3A), o que indica que E185V e S232C é não patogénico e L583R é patogénica.

células CHO foram transientemente (A) ou de forma estável (B-C) transfectadas com um vector vazio (Mock) ou WT, E185V, S232C, L583R ADNc de e-caderina. A) ensaio de agregação funcional foi realizada como descrito em Material e Métodos. células L583R mostram perda de E-caderina de função, resultando em um padrão espalhados, assemelhando-se células Mock. ΔΔG foi calculado usando o algoritmo FoldX e é de 0 para a referência WT; B) Os lisados ​​celulares totais foram preparados e E-caderina foi detectado por Western blot utilizando anticorpo anti-E-caderina. O anticorpo anti-α-tubulina foi utilizada como um controlo de carga. A expressão de L583R é reduzida e deslocado para peso molecular mais elevado, sendo indicativo de retido como imaturos (cerca de 130 kDa). C) A expressão da E-caderina no plasma de membrana (PM) foi avaliada utilizando citometria de fluxo, após coloração com um anticorpo de E-caderina anti-humano extracelular. L583R é menos expressa na PM.

Quando analisamos a expressão da caderina-E nas diferentes linhas celulares, descobrimos que a quantidade total de L583R mutante é menor que a expressão WT nas mesmas condições, embora as mutações E185V e S232C, manter níveis normais (Figura 3B). Curiosamente, a banda correspondente à L583R é retida no gel, indicando que L583R não é capaz de amadurecer adequadamente (forma imatura da E-caderina é 130 kDa, madura é de 120 kDa) e citometria de fluxo resultados mostram que é menos expresso na membrana plasmática (Figura 3C).

Quando a maturação da proteína falhar, isso geralmente resulta em retículo endoplasmático (ER) retenção de proteína imatura.