Abstract

A ingestão de vitamina E tem sido implicado na redução do risco de cancro da bexiga. No entanto, os mecanismos são ainda imperceptíveis. Aqui nós relatamos que δ-tocotrienol (δ-T3), um dos isômeros da vitamina E, possuía a capacidade citotóxica mais potente contra células de câncer de bexiga humanos, em comparação com outros isômeros da vitamina E. δ-T3 inibiu a proliferação de células cancerosas e colonogenicity através da indução de parada fase G1 e apoptose. ensaio de transferência de Western revelou que δ-T3 aumentou os níveis de expressão de inibidores do ciclo celular (p21, p27), proteína pro-apoptótica (Bax) e suprimiu os níveis de proteína ciclo celular (ciclina D1), proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2 de expressão , Bcl-x

L, e de Mcl-1), resultando na activação da caspase-3 e PARP de clivagem. Além disso, o tratamento δ-T3 nível inibiu a fosforilação induzida ETK e SHP-1 expressão, que foi correlacionada com a regulação negativa da activação da STAT3. Em conformidade com isso, δ-T3 reduziu o nível de proteína STAT3 em fracção nuclear, bem como a sua actividade de transcrição. Knockdown de SHP-1 parcialmente revertida a paragem do crescimento celular induzida por δ-T3. É importante notar, baixa dose de δ-T3 sensibilizados efeitos citotóxicos induzidos por gemcitabina em células de cancro de bexiga humana. Em geral, os nossos resultados demonstraram, pela primeira vez, os efeitos citotóxicos da δ-T3 em células cancerosas da bexiga e sugere que δ-T3 pode ser um reagente quimiossensibilização promissor para gemcitabina no tratamento do cancro da bexiga

citação:. Ye C, W Zhao, Li H, J Zhuang, Yan X, Q Lu, et al. O cancro de bexiga (2015) δ-tocotrienol Induz Humano Detenção celular Crescimento, apoptose e quimiossensibilização através da inibição da STAT3 Caminho. PLoS ONE 10 (4): e0122712. doi: 10.1371 /journal.pone.0122712

Editor do Academic: Andrea Morrione, Thomas Jefferson University, United States |

Recebido: 02 de dezembro de 2014; Aceito: 13 de fevereiro de 2015; Publicação: 07 de abril de 2015

Direitos de autor: © 2015 Ye et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia da República Popular da China (2011CB944104), a National Science Foundation Natural da China (81172009, 81372168) , Fundo de Doutorado do Ministério da Educação da China (20110091120028) para Dr. J. Yan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O cancro da bexiga é um problema clínico importante em todo o mundo. É o segundo tipo mais comum de câncer do trato urinário nos países desenvolvidos, com a estimativa de 74,690 novos casos e 15.580 mortes nos EUA em 2014 [1]. Infelizmente, o cancro da bexiga também é uma das neoplasias mais recorrentes e caros, com custo anual de quatro bilhões de dólares norte-americanos em doentes com cancro da bexiga nos EUA em 2010 [2-4]. Ressecção cirúrgica, radioterapia e quimioterapia são abordagens terapêuticas comuns para o câncer de bexiga. No entanto, diferentes efeitos secundários estão associados com cada tratamento e algumas células cancerosas, eventualmente, tornar-se resistentes aos medicamentos. Portanto, é imperativo desenvolver novas estratégias para combater o cancro da bexiga, incluindo terapias complementares que podem ser usados ​​em combinação com tratamentos atuais.

A vitamina E ingestão foi inversamente relacionada ao risco de cancro da bexiga entre os indivíduos mais velhos ou fumantes pesados a partir de vários estudos epidemiológicos [5,6]. Ambos os tocoferóis (tp) e tocotrienóis (T3) pertencem à família da vitamina E, e cada subfamília é composta de quatro isómeros: α-, β-, δ- e γ. A principal diferença entre TP e T3 é a estrutura de suas cadeias laterais, com farnesil para T3 e phytyl saturado para TP [7-9]. Em comparação com TPs, que são comumente encontrados nas folhas e sementes da maioria das plantas, T3s são menos abundantes e encontrada principalmente no óleo de palma e de farelo de arroz. Dois ensaios clínicos, o julgamento Women Study Saúde (PMS) e do selênio vitamina E e Prostate Cancer Quimioprevenção Trial (SELECT), foram realizados para investigar a propriedade prevenção do câncer de α-TP [10,11]. Nem estudo mostrou efeito significativo da α-TP contra pulmão, mama e cancro do cólon em mulheres e câncer de próstata em homens. Portanto, diferentes isômeros T3 ter evocado mais atenção de pesquisa recentemente, devido à sua potencial aplicação como agente anti-câncer não-tóxico dietético [12-14]. Entre eles, δ-T3 mostraram forte potência contra vários tipos de cânceres, incluindo pâncreas, colo-rectal e cancro da mama [15-17]. No entanto, se δ-T3 possui atividade anticancerígena contra o cancro da bexiga ainda não foi explorada.

A ativação do sinal do transdutor e ativador de transcrição 3 (STAT3) é frequentemente detectada em vários tipos de cancro, incluindo o cancro da bexiga [18 ]. A fosforilação do resíduo de tirosina 705 na proteína STAT3, que é um acontecimento essencial para a sua activação, leva a formar homodímeros STAT3 e translocação para o núcleo. Nuclear dímero STAT3 localizada se liga aos promotores de diferentes genes alvo e regula suas transcrições, que estão envolvidos na proliferação de células de cancro, invasão e sobrevivência [19]. Além disso, é relatado que ultravioleta induzida apoptose celular pode ser reprimida pela activação da STAT3; enquanto que a inibição STAT3 induz apoptose dependente Caspase e inibe a migração celular e angiogênese em células de câncer [20,21]. estudo recente revelou ainda que STAT3 constitutivamente ativados nas células uroteliais acelera a progressão para o câncer de bexiga músculo-invasivo, indicando que STAT3 desempenha um papel crítico no desenvolvimento do câncer da bexiga [22].

Neste estudo, observou-se o mais forte citotoxicidade de δ-T3 em linhas celulares de cancro da bexiga humanos do que urothelial células imortalizadas não-malignas. Mecanisticamente, mostrámos que δ-T3 inibiu a activação ETK e supra-regulados SHP-1 expressão, que está correlacionado com a supressão da via de sinalização da STAT3. Também demonstramos dose baixa de δ-T3 aumentou a sensibilidade das células de câncer de bexiga ao agente quimioterapêutico -. Gemcitabina

Materiais e Métodos

Reagentes e linhas celulares

Todos os produtos químicos e reagentes foram adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) a menos que especificado de outra forma. α-, γ-, δ-T3 e α-tocoferol (α-TP) foram gentilmente fornecidos pela Davos Life Science Ltd (Synapse, Singapura). A gemcitabina foi de Eli Lilly Company (Indianapolis, IN). Bcl-2, Bcl-x

L, MCL1, PARP, pró-caspase-3, pSTAT3 (Y705), pETK (Y40), STAT3, e anticorpos SHP-1 foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers , MA). ETK, os anticorpos para p21 e p27 foram da BD Biosciences (San José, CA). anticorpo de p-actina foi adquirido à Companhia AbMax Biotecnologia (Pequim, China). anticorpo Bax foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). A linha de não-malignas imortalizado celular urotelial SV-HUC-1, linhas celulares de cancro da bexiga T24, 5637, J82 e UMUC-3 foram obtidos a partir Cell Bank, Type Culture Collection, da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China). Todas as linhas celulares foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, 100 unidades /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. As células são cultivadas em a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2. Como para o ensaio interferir siRNA, SHP-1 siRNA alvejando: 5′-GAGAACGCUAAGACCUACAtt-3 ‘e ARNsi de controlo: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3’ foram transfectados em células cancerosas, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), respectivamente

. a viabilidade das células de ensaio

Para o estudo de viabilidade de células, as células cancerosas 1,5 × 10

3 bexiga foram semeadas em cada poço de uma placa de 96 poços. As células foram então tratadas com diferentes concentrações (50, 100, 150, 200 uM) dos isómeros de vitamina E por 24, 48 e 72h. Após o tratamento, 10 uL de 5 mg de solução de MTT /ml foi adicionado a cada poço e as células foram incubadas a 37 ° C durante 3 h. Os cristais de formazan foram então re-suspenso em 100 ul de DMSO e a absorvância a 490 nm foi medida. Cada experimento foi repetido três vezes e as curvas de crescimento apresentaram as médias e desvios padrão.

Colony formação de ensaio

Depois de 14 dias de incubação de 100 M α-TP, α-T3, γ- T3 e T3-δ, as colónias foram fixadas com metanol 100% e coradas com violeta de cristal a 0,5%. Apenas as colónias com 50 células foram contadas. Cada tratamento foi repetido em triplicado.

análise de citometria de fluxo

As células foram incubadas com concentrações indicadas de δ-T3 durante 48 horas, antes de as amostras foram fixadas em 70% de etanol. As células foram incubadas em 10 mg /ml de RNase A, contendo PBS durante 30 min a 37 ° C, seguido pela adição de 1 mg /ml de iodeto de propídeo (Sigma). Em seguida, as células foram analisadas usando uma célula activado por fluorescência de fluxo (FACS) citómetro Calibur (BD FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA).

Análise de Apoptose

Anexina V /propídio iodeto de (PI) foi realizada utilizando coloração com Alexa Fluor 488 Anexina V /Dead celular Kit de apoptose (Invitrogen, Cat # V13245, Inc., Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as orientações do fabricante. Resumidamente, 1×10

6 as células foram tripsinizadas, seguindo-se a re-suspensão em 100 uL de tampão de ligação e incubou-se com 1,0 mL de PI e 5,0 jil de anexina V-isotiocianato de fluoresceína, durante 15 min no escuro à temperatura ambiente. Em seguida, as células foram detectados utilizando FACS Calibur Instrumento (Becton Dickinson) e analisados ​​utilizando software FlowJo 7,6.

em tempo real transcrição reversa análise de reacção em cadeia da polimerase

O ARN total foi extraído com Trizol (Invitrogen ). Os níveis de

bcl2

,

bclxl e MCL1

genes de expressão foram detectados por quantitativa transcrição reversa reação em cadeia da polimerase (qRT-PCR). Os primers estão listados a seguir:

bcl2

: para a frente, 5′-CGTACAGTTCCACAAAGGCA-3 ‘e reverter, 5′-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3’;

bclxl

: para a frente, 5′-TTCAGTGACCTGACATCCCA-3 ‘e inverso, 5′-TTCAGTGACCTGACATCCCA-3’;

MCL1

: para a frente, 5′-TCCCTGGAGAAGAGCTACG-3 ‘e reverter, 5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACA-3’;

β-actina

foi utilizado como um controlo interno. Os iniciadores para a

p-actina

foram 5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3 ‘e 5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’. qPCR foi realizado utilizando o SYBR Green (Takara Co. Biotechnology Ltd, Dalian, China) Método de detecção de corante ABI em Sequence Detection System StepOne sob condições padrão: 95 ° C durante 10 min, e 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s e 55 ° C para 31 método de S. comparativo Ct foi utilizado para a quantificação dos transcritos.

ensaio Western blot

as células foram lisadas em tampão RIPA contendo protease cocktail inibidor tablet (Roche Diagnostics, Indianapolis, EM) e cocktail de inibidor de fosfatase I (Sigma). Os lisados ​​celulares (20 ug) foi resolvida em SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de PVDF. Depois de mata-borrão no leite seco a 5% não gordo em solução salina tamponada com fosfato contendo 0,1% de Tween-20 (PBST), as membranas foram incubadas com anticorpos primários em 1: 500 a 1000 diluições em PBST ou% de BSA 5 durante a noite a 4 ° C , de acordo com as instruções dos fabricantes. As membranas foram lavadas e incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano, durante 1 hora, e finalmente detectado por ECL reagente (Thermo Scientific).

A actividade de luciferase ensaio

O efeito de δT3 em STAT3 responsivo elemento de promotor contendo a actividade (STAT3-Luc) foi analisada utilizando um ensaio de luciferase. células T24 (2,5 × 10

5 por po) foram semeadas em placas de 24 poços. Após cultura durante a noite, as células foram transfectadas por Lipofectamina 2000 (Invitrogen) com 0,5 ug de STAT3-Luc e 1 ng de TK-Renilla luciferase plasmídeo. Após 24 h de transfeco, as culas foram incubadas com δT3 durante 24 h e colhidas. A actividade de luciferase foi medida utilizando o sistema de ensaio de luciferase duplo (Promega) e detectados utilizando o leitor de microplacas Victor (Perkin-Elmer).

Nuclear extrai preparação

células T24 foram colocadas em placa de 10 cm, seguido pelo tratamento com 150 uM δ-T3 para 24 h. As células foram colhidas por tripsinização e lavadas duas vezes com PBS arrefecido em gelo. O sedimento celular foi suavemente ressuspenso em volumes de 4X de tampão de lise hipotónico gelado (10 mM de HEPES, pH 7,9, MgCl 1,5 mM

2, 10 mM de KCl, 0,3% EGTA NP-40, 0,1 mM de EDTA, 0,1 mM, DTT 0,5 mM) com inibidores de protease (Roche), e mantido em gelo durante 30 min. As células foram mantidas no tampão até que tenham inchado. Os lisados ​​celulares foram centrifugados durante 10 min a 10.000 x g. Os sobrenadantes foram extractos citossólicos. Ressuspender o precipitado (fracção nuclear) em volumes de 4X de tampão de lise de proteína forte (HEPES 10 mM, MgCl 1,5 mM

2, NaCl 420 mM, EDTA 0,2 mM, EGTA 0,1 mM, glicerol a 25%, DTT 0,5 mM) com a protease inibidor, durante 15 min. O sobrenadante foi recolhido como uma proteína nuclear através de centrifugação a 12000 rpm durante 30 min a 4 ° C.

imunoprecipitação da cromatina (ChIP)

ensaio chip foi realizada utilizando kit de ensaio de chip (Cat. 17- 295, Millipore), de acordo com as instruções do fabricante. Depois de extractos nucleares foram isolados como mostrado acima, o anticorpo contra a STAT3 (Cat # 9139, Cell Signaling Technology) foi utilizado para imunoprecipitar cromatina nas fracções nucleares, ao passo que um anticorpo de IgG inespecífica foi utilizado como um controlo negativo técnica. As medições foram feitas em triplicado e feito pela Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA). As sequências dos iniciadores utilizados para a análise ChIP-qPCR do

promotor do gene bclxl

são como se segue: Bcl-xL-iniciador 2F 5′-CTGGGTTCCCTTTCCTTCCA-3 ‘, Bcl-XL-2R iniciador 5’-TCCCAAGCAGCCTGAATCC -3 ‘[23]; Bcl-xL-1F iniciador 5’-CCCTTGCAGCTAGTTTTCTA-3 ‘, Bcl-XL-1R iniciador 5′-TGAATTCTGAGGCCAAGGGAA-3′; Bcl-xL-iniciador 5’-NCF TGCCAGGCCTTCGCTCAA-3 ‘, Bcl-XL-iniciador NCR 5-CAGATAAACTCTGTCCACAGA-3’. Primer conjunto 1 é 954 pb a jusante do local de início da transcrição, enquanto conjunto de primers 2 é 1.277 bp a jusante do TSS, cobrindo um motivo STAT3 conservada obrigatório previsto pelo website (www.dcode.org). Primer NC está localizada em 1880 pb a jusante do último exão, que serve como um controlo negativo.

A análise estatística

Todos os valores numéricos são representados como a média ± DP. O teste t de Student independente foi utilizado para análise estatística. A significância foi definida como

P Art 0,05.

Resultados

efeito citotóxico do isômeros da vitamina E em células de câncer de bexiga

A fim de examinar o que isômeros da vitamina E tem efeitos citotóxicos em células de câncer de bexiga humanos

in vitro

, nós tratamos quatro linhas celulares de cancro comumente usados ​​bexiga humana, T24, 5637, J82 e uMUC-3. Estas quatro linhas de células contêm vários graus de complexidade genética, cobrindo as mutações genéticas comuns encontrados em amostras de câncer de bexiga humanos. Estes incluem a inactivação do gene TP53 e Rb1, ativação de K-Ras e H-Ras ou perda de Pten (www.atcc.org). Os resultados mostraram que tanto γ- e δ-T3 exibido efeitos anti-cancro de um modo dependente da concentração, enquanto que α-T3, bem como α-TP não mostrou quaisquer efeitos citotóxicos dentro da gama de dosagens que testadas (Fig 1A ). Para testar os efeitos citotóxicos da vitamina E isómero em células normais da bexiga, que também tratada SV-HUC-1, uma célula urotelial não malignas imortalizadas com os isómeros de vitamina E. De nota, γ- e δ-T3 exercida menor toxicidade sobre a não-maligna de células da bexiga epitelial (Fig 1A). Além disso, o tratamento de δ-T3 e T3-γ também diminuiu significativamente os números de colónias, em comparação com a-T3 e α-TP (Fig 1B). Utilizando o ensaio de MTT e a formação de colónias, foi demonstrado que a ordem do efeito inibitório de isómeros A vitamina E é δ-T3 γ-T3 α-T3 e α-TP em todas as quatro linhas celulares de cancro da bexiga humanos; Portanto, δ-T3 foi escolhido para estudo adicional.

células cancerosas da bexiga (a) humana T24, 5637, J82 e umuC-3, bem como não malignas urotelial humano SV HUC-1 As células foram tratadas com cada isómeros vitamina e (α-TP, α-T3, T3 e γ-δ-T3) que variam de 0 a 200 uM, durante 72 h, e viabilidade celular foram detectados por ensaio MTT. (B) ensaio de formação de colónias de T24 5637, J82 e células UMUC-3 com 100 uM α-TP, α-T3, γ-T3 e T3-δ durante 14 dias. As barras verticais indicam a contagem média de células ± desvio padrão em cada grupo de tratamento. *,

P Art 0,05; ***,

P Art 0,001, comparado com o grupo de tratamento de veículo.

Distribuição

δ-T3 provoca a paragem em G1 e apoptose

Para demonstrar ainda mais o efeito anti-cancro de δ-T3, foram analisados ​​pelo ciclo celular citometria de fluxo (figura 2A-2D). células T24 e 5637 foram tratados com diferentes concentrações de δ-T3 (0, 50, 100 e 150 uM) durante 48 h. A análise de citometria de fluxo mostrou que o tratamento δ-T3 (≥ 100 uM) induziu paragem fase G1 e redução da população de células em fase S. Além disso, a população de células apoptóticas (sub-G1) aumentou de uma forma dependente da concentração (figura 2A-2D). Para caracterizar ainda mais a indução de apoptose, foi realizado ensaio de coloração V /PI anexina. Tal como mostrado na Fig 3, o tratamento δ-T3 índice apoptótico induzida em ambos T24 (Fig 3A) e células 5637 (Figura 3B) de uma forma dependente da concentração.

As células foram tratadas por δ-T3 variando entre 0-150 ^ M durante 48 h. razões de distribuição do ciclo celular e Sub-G1 foram avaliados por citometria de fluxo. *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01; ***,

P Art 0,001.

análise de anexina V /PI mostrou que δT3 induzida apoptose em T24 (A) e 5637 células (B) de câncer de bexiga, em comparação com células de controlo tratados com veículo.

δ-T3 induz inibidores do ciclo celular e para baixo-regula via pró-sobrevivência

análise de Western blot foi realizada para examinar ainda mais os níveis de proteínas envolvidas no ciclo celular e apoptose de expressão. Após 24 h de tratamento com δ-T3 em diferentes concentrações em T24 e 5637 células, observou-se o aumento dos níveis de inibidores do ciclo celular, p21 expressão

WAF1 /Cip1 e p27

KIP1, e diminuição dos níveis de ciclina D1 expressão ( Figura 4A). Além disso, o tratamento δ-T3 também activada pró-caspase-3, e resultou na clivagem de PARP (Fig 4B). Uma vez que a activação de caspase-3 pode ser pela via mitocondrial, testou-se as proteínas relacionadas com a apoptose sobre as mitocôndrias. Como mostrado na Fig 4C, o nível de proteína pro-apoptótica expressão, Bax foi aumentada; Por outro lado, as proteínas anti-apoptóticas, Bcl-2, Bcl-x

L, e de Mcl-1 foram reprimidos mediante o tratamento δ-T3. Como mostrado na S1 figura, a clivagem de marcadores de apoptose (caspase-3 e PARP), a indução da proteína Bax pró-apoptótica, assim como a redução de proteínas anti-apoptóticas também foram confirmados em outro duas linhas celulares de cancro da bexiga (J82 e UMUC-3).

análise de transferência de Western do ciclo celular (a), a apoptose (B) e outros níveis de proteína relacionada com apoptose (C) em células T24 e 5637, após o tratamento δ-T3 para 24 h. β-actina foi utilizado como controlo de carga.

δ-T3 e desfosforilado ETK upregulated SHP-1 para suprimir a STAT3 sinalização

Para dissecar ainda mais os efeitos de δ-T3 no jusante sinalização, nós analisamos a STAT3 via de sinalização, que é uma das principais vias anti-apoptóticas, conferindo a vantagem de sobrevivência e quimio-resistência das células cancerosas da bexiga contra vários agentes quimioterapêuticos [18-21]. Descobrimos que δ-T3 suprimiu o nível de fosforilação da STAT3 (Y705) de um modo dependente da concentração, tanto de T24 e 5637 linhas de células de cancro da bexiga (Figura 5A). A ativação do STAT3 é regulada por cinases a montante e fosfatases. No câncer de bexiga, epitelial e endotelial tirosina quinase (ETK) é frequentemente overexpressed [24]. Como uma tirosina-quinase não receptora, ETK activação /expressão é necessária para a activação da STAT3 em células cancerosas. Em conformidade com isso, observou-se que a forma activa de ETK (fosforilação em Y40) foi reduzido com tratamento δ-T3, a partir da concentração de 50 pM, tanto T24 e 5637 células. Além disso, δ-T3 surpreendentemente induziu o nível de expressão da proteína tirosina fosfatase SHP-1, que funciona como um regulador negativo para a activação da STAT3 (Fig 5B). translocação nuclear de STAT3 é essencial para a sua função como factor de transcrição. As fracções nucleares e citosol de lisado de proteína a partir das células tratadas δ-T3 foram separadas. Após o tratamento δ-T3, nível de proteína STAT3 em núcleos foi diminuída em células T24 (Figura 5C). Para confirmar ainda mais a redução de ocupação STAT3 nuclear em seus genes-alvo, foi realizado ensaio de chip, utilizando anticorpos contra STAT3. Como mostrado na Figura 5D, δ-T3 reduziu significativamente o recrutamento de STAT3 em seus sítios de ligação em

bclxl

lócus por 5.55 dobras (conjunto iniciador 1) e 5,93 dobras (conjunto iniciador 2), enquanto o controlo negativo conjunto de primers (NC) não mostraram qualquer diferença. Em conjunto com este resultado, a actividade de transcrição do promotor responsivo a STAT3 foi significativamente reprimido por tratamento δ-T3 num ensaio de repórter de luciferase (Figura 5E). Além disso, os resultados qRT-PCR revelou que três STAT3 genes alvo directo (

bcl2

,

bclxl

e

MCL1

) foram reprimidos em níveis de mRNA em ambas as linhas celulares de cancro da bexiga dois (Figura 5F), indicando que a redução é devido principalmente à regulação da transcrição. Para examinar se SHP-1 é essencial para a sobrevivência celular induzida activação STAT3, nós derrubado endógena SHP-1 por interferência de RNA (Fig 5G) e descobriu que seu esgotamento parcialmente revogada δ-T3 toxicidade induzida a células T24 (Fig 5H). Isso também confirmou que δ-T3 induzida inibição da proliferação de células de câncer de bexiga parcial através SHP-1 de indução. Tomados em conjunto, os nossos dados demonstram que o tratamento δ-T3 diminuiu o nível de fosforilação, juntamente com a translocação nuclear de proteína STAT3, resultando na redução da transcrição dos seus genes alvo a jusante em células cancerosas da bexiga humanos.

análise de transferência de Western os STAT3 /ETK relacionados com via de sinalização (a) e SHP-1 (B), os níveis de proteína em células T24 e 5637 sob o tratamento δ-T3 para 24 h. bandas de Western foram quantificados por um software Image J. e os dígitos mostrados abaixo do painel superior eram os níveis de expressão relativos normalizados STAT3 por controlos de carga. (C) redução do nível de proteína STAT3 nuclear após o tratamento de 150 um δ-T3 em células T24. LaminB1 foi utilizado como um controlo de carga nuclear. Tubulina foi utilizada como um controlo de carga citoplasmática. (D) a estrutura do genoma do

bclxl

gene foi mostrado, com os rótulos dos três conjuntos de iniciadores para o ensaio ChIP. O conjunto iniciador 1 e 2 contêm elemento de ligação STAT3; enquanto conjunto de primers 3 (NC) serve como controle negativo. ocupação STAT3 no

bclxl

promotor no cancro da bexiga linha de células T24 tratadas com 150? M δ-T3 ou veículo durante 18 h foram analisadas por ensaio ChIP. DNA entrada e imunoprecipitadas DNA foram analisadas por qPCR análises utilizando conjuntos de iniciadores descritos acima e normalizada por controle IgG. A barra de erro indica as médias ± SD. ***,

P

0,001. (E) o tratamento δ-T3 reduziu os genes alvo a jusante STAT3 (

bcl2

,

bclxl

e

MCL-1 |) expressão a nível mRNA. (F) Análise de actividade da luciferase da STAT3-Luc mediante o tratamento de 150 um δ-T3 em células T24 durante 24 h. TK-Renilla plasmídeo de luciferase foi usado como controlo interno. (L) a eficiência knockdown de SHP-1 em células T24 por ensaio de transferência de Western. p-actina foi utilizada como controlo interno. SINC, siRNA de controlo negativo. siSHP-1, siRNA alvejando a SHP-1. células T24 (H) foram tratadas com ARNsi de SHP-1 ou sinc, seguido por tratamento com δ-T3 ou veículo. A viabilidade celular foi testada por ensaio MTT. **,

P Art 0,01; ***,

P Art 0,001.

Baixa concentração de δ-T3 potenciou o efeito apoptótica de gemcitabina em células de câncer de bexiga T24

A gemcitabina é a quimioterapia de primeira linha para cancros da bexiga [25,26]. Por isso, nós examinamos se a baixa concentração de δ-T3 pode aumentar a sensibilidade de células cancerosas da bexiga a gemcitabina. ensaio MTT mostraram que o tratamento de 25 uM δ-T3 aumentou o efeito citotóxico de gemcitabina em T24, 5637, J82 e UMUC-3 linhas de células (Fig 6A e S2 FIG). A citometria de fluxo de dados por anexina V /PI costaining revelou que o tratamento combinado aumentou o efeito apoptótico, comparativamente com o tratamento gemcitabina sozinha. A taxa de apoptose aumentou de 34,6% e 19,28% nas células tratadas com gemcitabina a 53,3% e de 28,4% no T24 tratadas combinadas e 5637 células, respectivamente (Fig 6B). ensaio de formação de colónia também mostrou que o tratamento de gemcitabina mais δ-T3 suprimiu significativamente a capacidade de formação de colónias de células cancerosas T24 (Fig 6c). Como mostrado na Fig 6D, o co-tratamento com concentrações baixas de δ-T3 e gemcitabina notavelmente Bax induzida e reprimida Bcl-xL e Bcl-2, acompanhada pela presença de clivagem de PARP. Consistentemente, nós também descobrimos que o co-tratamento de redução do nível de fosforilação de ETK, induzida SHP-1 e expressão inibida a sua activação da STAT3 a jusante (Figura 6E).

(A) T24 e 5637 células foram incubadas durante 48 h em a presença de 25 uM δ-T3 e /ou 0,08 uM GEM. Então, a percentagem de viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT. (B) e 5637 T24 células foram cultivadas durante 48 h na ausência ou na presença de 25 uM δ-T3 e /ou 0,08 uM gema, respectivamente. taxas apoptóticos foram analisados ​​por ensaio de coloração de anexina V /PI. (C) O tratamento combinado com GEM (0,08 uM) e δ-T3 (25 uM) durante 14 dias, eliminou completamente a capacidade de formação de colónias de células T24. (D) Análise Western blot da STAT3 e sinalização relacionados com os níveis de proteína em células T24, tratados com δ-T3 e /ou GEM para 48 h relacionadas apoptose. (E) Análise de transferência de Western dos níveis de proteínas relacionadas com a sinalização STAT3 em células T24, tratados com δ-T3 e /ou a gema durante 24 h. **,

P Art 0,01; ***,

P Art 0,001.

Discussão

Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório sobre o efeito citotóxico da δ-T3 em células de câncer de bexiga humanos. Em comparação com outros isómeros de vitamina E, os nossos resultados mostraram que tanto δ- e γ-T3 são inibidores potentes de proliferação de células de cancro da bexiga. Em contraste, α-T3 e α-TP não tem efeitos anti-câncer contra células de câncer de bexiga sob as mesmas configurações experimentais. Embora ambos δ- e γ-T3 têm citotoxicidade significativa contra células de cancro da bexiga, δ-T3 parece ser mais potente do que a y-T3, o que sugere que é mais bioactivo. Isto é consistente com as observações quando δ-T3 é utilizada nos tratamentos de outros cancros, incluindo o cancro do pâncreas e pulmão [13,15,27]. Além disso, em comparação com y-T3, que é menos conhecido sobre os efeitos anti-câncer de δ-T3. Portanto, seria interessante examinar se δ-T3 pode potencialmente ser usado como uma das principais vitaminas para quimioprevenção e tratamento do cancro da bexiga.

Neste relatório, nós ainda demonstrado que δ-T3 inibiu a sinalização STAT3 via, que desempenha um papel crítico na proliferação de células cancerosas e sobrevivência. É relatado que STAT3 são frequentemente ativada em vários tipos de cancro, incluindo o cancro da bexiga. Usando o nível de fosforilação da STAT3 em Y705 como um marcador substituto, Lin e colegas descobriram que STAT3 é superativada em 19% tecidos de câncer de bexiga humana (

n

= 100) [28]. Weissmann e colegas descobriram que pSTAT3 é elevada na população de células estaminais do cancro em amostras de UBC, sugerindo que a activação da STAT3 desempenha um papel na manutenção de células de cancro stemness [29]. De acordo com estes, a expressão transgénica de STAT3 em células basais do epitélio da bexiga do rato acelerou a progressão do carcinoma

in situ

ao câncer de bexiga invasivo em tratamento de nitrosaminas cancerígenas, em comparação com camundongos selvagens sob o mesmo tratamento [22 ]. De nota, interrupção da STAT3 via de sinalização por um ou outro STAT3 knockdown ou sobre-expressão de forma negativa dominante da STAT3 induz a paragem do crescimento celular e apoptose [30], indicando que a segmentação de sinalização STAT3 é uma abordagem terapêutica promissora para pacientes com cancro da bexiga.

A ativação do STAT3 é regulada por cinases a montante e phosphotases. ETK, também conhecido como BMX, é um membro da família Tec de não-receptor de tirosina quinase. Ele contém vários domínios críticos incluindo a homologia Plekstrin (PH), a homologia Tec (TH), a homologia de Src SH3, SH2 e o domínio quinase SH1. expressão elevada de ETK tem sido detectada em doentes com hiperplasia da pele e o cancro da próstata [31,32]. Recentemente, foi sugerido ETK para ser utilizada como um biomarcador para prever a taxa de sobrevivência de pacientes com cancro da bexiga cistectomia em [24]. Sua função oncogénica tem sido relacionado com a sua interacção com e ativação da STAT3 [24,33]. Como sobre-expressos em células-tronco glioblastoma (GSCS), ETK ativa STAT3 para manter a auto-renovação e potencial tumorigénico de GSCS [34]. Além disso, de knockdown ETK suprime a activação da STAT3 em linhas celulares de cancro da bexiga T24 e duas UM-UC-3 [24], indicando que as funções ETK a montante da STAT3 em células cancerosas da bexiga.

Além disso, SHP- 1 é uma PTP não transmembranar que funciona como um regulador negativo da via STAT3 [35]. Como um supressor de tumor, o promotor de SHP-1 é frequentemente hipermetilado em células de leucemia e linfoma [36]. O primeiro relatado que δ-T3 induz SHP-1 de um modo dependente da dose em células cancerosas da bexiga. Desde γ-T3 também induzir a expressão SHP-1 para inibir a sinalização da STAT3 no mieloma e células de carcinoma hepatocelular [36,37], ambos γ- e δ-T3 pode funcionar de forma semelhante para inibir a sinalização de STAT3 por indução de SHP-1 expressão. Consistente com a repressão da STAT3 via, que são altamente relevantes para bexiga carcinogênese [22], a supressão da STAT3 foi confirmado pela redução de seus alvos a jusante, tais como Bcl-2, Bcl-x

L e Mcl- 1, em ambos os níveis de proteína mRNA e. Fraccionamento celular com transferência de Western e ensaio de luciferase utilizando o plasmídeo STAT3-Luc confirmou que δ-T3 afecta a activação da STAT3 através da inibição da sua translocalização nuclear para induzir os seus genes-alvo. Estes dados fundamentados ainda mais a inibição da via de sinalização de STAT3 por δ-T3.

A gemcitabina é utilizada fármaco quimioterapêutico para o tratamento de cancro da bexiga. Descobrimos que a baixa dose de apoptose induzida por gemcitabina δ-T3 reforçada. Quando comparado com o tratamento gemcitabina sozinha, o co-tratamento utilizando δ-T3 e gemcitabina notavelmente suprimida a activação de ETK, STAT3 e indução de SHP-1. Isto apoia a noção de que a ô-T3 potencia gemcitabina apoptose mediada pela indução das células em população SubG1 seguido por clivagem de PARP. Consistentemente, Kanai

et al, achou que a vitamina E succinato de apoptose de células de câncer de bexiga induzido e reforçado chemosenstivity ao paclitaxel [38].