Abstract

interação estroma-epitelial foi mostrado para promover o crescimento tumoral local e metástases à distância. Procurou-se criar uma abordagem de terapia genética promissora que o câncer de co-alvos e os seus comprovativos células estromais para combater tumores de próstata resistente à castração. Aqui, demonstramos que osteonectina humano é sobre-expresso no epitélio da próstata e cancro do estroma do tumor, em comparação com a sua contrapartida normal. Nós projetamos um romance promotor osteonectina humana (HON-522E) contendo elementos reguladores da transcrição positivos identificados tanto o promotor e exão 1 região do gene osteonectina humano.

In vitro

ensaios repórter revelou que o promotor Hon-522E é altamente ativo em células de câncer de próstata e do estroma ósseo negativos e metastáticos receptores de andrógenos em comparação com células cancerosas da próstata receptor-positivo de andrógenos. Além disso,

In vivo

prostático-tumoral promover a actividade do promotor Hon-522E foi confirmada por administração intravenosa de um vector adenoviral contendo o gene Hon-522E conduzido pelo promotor de luciferase (Ad-522E-Luc) em ratinhos portadores de xenoenxertos de tumores da próstata humanos ortotópicos. Além disso, um vector adenoviral com a-522E-driven-promotor hON herpes gene da cinase vírus simplex timidina (Ad-522E-TK) foi altamente eficaz contra o crescimento da linha celular PC3M cancro da próstata humana e do estroma ósseo andrógeno-independente

tumores PC3M in vitro

e na pré-estabelecidos

in vivo

após a adição do ganciclovir pró-fármaco. Devido à heterogeneidade dos tumores da próstata humanos, terapia génica mediada por promotor Hon-522E tem o potencial para o tratamento de refractário a hormonas e cancros da próstata metastático do osso

citação:. Sung SY, Chang JL, Chen KC, Yeh SD, Liu YR, Su YH, et ai. (2016) Co-Targeting Prostate Cancer epitélio e osso Stroma by Suicide Humano Osteonectina-Promoter-Mediated Gene Therapy Efetivamente inibe o crescimento do cancro da próstata andrógeno-independente. PLoS ONE 11 (4): e0153350. doi: 10.1371 /journal.pone.0153350

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ÁUSTRIA

Recebido: 03 de fevereiro de 2016; Aceito: 28 de março de 2016; Publicação: 07 de abril de 2016

Direitos de autor: © 2016 Sung et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: Este trabalho foi apoiado em parte por Grant MAIS 103-2320-B-038-040-MY3 (CLH) e 103-2320-B-038. -039-MY3 (SYS) do Ministério da Ciência e Tecnologia, MOHW105-TDU-B-212-134001 (SYS) do Ministério da Saúde e Bem-Estar, e TMUTOP103003-6 (CLH), TMUTOP103003-3 (SYS) e 104TMU-SHH-01-3 (YHS) da Universidade médica de Taipei, Taiwan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é a segunda principal causa de mortes relacionadas com o cancro, tanto na Europa e nos Estados Unidos [1]. terapia de privação de androgénio (ADT) é considerado um tratamento fundamental como monoterapia ou em combinação com outros esquemas. A maioria dos pacientes inicialmente responder a ADT; No entanto, a natureza intrínseca da heterogeneidade das células de tumor resulta na resistência ao tratamento e a progressão para doença altamente mórbida denominado cancro da próstata resistente à castração (CRPC) dentro de 18-24 meses [2]. CRPC em fase terminal é comumente associado a metástases ósseas, o que provoca mortalidade e morbidade significativa com o desenvolvimento de complicações ósseas graves em pacientes afetados. abordagens clínicos recentes que utilizam agentes que têm como alvo diferentes mecanismos de acção, incluindo quimioterapia de ligação à tubulina (cabazitaxel); imunoterapia (sipuleucel-T); inibição CYP-17 (abiraterona); receptor de andrógeno (AR) bloqueio (enzalutamida); e terapia de radioisótopos (rádio-223), embora tenham mostrado resultados promissores em atrasar complicações ósseas e também melhorar a sobrevida global [3], o tratamento de pacientes com CRPC metastático continua sendo um desafio, com um tempo médio de sobrevivência de menos de 19 meses [4] . Assim, o desenvolvimento de novos agentes com actividade anti-tumoral mais eficaz é crucial para o tratamento de CRPC metastático. Em particular, são necessários fármacos que as células de cancro da próstata refractário a hormonas alvo independentemente de um estado de diferenciação, com vários níveis de receptor de androgénio (AR) e antigénio (PSA) expressão específico da próstata.

Após estudos genéticos e moleculares realizados que as células tumorais são heterogéneas e as suas metástases subsequentes são os resultados dos processos selectivos não aleatórios, e de várias etapas sequenciais entre populações de células preexistentes. No entanto, estudos recentes têm evidenciado a comunicação intercelular intrincada entre as células epiteliais do estroma e câncer levando a alterações genéticas e comportamentais permanentes não só nas células epiteliais, mas também em células estromais associadas a cancro que impulsiona as mudanças de expressão ainda mais genéticos e genes em células cancerosas da próstata [ ,,,0],5, 6]. Através de uma série de, íntimos comunicações bidirecionais complexas entre câncer de próstata e do estroma de acolhimento, as células cancerosas ganhar vantagens crescimento e sobrevivência adicionais e, finalmente, disseminar para órgãos distantes, com efeito letal [7-9]. Assim, co-alvo tanto do tumor e suas células estromais de apoio podem melhorar as respostas terapêuticas e sobrevida global dos pacientes com câncer de próstata [10-13]. Dado que a terapia de genes tem sido identificado como o tratamento preferido para cancros metastáticos [14], o desenvolvimento de uma estratégia eficaz para a entrega e expressão de genes terapêuticos no epitélio e estroma tumoral adjacente é essencial para fazer um tal tratamento disponível.

Osteonectina (também conhecido como membrana basal-40 [BM-40] e proteína segregada ácida rica em cisteína [SPARC]) está amplamente distribuída em vários tecidos durante o desenvolvimento e lesão celular [15] e desempenha um papel importante na regulação da adesão celular, proliferação, migração e tecido remodelação [16]. No microambiente do osso, osteonectina é a proteína de matriz não-colagem mais abundante que é altamente expressa no início da diferenciação dos osteoblastos e é crítica para a manutenção da massa óssea [17]. O papel de osteonectina no cancro da próstata tem sido identificada como um quimioatractor para células de cancro da próstata invasivo ósseas [18-20]. Elevados níveis de expressão osteonectina têm sido observados em linhas de células de cancro da próstata derivadas de metástases do cancro da próstata e em focos metastáticos [21]. Além disso, os níveis de osteonectina elevados em cancro da próstata primário estava associada com o desenvolvimento subsequente de metástases [22], indicando que a metástase de células de cancro da próstata ao osso é mediada em parte pela promoção mediada por osteonectina de migração de células de cancro, a actividade de protease, e invasão. Porque a expressão osteonectina ocorre tanto em células epiteliais de tumor e células do osso, o promotor osteonectina poderia ser usado para accionar um gene terapêutico co-alvo o cancro da próstata metastático ósseo e seu microambiente de suporte, independentemente do nível basal de expressão do AR e PSA.

neste estudo, buscou-se criar um agente terapêutico mediada pelo promotor que co-alvos câncer de próstata e suas células estromais circundantes. Descobrimos que osteonectina foi regulada em células epiteliais de cancro da próstata e células estromais associadas a cancro em comparação com os seus homólogos normais. Nós projetamos um romance promotor hON (HON-522E) contendo elementos reguladores da transcrição positivos identificados tanto o promotor e exão 1 região do gene Exmo. Nós também construído um vector adenoviral de replicação defeituosa tendo um vírus herpes simplex timidina cinase do gene (HSV-TK) conduzida por um promotor de 580 pb hON altamente activa (HON-522E). O tratamento com esta construção, Ad-522E-TK, em combinação com o ganciclovir pró-fármaco (GCV) foi encontrada pela primeira vez para matar o câncer de próstata e células do estroma ósseo linhas independentes de andrógenos

in vitro

e inibir o crescimento do tumor da próstata, num modelo de xenoenxerto. Devido à heterogeneidade dos tumores da próstata humanos, Ad-522E-TK pode ser aplicado como uma terapia adjunta com outras modalidades de AR-alvo para o tratamento de refractário a hormonas e cancros da próstata metastático do osso.

Materiais e Métodos

linhas de células e cultura de células

As linhas celulares de cancro da próstata humano LNCaP, C4-2, C4-2B, PC3, DU145 e PC3M, e uma linha celular de osteosarcoma humano MG63 que foram utilizados na nossa anterior estudos [6, 23, 24] foram mantidas em meio T e suplementado com soro de vitelo fetal a 5% (FBS). hFOB 1,19 osteoblastos humanos e linhas de células de estroma da medula óssea humana HS27A foram adquiridos a partir de ATCC (Manassas, VA, EUA) e mantida em uma mistura 1: 1 de meio F12 de Ham /modificação e meio RPMI 1640 meio de Eagle da Dulbecco, respectivamente, com 10% FBS. A linha de células de empacotamento de adenovírus 293 (Microbix Biosystems Inc., Toronto, Ontario, Canadá) foi mantida em meio mínimo de Eagle e suplementado com 10% de FBS e glutamina 2 mM (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Todos os meios de cultura de células e reagentes foram adquiridos a partir de Invitrogen. Todas as células foram cultivadas em um 37 ° C incubadora com 5% de CO

2 e foram passadas ao atingir 90% de confluência.

sujeito humano e microdissecção de captura Laser (LCM)

As experiências com amostras humanas foram revistos e aprovados pelo Institutional Review Board (IRB) em Taipei Medical University (TMU-JIRB 20.131.253). Um microarray tecido da próstata (TMA) contendo 49 núcleos de tecido, representando amostras de 40 casos de cancro da próstata e 9 tecidos normais adjacentes emparelhados foi obtido a partir Super Bio chips (CA4, Seoul, Coreia do Sul). amostras de tecido da próstata humana congelados foram obtidos a partir do Biobank Joint TMU com base na Universidade de Medicina de Taipei e filiados hospitais de indivíduos com consentimento informado por escrito. LCM foi usada para isolar populações selectivamente puras de células de cancro da próstata e células epiteliais não-neoplásticas, bem como do estroma adjacentes para Gleason de grau 3 e grau 4 glândulas e estroma adjacente às glândulas não-malignas de secções congeladas de amostras de prostatectomia derivados de quatro pacientes . Resumidamente, secções de oito micra de espessura de tecido congelado foram coradas utilizando o estojo de Arcturus HistoGene congelada secção de coloração de acordo com as instruções do fabricante. Áreas de populações de células seleccionadas foram microdissectados das seções e recolhidos utilizando o sistema ArcturusXT e CapSure HS LCM Caps. As configurações de laser foram os seguintes: diâmetro do ponto fixado em 30 mm, a potência de 70 mW, e duração do pulso de 25 milissegundos. O ARN total de cada amostra microdissecados foi extraído utilizando o kit de isolamento de RNA PicoPure seguindo o protocolo do fabricante. LCM instrumento e todos os reagentes utilizados na experiência foram obtidos a partir de Thermo Fisher Scientific Inc. (Madison, WI, EUA).

em tempo real de RT-PCR

O ARN total foi extraído a partir de células usando Pure Kit da alta Isolamento de ARN (Roche, Indianapolis, IN, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A primeira cadeia de ADN cortesia foi sintetizado utilizando iniciadores aleatórios e Moloney vírus da leucemia murina de transcriptase (Invitrogen) inverter e submetido a PCR em tempo real utilizando o LightCycler 480 com o kit principal Luz Cycler TaqMan combinada com a sonda universal ProbeLibrary (Roche) de acordo com a instruções do fabricante. genes-alvo foram amplificadas com primers específicos para hON (forward: 5′-GTGCAGAGGAAACCGAAGAG-3 ‘e inverter: 5′-TGTTTGCAGTGGTGGTTCTG-3’., sonda não 77), e gene housekeeping, HSPCB (forward: 5’AGCCTACGTTGCTCACTATTACG-3 ‘e reverso: 5′-GAAAGGCAAAAGTCTCCACCT-3’, a sonda não 55).. A expressão do gene relativo de osteonectina nas linhas de células é representada como 2

-ΔCT, com ΔCT determinado subtraindo o ciclo médio gene de manutenção HSPCB limiar a partir do valor médio do gene alvo.

construção do plasmídeo

Todas as construções de promotor foram gerados utilizando o sistema de clonagem TOPO TA (Invitrogen) e subsequentemente digerido utilizando locais de restrição adequados no poliligante para permitir a inserção no vector pGL3-basic (Promega, Madison, WI, EUA) contendo a região de codificação de o gene da luciferase do pirilampo. Todas as construções de promotor tinham a mesma extremidade 5 ‘. O espaçador entre as GGA-caixas 1 e 2 foram excluídos por PCR recombinante utilizando os seguintes conjuntos de iniciadores: 522-N: (5’ACTAGTAGCAGCTTGTCTTGTC3 ‘), spdel-C: (5’CTTCTCCCCTGTCTCTGTCTT3’), e spdel-N: (5 ‘AAGACAGAGACAGGGGAGAAG3 “) combinado com os iniciadores a jusante: Intron-C: (5’TACCTCAGTGGCAGGCAGGCAG3’), Exon-C: (5’CAGGCAGGCAGGCGGCAG ‘), e Hafner-C: (5’GCGCGCTCTCCGGGCAGTCTG3’) para a construção de hon-522I, Hon- 522E, e hon-522H, respectivamente. O ADN genómico foi isolado a partir de células DU145 para o molde. Todas as construções incluindo fragmentos de DNA gerados por PCR foram confirmados por sequenciação.

As células de transfecção de ADN e Luciferase Assay

foram co-transfectados com várias osteonectina promotor de luciferase plasmídeos repórter e pCMV-βgal (galactosidase) em um 5 : 1 proporção molar utilizando o reagente de transfeco Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Após 48 h de incubação, foram preparados extractos de células para as avaliações de actividade de luciferase e β-gal utilizando o Sistema de Ensaio de Luciferase e β-galactosidase Enzyme Assay System (Promega), respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante. a actividade de luciferase relativa foi calculada como as unidades relativas de luciferase do pirilampo de luz (RLU) divididas pelo valor correspondente para a actividade β-gal presente em cada amostra. Três experimentos independentes foram realizadas em triplicado.

Projeto de vetores adenovirais

Os vetores adenovirais Ad-522E-TK e Ad-522E-Luc (tipo 5) foram projetados e de acordo com a produção em massa do protocolo estabelecido [25]. Resumidamente, os plasmídeos p522E-TK e p522E-Luc que contém um gene promotor e o vírus herpes simplex do gene TK e luciferase Hon-522E, respectivamente, foram construídos através da inserção da cassete de expressão no E1A região suprimida do vector adenoviral de transporte Ad5 pΔ E1sp1B. Um adenovírus recombinante TK-Ad522E replicação defeituosa foi gerado nas células 293 por co-transfecção destas células com ambos o plasmídeo de vaivém de expressão e um plasmídeo circular genoma do Ad (pJM17) usando o método de precipitação com fosfato de cálcio padrão [26]; Ad-CMV-TK e Ad-CMV-Luc foram construídos de forma semelhante.

Timidina atividade da quinase de ensaio

atividade TK em Ad-522E-TK e Ad-CMV-TK-infectados linhas celulares foi ensaiada através da fosforilação de [

3H] GCV [27]. Resumidamente, a fracção sobrenadante de extractos celulares brutos foram misturados com um volume igual de tampão de ensaio de TK contendo 0,2 uCi de [

3H] GCV (Moravek Biochemicals, CA, EUA), MgCl 3 mM de

2, ATP 3 mM, 10 mg /mL de albumina de soro bovino e tampão de fosfato de sódio 50 mM (pH 6,5). A mistura de reacção foi incubada a 37 ° C durante 90 min, transferidas para discos de DE-81 (Whatman, Hillsboro, OR, EUA), seco ao ar, e lavou-se cuidadosamente com 50% de etanol. Fosforilada [

3H] GCV ligados aos discos foi determinada com um contador de cintilação (Beckman Coulter, Inc., Schaumburg, IL, EUA). Três experiências independentes foram realizados em triplicado.

In vitro

ensaios de citotoxicidade

As células foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 2 × 10

4 células por poço. Após 24 h, as células foram infectadas com Ad-TK-522E na gama de 0-100 multiplicidade de infecção (MOI). Depois de uma 2 horas de adsorção, o meio contendo o vírus foi substituído com meio fresco. Após 24 h, as células foram incubadas na presença ou ausência de 10 ug /mL de GCV, durante 5 dias, seguido por uma coloração de violeta de cristal; Subsequentemente, o número relativo de células foi avaliada a uma densidade óptica (OD) de 590 nm após a coloração. Cada experimento foi realizado em triplicado.

estudo animal

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo e cumpridos os regulamentos do Comité Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Medicina de Taipei (LAC 2.013-0.047). ratos atímicos camundongos machos de seis semanas de idade BALB /cAnN.Cg-Foxn1nu /CrlNarl foram obtidos a partir do animal Centro Nacional Laboratory (Taipei, Taiwan). Os animais foram mantidos em condições normais isentos de agentes patogénicos e tratados de acordo com os critérios descritos na Academia Nacional de Ciências Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Para a análise da actividade promotora Hon-522E

In vivo

, 1 × 10

5 PC3M células em 10 ul de PBS foram injectadas as próstatas ventrais de ratinhos. Ao fim de 5 dias após a injecção das células tumorais, que possui o tumor ou ratinhos não tratados receberam administração intravenosa de 1 × 10

9 pfu Ad-522E-Luc ou Ad-CMV-Luc através da veia da cauda (n = 5). órgãos do rato e xenoenxertos de tumor da próstata foram colhidas para o ensaio de actividade de luciferase de 2 dias após a injecção virai. Para a avaliação do Ad-TK-522E combinada com a inibição induzida por GCV de crescimento tumoral

In vivo

, 5 × 10

5 PC3M células em 50 ul de PBS foram injectados por via subcutânea nos flancos dos ratos. Quando o tumor se tornou palpável (3-4 mm de diâmetro), os animais foram divididos aleatoriamente em 4 grupos experimentais (n = 8 para cada grupo): Grupo 1, o tratamento com PBS; grupo 2, apenas a GCV; grupo 3, Ad-522E-TK combinado com PBS; e grupo 4, Ad-522E-TK combinado com GCV. Ad-TK-522E (50 mL; 2 x 10

9 pfu) em PBS foi administrada através de injecção intra-tumoral em dias alternados durante 3 vezes. GCV (100 mL) foi administrado diariamente através de injecção intraperitoneal com uma dose de 40 mg /kg de peso corporal, durante 2 semanas. As medições do tumor bidimensionais foram realizadas duas vezes por semana com compassos de calibre, e o volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula simplificada para um elipsóide de rotação (L x W

2 × 0,5236). Os animais foram sacrificados 5 semanas após a terapia usando CO

2 para a eutanásia, e os tumores foram animado para exame histopatológico.

imuno-histoquímica (IHQ)

IHC coloração foi realizada utilizando o Sistema de Detecção de Polymer Novolink (Leica Microsystems, Newcastle Upon Tyne, Reino Unido), como descrito anteriormente [28]. proteína Ki-67 foi detectada em xenoenxertos de tumor anti-humano com o anticorpo de rato monoclonal Ki-67 (1: 100; NCL-Ki67-MM1, Leica Biosystems). A apoptose foi avaliada usando o Apo-BrdU-IHC in situ de fragmentação de DNA Assay Kit (BioVision, Inc., Milpitas, CA, EUA) como descrito [28]. coloração IHC para osteonectina foi realizada em TMA da próstata, utilizando um anticorpo monoclonal anti-humano-osteonectina (01:50; NCL-O-Nectin, Leica Biosystems). Cada ponto TMA foi analisada por um patologista (J.L.C.) utilizando um sistema de pontuação Allred [29]. O valor numérico para a intensidade total (pontuação intensidade) baseia-se num sistema de 4 pontos: 0, 1, 2, e 3 (para nenhuma, leve, médio, ou coloração escura). O valor numérico para cento manchado (pontuação proporção) é determinada por uma divisão geométrica; nenhuma mancha = 0; células ≤1 /100 coradas = 1; ≤1 /10 células marcadas = 2; ≤1 /3 células coradas = 3, ≤ 2/3 células coradas = 4; todas as células manchadas = 5. Adição dos dois valores dá marcar o Allred total de [30].

A análise estatística

Todos os dados são apresentados como a média (desvio padrão [SD]), a menos que de outra forma Especificadas. A análise foi realizada utilizando o teste t de Student bilateral. P 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

A expressão de osteonectina em células de câncer de próstata e estromais

A associação de expressão osteonectina com a progressão do cancro humano foi inicialmente avaliada através de real-time RT -PCR na LNCaP andrógeno-sensível e linhas celulares de cancro da próstata PC3 andrógeno-insensitive. Na série de linhas de células LNCaP de linhagem, a expressão de osteonectina correlacionada com o aumento potencial metastático do osso, em que o refractário a hormonas e C4-2B metastática óssea expressa um nível mais elevado de osteonectina do que a sua parental LNCaP dependente de androgénios e independentes de androgénios C4 células -2. Da mesma forma, PC3M, o derivado altamente metastático expressaram níveis mais elevados de 18 vezes em comparação com os seus osteonectina células PC3 parentais que foi originalmente derivadas de metástases ósseas do cancro da próstata (Figura 1A). Estes resultados apontam para uma correlação entre a expressão osteonectina elevada e progressão CRPC metastático. Como próstata metástase óssea do cancro é considerado uma doença impulsionado-microambiente, os níveis mais elevados de osteonectina expressos pelas células do estroma óssea humana do que a de células de cancro da próstata foi observada usando hFOB de osteoblastos e de medula óssea derivadas de linhas celulares de fibroblastos HS27A (Fig 1A). Para avaliar a expressão diferencial de osteonectina entre as células epiteliais da próstata não-cancerosas e cancerosas, assim como as células normais e associados ao cancro do estroma em mesmos indivíduos, LCM dissecados a partir de amostras foram usadas tumores da próstata primários. Entre os pares de tecidos normais e malignas da próstata, amostras dos três de quatro pacientes apresentaram um aumento significativo da expressão de osteonectina em células cancerosas e as células cancerosas do estroma adjacentes em comparação com a sua contrapartida normal; e o outro mostrou um padrão de expressão diminuída em tecidos de tumor (Figura 1B).

A análise quantitativa por RT-PCR da expressão de ARNm osteonectina em (A) uma série de cancro da próstata humana e do estroma ósseo (hFOB e HS27A) linhas celulares e células em (B) epiteliais da próstata isolado-LCM e estromais de pares correspondentes de tumor primário da próstata (T) e de próstata normal (N) de tecidos derivados de 4 pacientes (Pt de 1 ~ 4). A expressão do gene relativo de osteonectina foi representada como 2

-ΔCT, com ΔCT determinado subtraindo o ciclo médio gene de manutenção HSPCB limiar a partir do valor médio do gene alvo. Os dados são representativos de 3 experiências independentes e apresentados como média ± DP. * P 0,05, ** p 0,001 versus células normais. (C) Gráfico de dispersão dos IHC pontuação coloração para osteonectina no epitélio da próstata e estroma nas seções de microarray humano tecido da próstata contendo tumor de próstata primário (n = 40) e as amostras de próstata normais (n = 9). Imagens representativas de IHC coloração de osteonectina no tumor de próstata emparelhados e tecidos normais da próstata de dois pacientes individuais com uma ampliação de 40 × e 100 × foi mostrado à direita. A seta e ponta de seta indicam coloração positiva nas células estromais e epiteliais, respectivamente.

Para validar ainda mais a associação entre a superexpressão de osteonectina e carcinogênese de próstata em amostras clínicas, imuno-histoquímica análise (IHC) foi realizada em uma micromatriz de tecido da próstata contendo 40 tumores da próstata primários e 9 amostras de próstata normais correspondentes. Em cada núcleo, imunorreatividade para osteonectina foram medidos em seções contendo estroma normal, epitélio normal, estroma tumoral, e no epitélio tumor. Embora estas diferenças não foram estatisticamente significativa (P = 0,2654 e 0,4042), as fileiras da pontuação total Allred nas amostras globais de epitélio do tumor e estroma tumoral foi maior em relação ao epitélio normal e estroma normal, respectivamente (Fig 1C). A diferença foi mais significativa quando os pares Apenas correspondentes de amostras de tumor da próstata e pela próstata normal foi analisada (P = 0,085 e 0,2165 para a coloração epitelial e estromal coloração, respectivamente). A falta de significância estatística pode ser devido ao pequeno tamanho da amostra. Além disso, a forte coloração de osteonectina pode ser detectada na amostra de metástases ósseas do cancro da próstata (S1 FIG). A direcção do efeito sugere as acções autócrinos e parácrinos de osteonectina pelo tumor e microambiente tumoral causar a transformação maligna e metástases de cancro da próstata.

Identificação de elementos reguladores da transcrição adicionais na região promotora osteonectina humano

A GGA-box 1 na região promotora do osteonectina humana (hON) é vital para a atividade transcricional máxima, enquanto o espaçador rico em pirimidina entre GGA-caixas 1 e 2 exerce um efeito regulatórias negativas [31]. Comparação do bovino, murganho, e sequências de ADN osteonectina exão 1 humanos revelou uma repetição múltipla notável do CCTG sequência em todas as espécies, com um conjunto consistente de 7-8 bases a montante do início do exão 1 [32]. Estudámos, portanto, 2 construções Hon-promotor-repórter, p522E-Luc e p522H-Luc, para investigar o papel da sequência CCTG em função do promotor Exmo. O fragmento do promotor em p522H-Luc é idêntica à do pGL2-spdel, que tem potencial actividade de transcrição em linhas de células humanas [31]. p522E-Luc tem uma região 5 ‘do promotor hON sequências similares ao do p522H-Luc, mas a extremidade 3’ estende-se a + 62 pb, em que 4 unidades CCTG estão incluídos (Fig 2A). A transfecção destas construções e PGL-3-TATÁ (que serve como uma referência de actividade de promotor) em linhas celulares de estroma ósseo, incluindo humanos hFOB, HS27A, e osteossarcoma MG63 mostraram um aumento acentuado na actividade da luciferase por p522E-Luc em comparação com p522H- Luc (Figura 2B). Além disso «extensão 3 ‘do promotor em 73 pb localizada na região do intrão 1 (p522I-Luc) resultou numa diminuição da actividade da luciferase, demonstrando claramente que a região entre 39 pb e 62 pb, é responsável pela regulação positiva adicional de promotor hON atividade em células ósseas humanas, enquanto que a região entre pb +63 pb e 73 contém um elemento regulador negativo.

(a) esquema de várias construções de luciferase osteonectina-promotor-driven. Todas as sequências são numerados relativamente a 1 (o local de iniciação da transcrição). A sequência parcial do promotor osteonectina a partir de bases 40-62 contendo 4 motivos CCGT (sublinhado). Uma construção modificada pGL3 (pGL3-TATA) com uma caixa de TATA artificial inserido a montante do gene repórter de luciferase foi usado como um controlo da actividade do promotor de nível basal. (B, C) Comparação da atividade repórter luciferase de construções de Hon-promotor em linhas de células do estroma ósseo humanos e linhas celulares de cancro da próstata humana por

in vitro

transfecção, e em (D) órgãos do rato por

em

entrega de genes in vivo. (B, C) A actividade de luciferase relativa de várias construções foi dividida pela actividade normalizada do vector vazio (pGL3-TATA) e expressa como vezes de alteração ao longo do controlo. * P ≤ 0,05 vs. p522H-Luc. (D) As actividades de luciferase (em unidades relativas de luz [RLU] por miligrama de proteína) foram determinados nos órgãos representativos 2 dias após a injeção intravenosa de 1 × 10

9 pfu de Ad-522E-TK ou Ad-CMV-TK em ratinhos adultos (n = 5).

seguinte avaliou a actividade de transcrição do promotor de hon-522E em várias linhas celulares de cancro da próstata que reflectem diferentes fases da progressão do cancro da próstata. Os dados mostraram que a transfecção actividade do promotor Hon-522E foi detectado em todas as linhas celulares testadas. No entanto, a comparação da actividade da luciferase de estas linhas celulares de cancro da próstata transfectadas e aqueles com endógena expressão de ARN osteonectina (Fig 1A) revelou que a actividade do promotor Hon-522E é relativamente mais elevada em AR-negativa, mais agressiva, e linhas de células metastáticas, incluindo DU145 , células PC3 e PC3M, em comparação com células LNCaP, C4-2 e C4-2B linhas celulares que expressam AR (Fig 2C).

para avaliar a utilidade potencial do promotor hon-522E em expressar um transgene numa modo específico do tecido

in vivo

, um vector adenoviral contendo o promotor hon-522E ou o citomegalovírus ubíqua (CMV) conduzindo o gene repórter da luciferase (Ad-522E-Luc ou Ad-CMV-Luc) foi administrado por via intravenosa a ratinhos atímicos macho quer tumores PC3M ortotópicos saudáveis ​​ou que transportem. Após 2 dias de administração virai, principais órgãos, incluindo o fígado, pulmão, rins, baço, intestino, coração, cérebro, cólon, testículos, próstata e músculos, e xenoenxertos de tumor PC3M foram colhidas para medir a expressão de luciferase (Fig 2D) . Observou-se que nos órgãos normais, Ad-522E-Luc mediada expressão do transgene da luciferase no fígado, baço e pulmão foi significativamente mais baixo do que o de Ad-CMV-Luc, com taxas de redução de 16%, 41%, e 1%, respectivamente. Consistente com um estudo anterior revelando uma expressão aumentada de ARNm osteonectina em células epiteliais do ducto pancreático [33], a actividade da luciferase transduzidas pelo Ad-522E-Luc no pâncreas foi 34 vezes maior do que a induzida pelo Ad-CMV-Luc. Enquanto a actividade de luciferase foi apenas detectada na próstata de rato normal, independentemente da administrao do vector Ad, extremamente alta a expressão de luciferase por Ad-522E-Luc foi observada em xenoenxertos da próstata PC3M, com expressão de 5 vezes maior do que pelo Ad-CMV-Luc. Estes resultados sugerem que o promotor Hon-522E é apropriada em relação à expressão do transgene eficiente e seletiva para a segmentação transcricional de células AR-negativas e câncer de próstata metastático.

Avaliação da

in vitro

citotoxicidade de Ad-522E-TK recombinante em células de câncer de próstata e do estroma ósseo

para avaliar a viabilidade de hon-promotor dirigido co-alvo terapia genética para câncer de próstata, foi elaborado um deficiente em replicação adenoviral vector, Ad-522E- TK, que transporta o gene do vírus herpes simplex TK-driven promotor hon-522E. A eficácia de entrega de genes de TK nas linhas celulares de cancro da próstata e osso do estroma foi determinada utilizando o ensaio de atividade de TK enzimática depois de expor essas células para o Ad-522E-TK e normalizada para o controlo externo do Ad-CMV-TK para a infecciosidade viral. As linhas de células testadas, incluindo linhas celulares de cancro da próstata e do estroma ósseo, revelou a transdução do gene TK bem sucedida por Ad-522E-TK com uma, pelo menos, duas vezes a actividade mais forte em células de cancro da próstata AR-negativo DU145, PC3 e PC3M bem como osso as células estromais e MG63 HS27A em comparação com linhas celulares de LNCaP linhagem AR-positiva (Fig 3A), o que era semelhante ao resultado da actividade repórter de luciferase por p522E-Luc (Figura 2C). Mais notavelmente, células PC3M Ad-522E-TK-infectadas exibiu uma maior, em vez de em menor actividade da TK do que as células infectadas com Ad-CMV-TK; este resultado foi consistente com a actividade de transgene Ad-522E-Luc em tumores de xenoenxerto PC3M (Figura 2D). Após o tratamento com ganciclovir pró-fármaco adicional (GCV), Ad-TK-522E acentuada e dependente da dose diminuiu o crescimento das células PC3M com uma eficácia maior do que a de Ad-CMV-Luc; Ad-TK-522E ou GCV isoladamente não exerceu qualquer efeito citotóxico sobre as células PC3M (Fig 3B). Além disso, a infecção de MG63 e HS27A com Ad-TK-522E também induziu a morte celular significativa quando combinado com GCV (Fig 3C). Estes resultados demonstraram a capacidade de Ad-522E-TK como alvo tanto o cancro da próstata e células de estroma ósseo.

(A). Comparação de expressão do transgene em células TK celulares de cancro da próstata humano e linhagens de células estromais óssea por Ad-522E-TK e Ad-CMA-TK. * P