Abstract

O resveratrol, extraído de ervas chinesas cuspidatum Polygonum medicina, é conhecido por inibir a invasão e metástase de cancro colorectal humano (BF), em que longa não codificante Metástase Associated Adenocarcinoma pulmonar Transcrição 1 (ARN-MALAT1) também desempenha um papel importante. Usando MALAT1 Lentivirus shRNA e excesso de construções de expressão em linhas celulares de CRC derivados, LoVo e HCT116, que demonstraram que os efeitos anti-tumorais do resveratrol sobre CRC são através de inibição da sinalização de Wnt /β-catenina, assim, a expressão dos seus genes-alvo, tais como C-Myc, MMP-7, bem como a expressão de MALAT1. Em detalhe, o resveratrol sub-regula MALAT1, resultando em diminuição da localização nuclear de β-catenina, assim, atenuado a sinalização de Wnt /β-catenina, o que leva à inibição de invasão e metástase de CRC. Este achado do nosso certamente fornece a evidência pré-clínica importante apoiar a futura utilização de resveratrol na prevenção e tratamento da CRC

Citation:. Ji Q, Liu X, Fu X, Zhang L, Sui H, Zhou L, et ai. (2013) Resveratrol inibe a invasão e metástase de células de câncer colorretal via MALAT1 Mediated Wnt /β-catenina Signal Caminho. PLoS ONE 8 (11): e78700. doi: 10.1371 /journal.pone.0078700

editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de maio de 2013; Aceito: 15 de setembro de 2013; Publicação: 11 de novembro de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (81202812, 81303102, 81303103), Programa de Shanghai Comissão Municipal de Educação (2011JW57, 12YZ058), Xangai Secretaria Municipal de Saúde (ZYSNXD-CC-YJXYY-JS20, 2011ZJ030, 20114Y001, 20114037), Xangai chave do Laboratório de Medicina Clínica tradicional chinesa (C10dz2220200). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro colorrectal é o resultado da mutação de vários genes, incluindo proto-oncogenes e genes supressores de tumor. À medida que os oncogenes que controlam a proliferação de células remanescente altamente expresso, ou os genes supressores de tumor a ser mutado, as células cancerosas resultantes iludir o sistema imunológico, formar tumores em locais distantes /órgãos, ou seja, metástase e da fase terminal de câncer começa [1].

o surgimento de novos medicina chinesa medicamentos anticancerígenos monômero tem proporcionado uma nova opção para o reptoire de drogas sintéticas para tratamento de câncer [2]. Polygonum cuspidatum é os rizomas e raízes da erva perene Tateshina – Polygonum cuspidatum [3]. Os dados anteriores mostraram que Polygonum cuspidatum tinha vários efeitos inibitórios sobre tumores, infecções virais e bacterianas /inflamação [3] – [7]. O resveratrol extraído de Polygonum cuspidatum é um antioxidante natural, que pode reduzir a viscosidade do sangue, inibir a agregação plaquetária e vasodilatação, a manter o fluxo de sangue, e prevenir a ocorrência e o desenvolvimento de cancro [8] -. [10]

precoce em 2003, Ji

et al

primeiramente identificada longo RNA não-codificante – MALAT1. Em 225 casos de fase I do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), que foi encontrado em 70 casos, metástase correlaciona com MALAT1 sobre-expressão, num curso e modo específico do tecido, sugerindo que a expressão MALAT1 pode servir como um marcador potencial de sobrevivência no estágio 1 pacientes com NSCLC [11]. Por outro lado, outros grupos mostraram que MALAT1 sobre-expressa no fígado, o cancro do colo do útero e cólon [12] – [14]

Muitos estudos têm demonstrado que a via de sinalização Wnt /β-catenina regula a invasão de células tumorais e metástases.. Soichi

et al, achou que, em células carcinoma epidermóide oral, o acúmulo de β-catenina no citoplasma induz TCF /LEF transcricional atividade, e aumentar a expressão de MMP-7, induzindo assim a conversão de células epiteliais para células mesenquimais, assim como melhorar a invasão e metástase [15]. Guo

et ai

demonstrado na linha de células HT29 CRC, produto do gene NGX6 inibiu a transferência do β-catenina a partir do núcleo e do citoplasma para a membrana celular, desse modo inibindo a actividade de transcrição de TCF e regulação negativa da expressão de Wnt genes alvo c-myc, cyclinD1 e COX-2, conduzindo a uma diminuição da invasão de células de cancro e metástase [16].

os nossos estudos actuais interrogados os mecanismos pelos quais o resveratrol regula MALAT1 e via de sinalização Wnt /β-catenina , resultando na invasão da célula cancerosa reprimida e metástase.

amostras de tecidos normais

tumorais Materiais e Métodos

Hibridização In Situ em amostras de tecido de pacientes com CCR

parafina-embedded e adjacentes a partir de 60 pacientes com CCR submetidos à ressecção do tumor no Putuo Hospital, Universidade Shanghai de Medicina tradicional chinesa (SUTCM) entre 2010 e 2012 foram selecionados para hibridação com digoxigenina (DIG) marcado com sonda de DNA MALAT1 (Shinegene Molecular Biotechnology, Xangai, China). A experiência foi realizada de acordo com o método descrito por Tanner

et al [17]. O estudo foi aprovado pela comissão de ética do Pu Tuo Hospital, SUTCM e todos os pacientes foram fornecidos com consentimento informado por escrito.

Triagem de medicina chinesa de monômeros Anticancer Drugs on Expression MALAT1 em células LoVo

LoVo células (derivadas de metástases esquerda supraclavicular região, Dukes ‘tipo C, grau IV, adenocarcinoma colorrectal) foram cultivadas em meio F12K suplementado com soro bovino fetal a 10%, 100 g /ml de estreptomicina, 100 U /ml de penicilina, a 37 ° C, 5% de CO2, e alta umidade. Todas as drogas anti-cancro medicina Chinesa de monómero foram diluídas em série para detectar a concentração de metade da inibição sobre a proliferação de células LoVo. A proliferação de células LoVo foi determinada por contagem celular Kit-8 ensaio (CCK-8) como anteriormente descrito [18]. PCR em tempo real foi utilizado para detectar a taxa de inibição de drogas candidatas sobre a expressão MALAT1. Para a análise por PCR em tempo real, o iniciador directo, o iniciador inverso, e a sonda Taqman foram concebidos como se segue: para a frente (5-AGGCGTTGTGCGTAGAGGA-3), reverso (5-GGATTTTTACCAACCACTCGC-3), sonda TaqMan (5-FAM + CCTAGACCAGCATGCCAGTGTGCC + tamara-3). PCR em tempo real foi realizada em 7300 o sistema Applied Biosystems (Applied Biosystems Deutschland GmbH) Pré-mistura utilizando Ex Taq (Takara, DaLian, China). GAPDH foi utilizado como referência interna

knockdown e sobre-expressão de gene MALAT1

MALAT1 ADNc humano (Gene ID: 378938). Foi amplificado por RT-PCR com ARN extraído de células LoVo, e, em seguida clonado no vector de pLV4. MALAT1 foram procurou sequências alvo de siRNA adequado, três sequências de siRNA foram projetados, sintetizada, e confirmado por sequenciação respectivamente. partículas lentivirais foram produzidos por co-transfecção de vector de expressão pLV4-MALAT1 ADNc ou pLV4-MALAT1 shRNA com vector viral auxiliar embalagem de partículas em células 293T. Experiências preliminares escolhemos as sequências de siRNA mais eficientes de knockdown do acima mencionado três candidato siRNA (Figura S1): 5′-sentido GAGGUGUAAAGGGAUUUAUTT-3 ‘, anti-sentido 5′-AUAAAUCCCUUUACACCUCTT-3′; com uma sequência de controle siRNA negativo: sentido 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘., anti-sentido 5’- ACGUGACACGUUCG

GAGAATT-3′. Título de partículas virais contendo MALAT1 shRNA e ADNc MALAT1 foi determinada por diluição em série limitada. A eficiência de knockdown ou sobre-expressão foi determinada por PCR em tempo real. células LoVo ou células HCT116 foram infectadas com o lentivírus com o cDNA pLV4-MALAT1, pLV4-MALAT1 shRNA ou pLV4-vector.

luciferase Reporter Assay

Para testar promotor MALAT1 ou promotor LEF /TCF actividade, as células LoVo foram co-transfectadas com o promotor ou o plasmídeo recombinante pGL3-basic-MALAT1 ou pGL3-basic-ABL promotor /TCF com um plasmídeo de controlo positivo pRL-SV40, como descrito anteriormente [19]. A actividade do promotor foi analisada utilizando um kit de ensaio de luciferase dupla comercial (Beyotime Instituto de Biotecnologia, China) de acordo com as instruções do fabricante.

migração e invasão Ensaio

Um total de 5 × 10

5 células LoVo cultivadas em 100 ul F12K com 0,5% de FBS foram semeados na parte superior de uma câmara de Transwell (Corning Incorporated, Corning, NY). Para a análise de migração, na parte inferior da câmara, foi adicionado 600 uL F12K com 15% de FBS e 10 ng /ml de fibronectina e o ensaio foi realizado durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO2. células migradas foram analisados ​​por coloração com violeta de cristal, seguida pela observação sob um microscópio invertido DMI3000 B (Leica, Alemanha). Para a análise de invasão, 100 ul de matrigel (BD, EUA) foi primeiramente adicionado até ao fundo da câmara de Transwell antes células LoVo foram semeadas, e os seguintes procedimentos foram os mesmos como análise de migração, excepto para as células invasoras ser analisados ​​após a co-cultura durante 48 horas. Como a células HCT116, os procedimentos foram semelhantes, a única diferença era células sendo cultivadas com irpm 1640.

Western Blot

celular, foram preparadas Whole citoplasma e proteínas nucleares de células LoVo ou HCT116 de acordo com as instruções do fabricante de ProteoJET citoplasmática e kit de extracção de proteína nuclear (Fermentas, EUA). As proteínas foram carregados em geles de SDS-PAGE para a electroforese, transferidos para membranas de PVDF e bloqueados em leite a 5% antes da incubação com os anticorpos primários indicados e os anticorpos secundários. Os imunocomplexos resultantes foram visualizados por quimioluminescência aumentada. carga de proteína foi normalizada por β-actina (proteína inteira ou proteína citoplasma) ou PCNA (proteína nuclear).

Proteína de ligação a ARN imunoprecipitação

imunoprecipitação proteína de ligação a ARN (PIR) foi realizada de acordo com os protocolos do fabricante a partir do EZ-Magna PIR Kit (Millipore, EUA). Resumidamente, as células LoVo foram lavadas com fosfato arrefecido com gelo solução salina tamponada (PBS), lisadas por lise tampão de PIR. Ambos β-catenina (CST, EUA) e os anticorpos de IgG de coelho de controlo não específicos foram utilizados para a imunoprecipitação. lisados ​​de RIP e de anticorpos β-catenina grânulos com destino magnética foram incubados juntos com rotação durante a noite a 4 ° C. Depois, as proteínas no imunoprecipitado foram digeridas com proteinase K e RNAs ligados foram purificados a partir dos sobrenadantes, transcrito de forma inversa utilizando-PrimeScript RT kit de reagente, seguido por análise quantitativa.

Inmunofluorescence Microscopia

células LoVo ( 2,5 × 10

5) foram crescidas em lâminas de câmara (Millipore, EUA) durante 8 horas, após jejum de 12 horas. As células foram fixadas durante 40 minutos com 4% de paraformaldeído em PBS, à temperatura ambiente, permealized e bloqueadas com leite em pó a 5% não gordo, 1% de BSA, 0,5% de Triton X-100 e incubou-se durante a noite com anticorpo monoclonal de coelho anti-β-catenina ( CST, EUA). Após lavagem das lâminas, foi adicionado anticorpo anti-IgG de coelho conjugado com Cy3 (Beyotime Instituto de Biotecnologia, China) em solução de bloqueio durante 1 hora. 4-6-diamidino-2-fenilindole foi aplicada aos núcleos mancha. imagens de imunofluorescência foram tiradas com uma DMI3000B microscópio invertido (Leica, Alemanha).

Análise Estatística

Todos os dados foram apresentados como médias SEM. Os valores médios dos dois grupos foram comparados pelo

t

teste de Student. As associações entre a expressão de MALAT1 e os parâmetros clínico foram analisados ​​utilizando o teste exato de Fisher, qui-quadrado ou testes qui-quadrado correção de continuidade de software SPSS18.0.

Resultados de

1. MALAT1 é abundante na Cancer tecidos e correlaciona colorretal com metástases tumorais e invasão

Usando

in situ

hibridação, encontramos houve maior expressão de MALAT1 no tecido do cancro colorectal (CRC) do que o tecido colorrectal normal adjacente (Figura 1 e Tabela 1). A seguir, realizou uma análise de correlação entre a expressão MALAT1 e as características clinicopatológicas de CRC. Foi observada uma associação estatisticamente significativa entre a expressão MALAT1 e extensão da metástase e invasão. Em contraste com os tecidos normais adjacentes, a expressão em tecidos MALAT1 CRC ressecados a partir de pacientes com doenças metastáticas foi maior do que aqueles sem metástases (Tabela 2). Esta associação entre a expressão MALAT1 e extensão da metástase e invasão também foi confirmada por PCR em tempo real (Figura S1).

In situ

hibridação foi aplicado para investigar a expressão MALAT1 em 60 de parafina-embedded tecido do tumor e amostras de tecidos normais adjacentes de pacientes com CCR.

2. Resveratrol inibe a proliferação, migração e invasão das células LoVo

À tela drogas medicina monômero anticancerígenos chineses que inibiram a expressão MALAT1 em células LoVo, nós investigados pela primeira vez o impacto das drogas candidatos sobre a proliferação de células LoVo, e calculou a metade de concentração de inibição (IC50) de todos os medicamentos candidatos (Tabela 3). Seguinte, olhou para o efeito de drogas candidatos na inibição da expressão MALAT1. Os nossos resultados mostraram que o resveratrol e osthole foram as 2 melhores drogas anti-cancro no que respeita à inibição da expressão MALAT1, com o resveratrol ser o melhor entre estas duas (Figura 2A). Por isso, escolhemos resveratrol para os nossos novos estudos sobre MALAT1 e mecanismos relacionados. Com os nossos dados mostrando uma CI50 de 55 uM resveratrol nas células LoVo (Figura 2b), as doses de fármaco de 15, 30 e 50 uM foram assim escolhidos para a investigação do efeito do resveratrol sobre as capacidades de invasão e de migração das células cancerosas. Os nossos resultados mostraram células LoVo foram significativamente inibidas na sua capacidade de invadir e migrar pelo resveratrol, de um modo dependente da dose (Figura 2C)

(A):. Vinte e dois medicina chinesa fármacos anticancerígenos monómero candidatos foram testados para as doses eficazes na inibição da expressão MALAT1 em células LoVo. (B): Correlação de doses de droga resveratrol e inibição do crescimento nas células LoVo. eixo Y: percentagem de inibição de crescimento; Eixo X: As concentrações de resveratrol (m). (C): Avaliação e quantificação da migração celular e invasão de células LoVo. Os valores representam o número de células migratórias /invasivos por 5 campos de alta potência. *

p Art 0,05 ou **

p

. 0,01, em comparação com células de controlo LoVo

3. Resveratrol Inibe a localização nuclear de β-catenina, níveis de suas proteínas a jusante, e Expression MALAT1 em células LoVo

Em seguida, encontramos que o resveratrol atenuou a localização celular da β-catenina, uma invasão da célula cancerosa regulação de proteínas e metástase. Como mostrado na Figura 3A, de uma forma dependente da dose, o resveratrol reforçada os níveis citoplasmáticos de β-catenina, enquanto diminui a sua presença no núcleo, com pouco efeito sobre a proteína total β-catenina celular.

( a): total de celulares ou extractos de diferentes compartimentos celulares de células LoVo tratados com resveratrol foram sondados para β-catenina. β-catenina os níveis de proteína foram quantificados. *

p Art 0,05 ou **

p Art 0,01, em comparação com o grupo controle. (B): Os extractos celulares totais de células LoVo tratadas com resveratrol foram sondadas para c-Myc, os níveis de proteína MMP-7 e foram quantificados. *

p Art 0,05 ou **

p Art 0,01, em comparação com células de controlo LoVo. (C): Os níveis de expressão de MALAT1 de células LoVo tratados com as doses indicadas de resveratrol foram determinadas por PCR em tempo real. As actividades promotoras MALAT1 relativas em células LoVo tratados com doses de resveratrol indicados foram medidos. *

p Art 0,05 ou **

p

. 0,01, em comparação com células de controlo LoVo

A seguir, estudou a expressão de jusante β-catenina genes alvo na presença de resveratrol, para o papel principal de β-catenina no núcleo é através do seu regulamento sobre a transcrição de genes. Sem surpresa, verificou-se a expressão de β-catenina genes alvo a jusante de c-Myc e MMP-7 foi significativamente reduzida pelo resveratrol, de um modo dependente da dose (Figura 3B). Estes dados indicaram que o resveratrol pode inibir a invasão de células cancerosas e a migração através da repressão de Wnt /via de sinal β-catenina.

Além disso, descobrimos que o resveratrol regulada negativamente a expressão de longa não codificante de ARN-MALAT1 numa dose forma dependente (Figura 3C). Para verificar o impacto de resveratrol na expressão MALAT1, utilizou-se o promotor MALAT1 sistema de repórter duplo de luciferase e descobriram que o resveratrol inibiu directamente a actividade do promotor de MALAT1, v.g. única actividade do promotor de 10% foi conseguida com 50 uM de resveratrol em relação ao controlo (Figura 3D). Estes dados sugerem que o resveratrol tem impacto direto sobre a transcrição de genes MALAT1.

4. MALAT1 promove a proliferação, invasão e migração, e aumenta a localização nuclear de β-catenina e Níveis de seus produtos de genes a jusante em células LoVo

Em seguida, usando construções mediada por lentivírus, nós derrubado ou sobre expressas gene MALAT1 expressão em células LoVo. Nossos dados demonstram claramente que a proliferação e capacidade de invasão /migração de células LoVo foram significativamente diminuiu MALAT1 knockdown, e aumentou MALAT1 sobre-expressão (Figura 4A, 4B)

(A):.

In vitro

crescimento de células LoVo expressando MALAT1-shRNA, MALAT1-sobre-expressão, vetor vazio vs. células parentais. (B): A avaliação e a quantificação da migração celular e invasão de células LoVo indicados em A. Os valores representam o número de células migratórias /invasivos por 5 campos de alta potência. *

p Art 0,05 ou **

p

. 0,01, em comparação com o grupo controle LoVo

Quando derrubado, a expressão do gene MALAT1 usando shRNA construir em células LoVo, fomos surpreendidos ao descobrir que a proteína β-catenina foi retido no citoplasma, enquanto a sua presença em núcleos foi marcadamente aumentada (Figura 5A). Além disso, encontramos MALAT1 knockdown reduzida a expressão de β-catenina genes alvo a jusante, tais como c-myc, MMP-7, como MALAT1 sobre-expressão fez o oposto (Figura 5B). Este conjunto de dados implicada fortemente que o resveratrol inibiu as propriedades de proliferação, invasão e migração de células CRC através da expressão MALAT1-regulação para baixo

(A): MALAT1 inteiras ou extractos celulares de diferentes compartimentos celulares de células LoVo expressar. -shRNA, MALAT1-sobre-expressão, o vector vazio foram sondados para β-catenina e os níveis de proteína foram quantificados. *

p Art 0,05 ou **

p Art 0,01, em comparação com o controle de vetores. (B): inteiras ou extractos celulares de diferentes compartimentos celulares de células LoVo expressando MALAT1-shRNA, MALAT1-superexpresso, vector vazio foram sondados para c-Myc, MMP-7 e os níveis de proteína foram quantificados. *

p Art 0,05 ou **

p

. 0,01, em comparação com o controle de vetores

5. Superexpressão de MALAT1 resgata células LoVo de Reprimida migração e invasão por Resveratrol

Para confirmar a nossa descoberta do resveratrol suprimir a migração e invasão das células LoVo através MALAT1, foi realizada uma experiência de resgate MALAT1. Os nossos resultados demonstraram que a sobreexpressão mediada por lentivírus de MALAT1 atenuou significativamente a inibição induzida pelo resveratrol na migração celular e invasão em células LoVo (Figura 6A). Em outras palavras, a sobre-expressão de MALAT1 poderia reverter o efeito de resveratrol. Além disso, os resultados de Western blot mostrou que a sobre-expressão de MALAT1 reverteu o efeito do resveratrol sobre β-catenina nuclear e a expressão da proteína de c-Myc e MMP-7 em células LoVo (Figura 6B).

(A) : células LoVo expressando MALAT1-superexpresso, vector vazio foram tratadas com ou sem 50 resveratrol? M durante 48 horas e migração celular e capacidade de invasão foram medidos. (B): inteiras ou extractos celulares de diferentes compartimentos celulares a partir de células LoVo expressam MALAT1-sobre-expresso do vetor, vazio tratadas com ou sem 50 uM resveratrol foram sondadas para β-catenina, c-Myc, MMP-7, e os níveis de proteína foram quantificados . *

p Art 0,05 ou **

p

. 0,01, em comparação com células LoVo tratados com 50 mM resveratrol

6. Resveratrol inibe Wnt /β-catenina Sinalização via MALAT1

Nossa hipótese é que o resveratrol inibiu a via de sinalização Wnt /β-catenina através da regulação MALAT1. Para testar esta hipótese, utilizou-se a imunocoloração e análises de Western blot para observar se β-catenina localiza-se a partir de trans-citoplasma para nuclear com a presença de resveratrol e a manipulação dos níveis de expressão MALAT1. Para tornar o efeito mais evidente, foi utilizado para inibir o LiCl GSK3β de se ligar a proteína p-catenina, para aumentar o estado activo da via de sinal /β-catenina Wnt. Os nossos resultados estabelecidos, como LiCl, de facto induziu a translocação da proteína β-catenina do citoplasma para núcleo, o resveratrol (50 uM) impediu significativamente este processo (Figura 7A). Subsequentemente, a sub-regulação de MALAT1 aumentou o efeito do resveratrol sobre a inversão de translocação β-catenina do citoplasma para núcleo em células shRNA /MALAT1 LoVo, enquanto que a sobre-regulação de MALAT1 enfraqueceram (Figura 7B, 7C).

(A): O resveratrol negada LiCl translocação nuclear induzida de β-catenina. coloração por imunofluorescência de β-catenina em células LoVo tratados com LiCl, com ou sem o resveratrol. (B): Os extractos nucleares a partir de células que expressam LoVo MALAT1-shRNA, MALAT1-sobre-expressa, o vector vazio, tratou-se com LiCl com ou sem o resveratrol, foram sondadas para β-catenina, c-Myc, MMP-7. (C): Quantificação de β-catenina, c-Myc, os níveis de proteína MMP-7 a partir dos dados mostrados em (A). **

p Art 0,01, em comparação com o grupo em branco ou só grupo LiCl. (D): As actividades promotoras relativas LEF /TCF nas células LoVo expressando MALAT1-shRNA, MALAT1-superexpresso, vector vazio, tratado por LiCl, com ou sem resveratrol. **

p Art 0,01, em comparação com o grupo em branco ou só grupo LiCl. (E): Sem interação entre MALAT1 e β-catenina. Inserção: resultado RT-PCR mostrando quantidade de RNA puxado para baixo por imunoprecipitação proteína de ligação ao RNA. Como controlos negativos, não foi utilizado cDNA (em branco) ou IgG sozinho. Painel inferior: resultado quantificação do inserto

Além disso, testou-se o efeito do resveratrol sobre a sinalização de Wnt /β-catenina utilizando uma construção repórter de luciferase dupla-ABL promotor /TCF.. Nossos resultados indicaram claramente que, resveratrol inibiu a atividade do promotor de LEF /TCF induzida por LiCl, e co-repressão da MALAT1 levou ao aumento deste efeito, como co-superexpressão de MALAT1 opondo a ela (Figura 7D). Todos estes dados sustentada que o resveratrol inibe a actividade da via de sinal /β-catenina Wnt através de reprimir a expressão MALAT1. Desde MALAT1 e proteína β-catenina tanto existir no núcleo, por isso, é de grande interesse para nós sabemos se estas duas moléculas podem interagir directamente com o outro, o que pode ser detectada usando uma técnica de imunoprecipitação de proteínas de ligação a ARN. Surpreendentemente, os nossos dados mostraram pouca interação entre MALAT1 e β-catenina (Figura 7E). Este ilustrado que MALAT1 pode indirectamente interagem com β-catenina de afectar a sua cascata de sinais.

7. Comprovação de nossas principais descobertas em outro CRC linha celular HCT116

Para confirmar nossas principais descobertas em células LoVo, testamos uma outra linha de células CRC HCT116 utilizando abordagens semelhantes. Os nossos resultados mostraram que o resveratrol inibiu a proliferação de células HCT116 por a IC50 de 100 pM (Figura 8A). As células HCT 116 tinham muito mais baixa do que a expressão MALAT1 células LoVo, mas, no entanto, tão semelhantes às células LoVo, a sobre-expressão de MALAT1 promoveu a proliferação de células HCT116 (Figura 8B, 8C, 8D)

(A):. Resveratrol inibiu a proliferação de células HCT116 com uma IC50 de 100 uM. (B): células HCT 116 apresentaram menor expressão MALAT1 do que as células LoVo. **

p Art 0,01, em comparação com células LoVo. (C): A sobre-expressão de MALAT1 em células HCT116. (D): A sobre-expressão de MALAT1 promoveu o crescimento in vitro de células HCT116. (E): A superexpressão de MALAT1 atenuou o efeito supressor do resveratrol sobre migração e invasão em células HCT116. células HCT116 que expressam MALAT1-superexpresso, vector vazio foram tratadas com ou sem 50 resveratrol? M durante 48 horas e migração celular e capacidade de invasão foram medidos. (F): inteiras ou extractos celulares de diferentes compartimentos celulares a partir de células HCT116 que expressam MALAT1-sobre-expressa, o vector vazio tratadas com ou sem 50 uM de resveratrol durante 48 horas foram sondadas para β-catenina, c-Myc, MMP-7 e os níveis proteicos foram quantificados. *

p Art 0,05 ou **

p

. 0,01, em comparação com células HCT116 tratados com 100 M resveratrol

Além disso, o resveratrol também significativamente inibida a capacidade de migração e invasão de HCT116. Como em células LoVo, superexpressão de MALAT1 resgatado células HCT116 da supressão da migração e invasão de resveratrol (Figura 8E). resultados de Western blot mostrou também que a sobre-expressão de MALAT1 reverteu o efeito do resveratrol sobre β-catenina nuclear e a expressão da proteína de c-Myc e MMP-7 em células HCT116 (Figura 8F).

Discussão

o câncer colorretal é um dos tumores malignos mais comuns no mundo, com alta taxa de recorrência e metástase. Os mecanismos de recorrência e metástase continuam a ser muito complicada. Actualmente, o tratamento do cancro colo-rectal é a ressecção cirúrgica principalmente, combinada com a quimioterapia, imunoterapia, e outros cuidados alternativos, tais como a medicina tradicional chinesa. medicina tradicional chinesa e sua mais recentemente derivada tratamento monômero extraído pode melhorar os sintomas do câncer, reduzir a metástase do câncer, bem como reduzir o risco de recorrência do cancro colorectal. No entanto, os mecanismos e objectivos terapêuticos são ainda imperceptíveis. Entre estes monômeros extraídos, o resveratrol é um exemplo perfeito. Tão cedo quanto em 1993, Jayafilake

et al

descobriu que o resveratrol tem característica anti-câncer por causa de seu efeito repressivo sobre a atividade da proteína quinase-tirosina [20]. Outros investigadores descobriram ainda que o resveratrol tem efeito inibidor sobre um grande espectro de células tumorais malignas derivadas de mama, gástrico, do cólon, da próstata, do ovário, cancros da pele e [21] – [26]. Os nossos estudos actuais demonstraram que o resveratrol inibe a proliferação, invasão e metástase de células de cancro colorrectal.

Sendo o factor-chave de activação da transcrição da via de sinalização Wnt /β-catenina, após a activação a montante, β-catenina frequentemente transloca-se para o núcleo a partir do citoplasma, em coordenação com outros fatores de transcrição como TCF /LEF, para ativar seus genes-alvo c-Myc, cyclinD1, MMP-7 e CD44, que por sua vez desempenham papel fundamental na iniciação e desenvolvimento [27] tumor – [ ,,,0],30]. Os nossos dados indicam que o resveratrol bloqueou a translocação de β-catenina de núcleo, resultando na expressão reduzida de c-Myc e a MMP-7.

comprida não codificante de ARN-MALAT1 foi primeiramente relatada no invasiva não pequenas carcinoma de células, e ultimamente ser encontrada sobre-expressa em muitos outros tecidos de cancro, que indicou MALAT1 está associada a invasão e metástase [11] – [14]. Os nossos estudos mostraram MALAT1 sobre-expresso em 60 tecidos de CRC em comparação com os tecidos normais adjacentes, e a sobre-expressão MALAT1 correlacionada com invasão e metástase características CRC. Em nossos experimentos de triagem, foram identificados dois medicina extraído monômeros chineses tradicionais que têm efeito direto sobre a expressão MALAT1. Resveratrol é o melhor deles. Em nossos estudos atuais, ilustrado que knockdown shRNA mediada de MALAT1 obviamente reduzida de invasão e migração capacidades do CRC LoVo e células HCT116. Semelhante aos resultados do tratamento com resveratrol, knockdown de MALAT1 inibiu a trans-posição de β-catenina do citoplasma para núcleo, resultando em diminuição da c-Myc e a expressão de MMP-7, enquanto que a sobre-expressão MALAT1 fez o contrário.

usando um /promotor TCF LEF construção de luciferase dupla repórter e activar a via de sinal /β-catenina Wnt com LiCl, demonstrámos ainda que knockdown de MALAT1 aumentou o efeito inibidor do resveratrol sobre a actividade do promotor de LEF /TCF induzida pela LiCl, enquanto que a expressão excessiva de MALAT1 enfraqueceram. Todos estes resultados sugerem que o mecanismo de sublinhando o resveratrol pode ser através de uma repressão de sinalização de Wnt /β-catenina, via sub-regulação da expressão MALAT1.

MALAT1 é especificamente retidos nos salpicos nucleares, associada com o armazenamento ou modificação o ARNm de pré-processamento de máquinas, tem um efeito potencial na regulação da função dos genes, tudo isso implica que MALAT1 pode desempenhar um papel importante na carcinogénese [31] – [33]. Por esta razão que MALAT1 e proteína β-catenina tanto residem no núcleo, nós examinamos se existe uma interacção directa entre estas duas moléculas no núcleo. Infelizmente, observamos pouca interação direta entre MALAT1 e β-catenina, sugerindo que pode haver outras moléculas envolvidas na regulação entre MALAT1 e β-catenina. Nenhuma correlação direta entre a expressão elevada MALAT1 em amostras clínicas e acumulação nuclear de β-catenina foi encontrado. Como proposto por Brabletz T

et al

, β-catenina (Figura S1) em carcinomas de cólon mostrou um enriquecimento nuclear forte na frente de invasão, enquanto que em grandes partes da área tumoral central, β-catenina foi detectado em no citoplasma e na membrana [34] – [36]. Isto significa que se deve separar a frente invasão do resto do tecido CRC e medir os níveis de expressão de MALAT1, β-catenina e a sua localização, a sua correlação. Planejamos em estudos futuros, utilizando tecnologias como software de previsão de análise, co-imunoprecipitação, sequenciamento de proteínas, chips de proteínas e chips de genes, para identificar as ligações específicas entre MALAT1 e β-catenina.

Em conclusão, nossos resultados descobriram os mecanismos pelos quais o resveratrol MALAT1 regula, por sua vez, altera a localização nuclear de β-catenina, o que resulta em reduzido sinalização de Wnt /β-catenina e a eventual inibição de invasão e metástase. Esta descoberta certamente irá fornecer provas pré-clínica vital apoiar o uso futuro do resveratrol na prevenção e tratamento da CRC.

Informações de Apoio

Figura S1.

Selecção do shRNA mais eficiente para MALAT1, a detecção de ARNm e a expressão da proteína MALAT1 β-catenina em tecidos CRC e tecidos normais adjacentes. (A): células LoVo foram infectadas com lentivírus com três pLV4-MALAT1 shRNAs ou pLV4-vector. Suas eficiências de knockdown foram detectados por PCR em tempo real *

p

. 0,05 ou **

p Art 0,01, em comparação com o controle de vetores. (B): os níveis de expressão de mRNA MALAT1 foram medidos por PCR em tempo real, CRC tecidos e tecidos normais adjacentes. **

p Art 0,01, em comparação com tecidos normais ou tecidos CRC sem metástase.