Sumário

Análise de respostas imunitárias NY-ESO-1-específicos espontânea em pacientes de cancro revelou que o anticorpo e CD4

+ e CD8

+ respostas das células T foram induzidos em pacientes com cancro em conjunto . Para explorar se essas respostas imunes integrados são também de forma espontânea induzida por outros antígenos tumorais, nós avaliamos as respostas de anticorpos e células T contra a auto /tumor p53 antígeno em pacientes com câncer ovariano e indivíduos saudáveis. Descobrimos que 21% (64/298) dos pacientes com câncer ovariano, mas não doadores saudáveis ​​apresentaram respostas IgG específicos contra a proteína p53 do tipo selvagem. Embora nenhum dos 12 pacientes com anticorpos p53 alto título mostrou específicos de p53 CD8

+ respostas de células T espontâneos após uma única

in vitro

sensibilização, significativa específico da p53 IFN-γ produção de CD4

+ T As células foram detectados em 6 pacientes. Surpreendentemente, níveis semelhantes de específico da p53 CD4

+ células T mas não CD8

+ células T foram também detectadas em 5/10 pacientes com câncer seronegativos e 9/12 doadores saudáveis. Importante, específico da p53 CD4

+ células T em dadores saudáveis ​​originados a partir de um CD45RA

– população de células T de antigénio-experiente e reconheceram a proteína p53 de fenótipo natural processado naturalmente. Estes resultados levantam a possibilidade de que as células T CD4 específica à p53

+ T reflectem alterações em p53 que ocorrem em indivíduos normais e que podem desempenhar um papel em processos de vigilância imunológica ou imunorregulação de eventos relacionados com o neoplásicas p53.

citação: Tsuji t, J Matsuzaki, Ritter E, Miliotto A, G Ritter, Odunsi K, et al. (2011) Dividir T Tolerância celular contra um antigénio próprio /Tumor: Spontaneous CD4

+ mas não CD8

+ T respostas das células contra p53 em pacientes com câncer e dadores saudáveis. PLoS ONE 6 (8): e23651. doi: 10.1371 /journal.pone.0023651

editor: Mauricio Martins Rodrigues, Universidade Federal de São Paulo, Brasil

Recebido: 04 de março de 2011; Aceito: 22 de julho de 2011; Publicação: 12 de agosto de 2011

Direitos de autor: © 2011 Tsuji et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo grupo Cancer Research Institute cancro do ovário de trabalho Grant eo Vaccine Collaborative Cancer financiado pelo Instituto de Pesquisa do Câncer e Instituto Ludwig de Cancer Research Ltd. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a evidência crescente mostra que tanto o tumor antígeno-específica CD4

As células CD8 + e

+ T desempenham um papel crítico na erradicação do cancro [1], [2]. Nós temos investigado extensivamente respostas imunitárias espontâneas ou induzidas por vacinas contra o antigénio de cancro testicular NY-ESO-1 como um antigénio de tumor protótipo em humanos [3], [4], [5], [6], [7], [8 ]. que ocorre naturalmente o NY-ESO-1-específica CD4

+ e CD8

+ respostas de células T foram tipicamente detectada apenas em pacientes que tinham anticorpos séricos contra o NY-ESO-1, o que indica que as respostas imunitárias espontâneas contra NY-eso 1 em doentes com cancro com o NY-ESO-1 foram tumores que expressam altamente integrado [3], [4]. Recentemente, mostrou-se que após a vacinação com o NY-ESO-1 de proteína e CpG, NY-ESO-1-específica CD4

+ células T tornou detectável em primeiro lugar, seguido pelo aparecimento de anticorpos e células CD8 +

T , sugerindo um papel para o específico do NY-ESO-1 CD4

+ células T no sentido de facilitar o anticorpo e CD8

+ respostas de células T após a imunoterapia [8]. Além disso, descobriram recentemente que a vacinação com anticorpos A3-específicos de MAGE integrada induzida proteínas MAGE-A3, respostas das células CD8

+ e CD4

+ T [9]. Em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas que receberam a proteína MAGE-A3 formulada no AS02B sistema adjuvante,

+ respostas de células T CD8 foram induzidos apenas em pacientes que desenvolveram anticorpos muito alto título e

+ respostas de células T CD4 fortes . No entanto, esta correlação entre o anticorpo e as respostas de células T não foi completamente dirigida para outros antigénios de tumores humanos

Ao longo das últimas décadas, as respostas imunes contra p53 têm sido amplamente estudados [10], [11], [12. ], [13]. A proteína p53 foi descoberto no nosso laboratório como um antigénio específico de tumor imunogénica por investigação serológica de ratinhos portadores de tumores [14], e concomitantemente em dois outros laboratórios usando outros métodos de [15], [16]. Foi descoberto mais tarde que o gene p53 é frequentemente mutado em vários tipos de câncer, levando à perda de heterozygoty, desregulação das redes de feedback p53, e, finalmente, resultando em volume de negócios p53 mais lento e, portanto, o acúmulo da proteína p53 mutante nas células tumorais. Em humanos, a p53 é acumulado em até 70% dos tumores de pacientes com certos tipos de câncer, como de cólon ou câncer de cabeça e pescoço, e esta acumulação é um evento altamente imunogênica, espontaneamente, desencadeando respostas de anticorpos específicos de alto tituladas [12]. Com efeito, a p53 tem sido um dos antigénios detectados mais frequentemente reconhecidos pelo que ocorre naturalmente anticorpos em doentes com cancro, o rastreio de bibliotecas de expressão de cDNA derivadas de tumores humanos com anticorpos autólogos (SEREX) e por ELISA no nosso laboratório [17], [18] , [19], [20]. que ocorre naturalmente anticorpos séricos p53 em pacientes com cancro são conhecidos para reconhecer o tipo selvagem N-terminal ou sequências de terminal C de p53, mas não na região central da proteína em que 90% das mutações ocorrem. Nós e outros também investigaram as respostas de células T contra p53 de tipo selvagem e muitos epitopos, tanto para CD8

+ e CD4

+ de células T foram determinadas por abordagens imunologia reversa e repetida estimulação de células T com os péptidos sintetizados [10 ], [21], [22]. Resultados recentes de immunomonitoring células T de pacientes com câncer de ovário e de colo vacinados com péptidos sobrepostos p53 mostrou forte indução de específico da p53 CD4

+ respostas de células T, que foram ainda detectável pelo

ex vivo

análises de sangue periférico as células mononucleares (PBMC) após a vacinação sem induzir qualquer detectável específico da p53 CD8

+ células T [23], [24].

respostas de anticorpos espontânea

no presente estudo, nós investigamos e células T contra p53 em pacientes com cancro do ovário, cujos tumores frequentemente acumular proteína p53 [25], e dadores saudáveis. Para comparar o

in vivo

imunogenicidade de p53 com a de NY-ESO-1, nós monitorados CD4

+ respostas de células específicas de p53

+ e CD8 T utilizando os procedimentos immunomonitoring que foram desenvolvidos para monitorizar respostas de células T específicas para o NY-ESO-1-espontâneas. Estes métodos padronizados foram mostradas anteriormente para detectar o NY-ESO-1-específica CD4 circulantes

+ e CD8

+ T respostas de células apenas em pacientes com tumor de NY-ESO-1 que expressam 1-seropositivos NY-ESO-, mas não em dadores saudáveis ​​com baixa frequência de precursores [4], [26]. Usando este protocolo, descobrimos que as células IFN-γ-produção de CD4

+ T contra sequências de p53 do tipo selvagem foram detectados com frequência em pacientes com câncer soropositivos. Surpreendentemente, espontânea específico da p53 CD4

+ T respostas de células de magnitude similar também foram encontrados na maioria dos pacientes soronegativos e doadores saudáveis. Em contraste, não CD8 espontânea

+ T respostas de células contra a p53 do tipo selvagem, nem contra as próprias sequências de p53 mutados dos pacientes foram detectadas em quaisquer dadores testados, o que sugere que a activação espontânea de CD8

+ respostas de células T contra p53 é fortemente controlada

in vivo

.

Materiais e Métodos

pacientes e amostras dos doadores saudáveis ​​

PBMCs e soro foram obtidas de pacientes com câncer de ovário em do Roswell Park Cancer Institute, no âmbito de um protocolo aprovado do Conselho de revisão Institucional. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes. PBMC e soro de dadores saudáveis ​​foram obtidos a partir de New York Blood Center.

Medição dos anticorpos específicos de p53 no soro

recombinante p53 do tipo selvagem foi produzido e o nível de anticorpos do soro específicos de p53 foi medida como descrito previamente [20]. Um título recíproca foi estimada a partir das leituras de densidade óptica das amostras e controlos diluídos em série, como descrito [20].

péptidos sobrepostos

As sequências de péptidos que se sobrepõem a partir de proteína p53 do tipo selvagem utilizados para a detecção e presensitization são apresentados na Tabela S1. Todos os péptidos foram sintetizados por biossíntese (Lewisville, TX) e foram dissolvidos em sulfóxido de dimetilo (DMSO) numa concentração de 10 mM e armazenados a -80 ° C. Eles foram projetados para ser o comprimento de 25 aminoácidos, exceto # 1 (19-mer) e nº 30 (22-mer) e têm 15 aminoácidos sobreposições. aminoácido para códon 72 do tipo selvagem p53 frequentemente mostra Arg para Pro polimorfismo [27]. Para lidar com esse polimorfismo, dois peptídeos diferentes com Arg ou Pro na posição 72 foram preparados para peptídeo # 6 e foram misturados a uma razão de 01:01.

Presensitization

In vitro

presensitization foi realizada como descrito anteriormente [28]. CD8

+ e CD4

+ células T foram separadas das PBMC usando Dynabeads (Invitrogen-Dynal AS) e foram estimuladas de forma independente com CD8

-CD4

– células que foram pulsadas durante a noite com um pool ( # 1- # 30), 2 piscinas (# 1- # 15 e # 16 # 30), ou 3 piscinas (# 1- # 10, # 11- # 20 e # 21 e # 30) de péptidos que se sobrepõem de acordo para o número de células após separação e irradiado. As culturas celulares foram suplementado com 10 U /ml de IL-2 e 20 ng /ml de IL-7, duas vezes por semana. Em paralelo, uma porção de CD4

+ células T foi policlonalmente expandido com fito-hemaglutinina (PHA, Remel) na presença de uma dose baixa de IL-2 e IL-7, a ser utilizados como células alvo (T-APC) em ELISPOT ensaio. Em algumas experiências, CD4

+ células T foram ainda separadas em CD45RA

+ CD45RA e

– subconjuntos por ficoeritrina (PE) -conjugated anticorpo anti-CD45RA monoclonal (mAb) (BD Biosciences) e anti-PE grânulos -magnetic (Miltenyi Biotec).

a detecção de resposta de células T específica de p53

a produção de IFN-γ específico da p53 foi avaliado por teste ELISPOT no dia 9-12 para CD8

+ células T e os dias 18-25 de CD4

+ células T. Primeiro, as células T foram avaliados quanto à sua reactividade contra a 6 grupos de 5 péptidos (# 1- # 5, # 6 # 10, etc.). Nalgumas experiências, um conjunto de 17 péptidos que se sobrepõem do NY-ESO-1 foi utilizado como péptidos irrelevantes. Se a produção de IFN-γ foi detectada contra qualquer um dos conjuntos de péptidos, péptidos independentes na piscina foram testados para determinar um único péptido reconhecido. Todos os resultados de ensaios ELISPOT foram apresentados como o número médio de células formadoras de focos de IFN-γ a partir de cavidades em duplicado sem subtraindo o número de manchas de fundo contra células alvo não pulsados. As respostas foram consideradas positivas se o número de pontos contra o péptido (s) de células alvo -pulsed era 3 vezes mais do que contra células alvo não pulsados ​​e mais do que 25 pontos /50.000 células T efectoras. Para alguns pacientes, as células T específicas para p53 foram detectadas por coloração de citocinas intracelulares e ensaios de expressão CD107a. Coloração de citocinas intracelulares para o IFN-γ, IL-4 e TNF-α foi realizada como descrito anteriormente [28]. Para ensaios de expressão CD107a, presensitized CD8

+ células T foram re-estimuladas na presença de 40 ul /ml de conjugado com PE anti-mAb CD107a (BD Biosciences) e 0,66 ul /ml GolgiStop (BD Biosciences). Em algumas experiências, p53 específico do péptido CD4

+ células T foram isolados por triagem de citometria de fluxo de células que expressam CD154 após re-estimulação com péptidos de p53 e eles foram policlonalmente expandido com PHA, tal como descrito anteriormente [28]. O reconhecimento da proteína p53 naturalmente processados ​​e a produção de citocinas por específica à p53 CD4

+ linhas de células T foram investigados utilizando células autólogas derivadas de monócitos dendríticas (MO-DC) pré-pulsadas durante a noite com péptidos de p53 sobrepostas (3,3 uM), proteína p53 recombinante (20 ug /ml) ou controlar a proteína NY-ESO-1 (20 ug /ml). Os níveis de citocinas nos sobrenadantes foram medidos por ELISA em sanduíche usando os seguintes pares de mAb: não marcado e biotinilado anti-IFN-γ (BD Biosciences), não marcado e biotinilados anti-GM-CSF mAbs (BD Biosciences), não marcado e biotinilado anti -IL-4 mAb (BD Biosciences), não marcados e biotinilado anti-IL-13 mAbs (eBioscience), não marcados e biotinilado anti-IL-10 mAbs (eBioscience), mAb biotinilado não marcados e anti-TGF-p (eBioscience ), não marcados e biotiniladas com anti-IL-17 mAbs (eBioscience) e mAb biotinilado e não marcados com anti-IL-9 (eBioscience). proteínas citocinas padrão foram obtidos a partir de eBioscience.

Resultados

resposta de anticorpos anti-p53

Para avaliar a imunidade espontânea contra p53, medimos títulos de anticorpos no soro contra p53 e NY-ESO -1 proteínas em 298 pacientes com câncer de ovário epitelial avançado e 153 indivíduos saudáveis ​​por ELISA. Como mostrado na Figura 1, 21% dos pacientes, mas nenhum dos indivíduos saudáveis ​​mostraram anticorpo significativa soro anti-p53, que era muito semelhante à frequência de anti-NY-ESO-1 observadas respostas de anticorpos (21%). Estas frequências de respostas de anticorpos contra p53 espontâneas e NY-ESO-1 está na gama de aqueles relatados por pacientes do cancro do ovário em vários estudos [29]. Em contraste, um número menor de pacientes (7%) apresentaram anticorpo sérico significativa contra o antigénio de cancro /testículo de MAGE-A3 (dados não mostrados). A freqüência de pacientes que mostraram tanto anticorpos séricos p53 NY-ESO-1 e foi de 4,7%, que é próxima da frequência calculada a partir frequências contra cada antigénio assumindo que a indução dessas respostas é independente (0,21 (21% contra p53) × 0,21 (21% contra o NY-ESO-1) = 0,044 (4,4% contra ambos os antigénios)).

os soros de 298 pacientes com cancro do ovário e 153 indivíduos saudáveis ​​foram avaliados quanto a anticorpos contra p53 de tipo selvagem e NY -ESO-1 proteínas por ELISA. Os títulos recíprocos são calculados conforme descrito na referência [20].

Undetectable espontânea CD8

+ resposta das células T em pacientes com câncer e os doadores saudáveis ​​

Para o immunomonitoring de T espontânea respostas de células, é importante para selecionar um método que pode distinguir

in vivo

-primed células T de

in vitro

induzida por células T. Para monitorar as respostas de células T induzida espontaneamente contra p53, que empregue um único

In vitro

protocolo de sensibilização que tem sido desenvolvido e validado para detectar respostas de células T específicas para o NY-ESO-1 espontânea apenas em NY-eso 1 doentes com cancro seropositivos mas não em indivíduos saudáveis. Usando este protocolo, NY-ESO-1-específica CD8

+ células T foram detectados com frequência de NY-ESO-1 doentes com cancro do ovário seropositivos mas não de indivíduos saudáveis ​​neste estudo de coorte (Figura S1 (A)). Em contraste, vários ciclos de estimulação por células processadoras de antigénios profissionais (APCs), tais como MO-DC pode induzir as células T específicas para o NY-ESO-1-de naive precursores específicos NY-ESO-1 em dadores saudáveis ​​[30], [31 ]. Devido à frequente ocorrência de anticorpo no soro contra p53 espontânea em pacientes com cancro do ovário, foram analisados ​​em primeiro lugar específico da p53 CD8

+ respostas das células T nesses pacientes. A partir da constatação de que as células T específicas para o NY-ESO-1-espontâneas são detectáveis ​​apenas em pacientes seropositivos, 12 pacientes com cancro do ovário com as respostas de anticorpos contra p53 espontâneas foram seleccionados para a avaliação de respostas de células T. células T +

CD8

+ e CD4 foram isoladas de PBMC, como descrito em materiais e métodos, e eles foram estimulados separadamente com CD4

-CD8

p53 peptídeo-pulsadas – células. Depois de cultura durante cerca de 10 dias, o número de IFN-γ produção específica à p53 células CD8

+ T foi avaliada por ensaio ELISPOT. Como mostrado na Figura 2A, dois pacientes seropositivos representativos mostraram nenhum anti-p53 detectável CD8

+ resposta de células T pelo nosso protocolo immunomonitoring padrão. Da mesma forma, sem produção significativa de IFN-CD8 γ

+ células T foi detectada a partir de 10 pacientes seropositivos adicionais (Figura 2B). Dez pacientes com câncer ovariano seronegativos e 12 dadores saudáveis ​​também foram testados quanto à sua CD8 espontânea

+ resposta das células T contra a p53 e, como esperado, não houve indicação de específico da p53 CD8

células + T (Figura 2B). É possível que específico da p53 CD8

+ células T produtoras de IFN não têm-γ capacidade e que eles são detectáveis ​​pela expressão de outras moléculas. Para testar se específica à p53 CD8

+ células T eram detectáveis ​​por outras moléculas induzida por activação, 5 seropositivos e seronegativos 5 pacientes foram analisados ​​para a produção de TNF-α e expressão CD107a após re-estimulação com péptidos. Como mostrado na figura 2C, nenhum CD8 específico da p53

+ resposta de células T foi detectado com base na produção de TNF-α e expressão CD107a.

(A) CD8

+ T células de cancro do ovário anticorpo positiva pacientes foram presensitized com um conjunto de 30 péptidos que se sobrepõem p53. Após 9-12 dias, específico da p53 IFN-γ produção de células T foram avaliadas por ensaios ELISPOT. As barras de erro representam o desvio padrão (DP) de poços duplicados. Autólogo t-APCs foram usadas como células alvo em ensaios ELISPOT. (B) CD8

+ respostas de células T em 7 seropositivos e 5 pacientes com câncer ovariano seronegativos e 12 dadores saudáveis ​​são mostrados. + células T

(C) Presensitized CD8 foram analisados ​​por meio de ensaios intracelular de coloração de TNF-α e expressão CD107a após re-estimulação com, células (NY-ESO-1) péptidos-pulsados ​​ou alvos não pulsados-p53-péptidos pulsadas irrelevantes.

Estes resultados indicam que o IFN-espontânea-γ produzir CD8

+ respostas de células T contra p53 de tipo selvagem não eram detectáveis, mesmo em doentes com cancro por seropositivos nosso protocolo presensitization em contraste com a detecção frequente de NY CD8 específicas -ESO-1-

+ respostas de células T em pacientes NY-ESO-1-seropositivos (Figura S1 (A)). A acumulação de proteína p53 mutada em células tumorais é conhecido correlacionar-se com a resposta de anticorpos [32]. Porque os péptidos mutantes são considerados como sendo imunogénica, devido à ausência de tolerância e imunogenicidade da p53 mutante para induzir CD8

+ respostas de células T foi demonstrada em ratos [33], [34], que próxima procurado CD8

+ células T respostas contra p53 mutada. Para fazer isso, exões 5-7 do gene de p53 a partir de tecidos tumorais e de linfócitos normais de pacientes de cancro do ovário foram sequenciados para identificar mutações de p53 potenciais no tumor (dados não apresentados). Entre as mutações detectadas, três mutações que ocorrem com freqüência, S127F, R273C, e R282W, foram selecionados para procurar CD8 específica

+ resposta das células T contra epítopos que abrangem estas mutações. CD8

+ células T a partir de três pacientes que tiveram tumores com S127F, R273C ou mutação R282W foram estimuladas com os péptidos que contêm mutações na p53 do paciente ou com os péptidos que contêm a sequência de tipo selvagem correspondente. Nenhuma mutação específica do péptido CD8

+ resposta de células T foi detectado nestas três pacientes (dados não mostrados).

CD4

+ T respostas de células em pacientes com cancro e indivíduos saudáveis ​​

respostas ocorrendo Para detectar naturalmente CD4

+ de células T contra p53, CD4

+ T células de pacientes com câncer seropositivos foram estimulados com péptidos que se sobrepõem pulsavam em PBMC com depleção de células autólogas T usados ​​como APCs. Após 20 dias de cultura na presença de uma dose baixa de IL-2 e IL-7, IFN-γ produzir CD4

+ células T foram enumerados por ensaio ELISPOT contra o sub-reuniões de péptidos que se sobrepõem e, em seguida, contra péptidos individuais de subcombina�es reactivos . Em contraste com a não detectável específico da p53 CD8

+ células T, significativa de IFN-γ produção específica à p53 CD4

+ T respostas de células para sub-reuniões de péptidos sobrepostos foram encontrados em 6 dos 12 pacientes seropositivos (Figura 3A e dados não mostrados), com magnitude comparável ao CD4 espontânea

+ T respostas de células contra o NY-ESO-1 em NY-ESO-1 em pacientes de cancro do ovário seropositivos nesta coorte do estudo (Figura S1 (B)). Nós próxima avaliada CD4 espontânea

+ respostas de células T contra p53 em 10 pacientes soronegativos e 12 indivíduos saudáveis. Surpreendentemente, embora o nosso método presensitization não detectar o NY-ESO-1-específica CD4

+ células T em indivíduos saudáveis ​​(Figura S1 (B)), o mesmo procedimento detectado significativa de IFN-γ produzir CD4

+ T respostas de células em 5/10 pacientes seronegativos e 9/12 indivíduos saudáveis ​​testadas (Figuras 3B e C e dados não mostrados). Em doentes seleccionados, específico da p53 CD4

+ células T eram detectáveis ​​por produção de TNF-α após coloração citocina intracelular (Figura S2).

CD4

+ T células de anticorpo positiva (a) e pacientes com câncer de ovário negativa (B) e os doadores saudáveis ​​(C) foram presensitized com piscina (s) de péptidos sobrepostos p53. Após 18-25 dias, específico da p53 IFN-γ produção de células T foram avaliadas em relação a péptido-pulsada ou não pulsados ​​(

φ

) células alvo por ensaios ELISPOT. As barras de erro representam DP de poços em duplicado. Autólogo t-APCs foram usadas como células alvo em ensaios ELISPOT. respostas de células T foram primeiramente avaliados contra subcombina�es de peptídeos (primeiro ensaio) e, em seguida, contra o péptido independente em um subpool reativa (segundo ensaio). Para o doador saudável mostrado em (C),

células CD4 + T, que foram presensitized com # 1- # 10 ou # 21 e # 30 peptídeo não apresentaram respostas significativas (dados não mostrados).

A Figura 4 resume epitopos reconhecidos por células T CD4

+ T de pacientes com câncer seropositivos e seronegativos e doadores saudáveis. Como mostrado na Figura 4, ambos os epítopos encontrados em pacientes com cancro seropositivos e seronegativos e dadores saudáveis ​​foram distribuídos ao longo de toda a sequência da proteína p53. Certos peptídeos como # 9, # 13 e # 26 induzida

+ respostas de células T CD4 mais frequentes em 4 (20% dos que responderam), 6 (30%) e 7 (35%) doadores, respectivamente. Alguns pacientes com câncer seronegativos e doadores saudáveis ​​mostrou múltiplas específicas do epitopo CD4

respostas de células T +, como visto em pacientes com câncer de soropositivos. A considerar o polimorfismo frequentemente observada em um códon 72, foi utilizada uma mistura de dois péptidos variantes de péptido # 6 (Tabela S1), que poderia induzir

de novo

respostas em indivíduos com genótipo homozigoto p53 em um códon 72. no entanto, nenhuma resposta das células T contra os péptidos # 6 foi detectado neste estudo, indicando que o protocolo de cultura de curto prazo, não parecem induzir

de novo

CD4 respostas de células T +

. A magnitude das respostas e distribuição de epítopos foram semelhantes em pacientes com câncer e em indivíduos saudáveis. é bem conhecido que os epítopos reconhecidos por anticorpos específicos de p53 estão limitados a N-terminal e a região C-terminal da proteína, [35] [32]. No entanto, não houve correlação entre os mapas de epitopos para células CD4

+ células T e de anticorpos (Figura 4). Além disso, a mutação da proteína p53 em células de cancro é frequentemente encontrada na região central do gene de [32]. No entanto, não houve sobre-representação de epitopos CD4

+ células T nesta região, sugerindo que as respostas não foram mediadas por reactividade cruzada de mutada específicos de péptidos CD4

+ células T. Para encontrar-mutação específica CD4

+ células T em três pacientes com tumores que expressam p53 mutado, as células T CD4

+ T de pacientes foram presensitized com péptidos contendo mutação cognata dos pacientes. Apesar de um paciente cujo tumor tinha mutação S127F mostraram fracas

+ respostas de células T CD4 + contra ambos os péptidos de tipo selvagem mutadas e correspondentes, não significativa específicos de mutação CD4

+ resposta de células T pode ser detectada (dados não mostrados).

A magnitude de CD4

+ respostas de células T em pacientes com câncer ovariano com ou sem anticorpos séricos específicos de p53 e os doadores saudáveis ​​contra péptidos sobrepostos p53 é traçado. Cada símbolo representa um indivíduo. Todas as respostas foram mostrados significativa, em comparação com o número de manchas de fundo. 6/12 soropositivos (símbolos rosa) e 5/10 soronegativos (símbolos azuis) pacientes com câncer ovariano e 9/12 indivíduos saudáveis ​​(símbolos preto) mostrou CD4 positiva

+ T respostas das células contra as células-alvo pulsadas com péptido p53 em comparação com não pulsados células-alvo.

Origem do repertório de específico da p53 CD4

+ células T

em contraste com a detecção de células T CD4 + específicos da p53 em soropositivos e pacientes com câncer seronegativos assim como em dadores saudáveis, o nosso protocolo presensitization só permite a detecção de-NY-ESO 1-específica do IFN-γ produzir CD4

+ células T in-1 NY-ESO doentes com cancro seropositivos mas não em pacientes com cancro seronegativos e saudável quando os indivíduos de PBMC derivadas de toda CD4

+ células T são presensitized com NY-ESO-1 péptidos sobrepostos. No entanto, recentemente relataram que NY-ESO-1-específica CD4

+ células T pode ser induzida a partir de CD45RA

+ naïve CD4

+ T células em dadores saudáveis ​​após

in vitro

presensitization removendo CD25

+ células T reguladoras [36], [37]. Estes resultados indicam que o NY-ESO-1-específica CD4

+ T precursores de células presentes em indivíduos saudáveis ​​são susceptíveis de supressão por células T reguladoras, mas em doentes com cancro,

In vivo

-primed NY-ESO células específicas -1-CD4

+ T tornam-se resistentes a esta supressão [36], [37]. Detecção de IFN-γ secretoras de CD4 específica à p53

sup + de células T em indivíduos saudáveis ​​após uma única

In vitro

sensibilização na presença de células T reguladoras sugere que eles já estão preparados

In vivo

. Para determinar o status de ativação de específico da p53 CD4

células + T em dadores saudáveis, naïve e experientes-antigénio CD4

células + T foram separados com base na expressão de CD45RA e foram estimulados com péptidos p53 sobreposição. A indução de CD4 específica à p53

+ células T foi avaliada por meio de ensaios ELISPOT. Tal como mostrado nas Figuras 5A e 5B, em contraste com o que tinha sido observado com NY-ESO-1-específica CD4

+ células T, específica de p53 IFN-γ produzir CD4

+ células T eram detectáveis ​​a partir de uma CD45RA

– população antígeno-experiente de doadores saudáveis. Além disso, as respostas menores foram também induzidas a partir de CD45RA

+ população de células T ingénuas (Figura 5A). Porque CD45RA não é um marcador absoluto para células T naive, ainda há a possibilidade de que

+ células T CD4 específicas de p53 no + população de células CD45RA

T já foram ativados

in vivo

[ ,,,0],38]. No entanto, este resultado indica que pelo menos uma parte específica do p53 CD4

+ células T foram preparadas

in vivo

mesmo em indivíduos saudáveis.

(A-B)

In vivo

priming de específico da p53 CD4

+ T em indivíduos saudáveis. CD4

+ CD45RA

+ ingênua e CD4

+ CD45RA

– células T antígeno-experiente foram isoladas por citometria de fluxo e presensitized com péptidos p53 sobrepostas. Após 20 dias, as células T específicas para p53-IFN-y produzindo foram avaliados por meio de ensaios ELISPOT. Autólogo t-APCs foram usados ​​como APCs. (C) O reconhecimento da proteína p53 naturalmente processado.

+ linhas de células T específicas de p53 CD4 contra p53 # 1- # 15 peptídeos piscina ou # 16 # 30 peptídeos piscina foram estabelecidas a partir de 3 dadores saudáveis ​​como descrito em materiais e métodos. Eles foram estimuladas por autólogo MO-DC pré-pulsadas com os péptidos de p53, p53, proteína ou proteína NY-ESO-1. a produção de IFN-γ foi avaliada por meio de ensaios ELISPOT (esquerda) e ELISA (à direita). As barras de erro representam SD de poços duplicados.

Caracterização de

+ células T CD4 específicas de p53

Para melhor caracterizar

+ células T específicas de p53 CD4 em indivíduos saudáveis doadores, linhas de células T específicas para p53 foram gerados isolando CD154 expressando CD4

+ células T após re-estimulação com péptidos de p53, seguido por expansão policlonal com PHA (dados não mostrados). Este método baseia-expressão de CD154 foi utilizado para detectar múltiplos CD4

+ subconjuntos de células T para a análise de citoquina produzindo padrão [28]. Quatro linhas de células T +

CD4 foram gerados contra as reuniões de péptidos p53 a partir de 3 dadores saudáveis. Todos

+ linhas de células T CD4 + produzidas especificamente GM-CSF, que é produzido a partir de ambas as células Th1 e Th2, depois da estimulação com péptido-pulsado MO-DC (Tabela 1). Os níveis de outras citoquinas produzidas por células T CD4

+ linhas de células T são mostrados na Tabela 1. Em conformidade com a detecção eficiente de específico da p53 CD4

+ células T por ensaios ELISPOT de IFN-gama, todos CD4 específica à p53

+ linhas de células T de dadores saudáveis ​​produziu grandes quantidades de IFN-γ. Em adição ao IFN-γ, níveis significativos de IL-13 e as pequenas quantidades de IL-4 também foram produzidas especificamente, indicando que as linhas das células T eram uma mistura de células Th1 e Th2. Duas linhas celulares T CD4

+ T produzidos pequenos níveis de citocina imuno-reguladora, a IL-10. Uma CD4

linha + de células T produzidas pequenas mas significativas dos níveis de IL-9, o qual é produzido por Th9 e é regulada por IL-4 e TGF-β, potencialmente, indicando a presença de sinalização de TGF-β durante a diferenciação de p53 espec�ico CD4

células + T. No entanto, a produção de TGF-β não foi detectada no sobrenadante (dados não mostrados). Além disso, a IL-17, que é produzida por Th17, não foi detectada em qualquer CD4

linhas de células T + (dados não mostrados). Em seguida, o reconhecimento da proteína p53-processado naturalmente foi investigada usando autólogo MO-DC como APCs. Como mostrado na Figura 5C, todos CD4

+ linhas de células T eficientemente reconhecida células alvo pulsadas com proteína p53 como detectado pela secreção de IFN-γ. Este resultado demonstra específico da p53 CD4

+ células T detectável em dadores saudáveis ​​são capazes de reconhecer a proteína p53 naturalmente processados ​​e torna improvável que eles são ativados

in vivo

por outras proteínas com sequências semelhantes.

Discussão

a acumulação da proteína p53 mutado em tumor é frequentemente observada em muitos tipos de tumores e induz respostas imunes humoral, demonstrando forte imunogenicidade de p53 [12]. Assim, a p53 foi considerada um alvo promissor para a vacinação contra vários tipos de cancro. No entanto, relatamos aqui a incapacidade de detectar

in vivo

-primed específico da p53 CD8

+ T respostas de células em pacientes com câncer com anticorpos espontâneas para p53, bem como em pacientes p53 soronegativos e em dadores saudáveis usando o nosso

in vitro

protocolo de sensibilização único. Em contraste, o mesmo protocolo de frequência detectado

+ células específicas do NY-ESO-1 CD8 T em doentes de cancro de NY-ESO-1-seropositivos na mesma coorte de estudo, indicando que a imunogenicidade natural para induzir CD8 espontânea

+ respostas de células T pode ser diferente em p53 e NY-ESO-1, mesmo em doentes seropositivos para estes antigénios. Foi relatado que, apesar de ciclina específico-B1 CD8

+ células T tornou-se detectável após um curto única

in vitro

estimulação, específico da p53 CD8

+ T células contra 6 HLA-A * 02 vinculativo péptidos não podia ser detectada em 5 ciclina B1-reactivo e 5 pacientes não reactivos utilizando o mesmo método de [39]. Nossos resultados expandir as suas observações por meio do monitoramento respostas

+ células T CD8 para toda a região da proteína usando péptidos sobrepostos e incluindo com immunomonitoring do anticorpo espontânea e CD4

respostas de células T +.