Sumário

Berberina foi identificado com efeitos anti-proliferativos em diversas células cancerosas. Muitos pesquisadores têm tentado elucidar os mecanismos anti-câncer de berberina com base em genes diferencialmente expressos. No entanto, os genes diferencialmente splicing alternativos induzidas por berberina também pode contribuir para suas ações farmacológicas e ainda não foram relatados. Além disso, o potencial funcional cruzada conversa entre os dois conjuntos de genes merece maior exploração. Neste estudo, a tecnologia de RNA-SEQ foi utilizado para detectar os genes expressos diferencialmente e de genes diferencialmente splicing alternativos em células cancerosas BEL-7402 induzidas pela berberina. Análise de Enriquecimento de funcional indicou que estes genes foram enriquecidas principalmente na via de sinalização de p53 e ciclo celular. Além disso, foi estatisticamente provado que os dois conjuntos de genes foram co-localmente enriquecido ao longo de cromossomas, intimamente ligados uns aos outros com base na interacção proteína-proteína e funcionalmente semelhante na árvore Gene ontologia. Estes resultados sugeriram que os dois conjuntos de genes regulados pela berberina pode ser funcionalmente cruzada falado e contribuem em conjunto para prender o seu efeito ciclo celular. Ele forneceu novas pistas para futuras pesquisas sobre os mecanismos farmacológicos de berberina, bem como as outras drogas botânicos

Citation:. Sheng Z, Sol Y, Zhu R, Jiao N, Tang K, Cao Z, et al . (2015) Funcional Cross-Falando entre genes diferencialmente expressos e splicing alternativo em células de câncer de fígado humano tratado com Berberina. PLoS ONE 10 (11): e0143742. doi: 10.1371 /journal.pone.0143742

editor: Emanuele Buratti, Centro Internacional de Engenharia Genética e Biotecnologia, ITALY

Recebido: 14 de maio de 2015; Aceito: 09 de novembro de 2015; Publicação: 25 de novembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Sheng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado parcialmente pelo Programa de Pesquisa e Desenvolvimento de alta Tecnologia Nacional ( “863” Programa) da China (2012AA020405) eo Financiamento do Ministério da saúde (2012ZX10005001). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

abreviações : DASG, genes diferencialmente Alternativa emendados entre duas amostras; °, Genes diferencialmente entre duas amostras

Introdução

O splicing alternativo extraído é um processo fortemente regulado durante a expressão do gene que podem produzir formas diferentes de uma proteína a partir do mesmo gene. Além disso, foi provado que o splicing alternativo pode também determinar as propriedades de ligação, localização intracelular, actividade enzimática, a estabilidade da proteína e modificações pós-tradução de um grande número de proteínas [1]. Nos últimos anos, os investigadores mais e mais farmacológicas descobriram que pequenas drogas moleculares pode exercer os seus efeitos farmacológicos, não só através de regulação dos níveis de transcrição de genes, mas também através da alteração do gene splicing alternativo [2].

Berberina, uma quaternário isoquinolina alcalóide isolado a partir de espécies Berberis [3], tem um largo espectro de efeitos farmacológicos, tais como anti-microbiana, anti-diabetes e anti-inflamação [4]. Clinicamente, ele tem sido utilizado para tratar uma variedade de desordens, incluindo doenças da artéria coronária, diabetes, esteatose hepática não-alcoólica, hiperlipidémia, síndrome metabólico, a obesidade e síndrome do ovário policístico (https://www.clinicaltrials.gov/). Recentemente, estudos acumulando descobriram que a berberina também possuía potente atividade antitumoral, com poucas ou efeitos tóxicos mínimos indesejadas [5, 6]. Por isso, muitos pesquisadores vêm tentando elucidar os mecanismos anti-câncer de berberina com base na expressão diferencial de genes. Por exemplo, relata-se que a berberina pode induzir apoptose em células HepG2 através de via mitocondrial mediada por AMPK, aumentando a proporção de Bax /[7] Bcl-2. Em nosso estudo anterior, também descobriram que a berberina poderia induzir parada do ciclo celular G1 em células BEL-7402 parcialmente através de perturbar a interação de calmodulina com CaMKII e bloqueando a degradação da proteína p27 subsequente. [8]

Embora estes trabalhos têm fornecido alguns conhecimentos fundamentais sobre o mecanismo anticancerígeno de berberina, splicing alternativo em células cancerosas depois de tratados com berberina ainda não foi relatado. Em primeiro lugar, tem sido implicado que muitos fármacos anticancerígenos poderia inibir o crescimento de células cancerosas através da alteração do gene splicing alternativo [9-11]. Além disso, é relatado que a transcrição do gene e o splicing alternativo pode ser fisicamente e funcionalmente acoplado [12, 13], deste modo, contribuir em conjunto com as acções farmacológicas destas drogas. Portanto, é necessário medir simultaneamente os genes diferencialmente expressos (degs) e os genes diferencialmente com splicing alternativo (DASGs) em células de cancro após tratamento com a berberina e analisar sistematicamente se existe qualquer tipo de funcional cruzada falando entre estes dois conjuntos de genes .

para a questão mencionada acima, a mais recente tecnologia de sequenciamento de próxima geração (RNA-seq) foi usado para obter o perfil transcriptomic de células BEL-7402 após o tratamento berberina. Em seguida, os degs e DASGs induzidas por berberina foram cuidadosamente detectado por um conjunto de ferramentas de análise de sequência. Finalmente, o crosstalk funcional entre essas degs e DASGs Foram analisados ​​estatisticamente e suas possíveis contribuições para o efeito anticancerígeno de berberina foram discutidos.

Materiais e Métodos

cultura celular

A linha de células de câncer de fígado humano estabelecido (BEL-7402, Cat. no .: TCHu_10) [8, 14, 15] foi comprado e depositados no banco de células do Instituto de Bioquímica e Biologia celular, Instituto Xangai de Ciências Biológicas, chinês Academy of Science (https://www.cellbank.org.cn/) e gentilmente cedido pelo Dr. Xuan Liu (Instituto de Shanghai de Materia Medica, Academia chinesa de Ciências, Xangai, República Popular da China). As células foram mantidas numa atmosfera humidificada a 37 ° C que contém 5% de CO

2 e cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, EUA) suplementado com soro de bovino fetal a 10%, 2 mM /L-glutamina, 50 unidades /ml de penicilina e 50 mg /ml de estreptomicina. Neste estudo, foram reunidas 3 ~ 5 repetições biológicos para uma experiência de RNA-Seq para atingir a mesma quantidade de conteúdo de ARN total. Mais especificamente, na secção de cultura de células, as células cancerosas em 8 ~ 10 diferentes placas de Petri foram divididos em dois grupos iguais. Um grupo foi usado como grupo de berberina tratado, o outro foi usado como grupo de controlo /não tratada.

isolamento de ARN

Para a extracção do ARN total, as células foram plaqueadas em placas de 10 cm (Corning, Acton, MA, EUA) em meio completo durante 12 h. Em seguida, 50