Abstract

é a única isoforma UGT1A expressos no tecido pulmonar. Ele é responsável pela desintoxicação de substâncias cancerígenas, como benezo [a] pireno da fumaça do cigarro. O objetivo deste estudo foi avaliar a associação de polimorfismos UGT1A6 e haplótipos com o risco de câncer de pulmão e para avaliar o significado funcional de polimorfismos UGT1A6. O ADN genómico foi isolado a partir de leucócitos. Oito polimorfismos UGT1A6 foram sequenciados em um conjunto de teste de 72 pacientes com câncer de pulmão chineses e 62 controles saudáveis. alelos modificando risco potencial foram validados em um conjunto separado de 95 pacientes com câncer de pulmão chineses e 100 controles saudáveis. UGT1A6 19T G, 541A G e 552A C mostrou associação significativa com o aumento do risco de câncer de pulmão, enquanto UGT1A6 105C T e mutação IVS1 + 130G T foram significativamente associados com o risco de câncer de pulmão reduzida. A análise de regressão logística multivariada demonstrou uma associação significativa de câncer de pulmão com UGT1A6 541A G (OR: 3,582, IC 95%: 1,27-10,04, p = 0,015), 552A C (OR: 5,364, IC 95%: 1,92-14,96, p = 0,001) e mutação IVS1 + 130G T (OR: 0,191, IC 95%: 0,09-0,36, p 0,001). teste funcional demonstrou que UGT1A6 105C T aumentou a estabilidade do mRNA, fornecendo uma explicação plausível para a sua associação com o risco de câncer de pulmão reduzida. Assim polimorfismos UGT1A6 podem ser usadas para identificar pessoas com risco aumentado de desenvolvimento de cancro do pulmão

citação:. Kua L-M, Ross S, Lee S-C, Mimura K, Kono K, Goh B-C, et ai. (2012) UGT1A6 Polimorfismos Modulada Lung Cancer Risk na população chinesa. PLoS ONE 7 (8): e42873. doi: 10.1371 /journal.pone.0042873

editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Porto Oncology, Portugal |

Recebido: 12 Março, 2012; Aceito: 12 de julho de 2012; Publicação: 17 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Kua et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pelo Grupo Nacional de Saúde (Singapura) pequena subvenção inovador [NHG-SIG /06007]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é responsável por mais de 85% dos cancros do pulmão primário e aproximadamente dois terços dos pacientes com NSCLC são diagnosticados em estágio avançado. O tabagismo tem sido associada ao câncer de pulmão [1] – [4], e mais de 60 substâncias cancerígenas foram identificados na fumaça do cigarro [5] – [7]. Destes, benzo [a] pireno (PAB) e 4- (metilnitrosamino) -1- (3-piridil) -1-butanona (NNK) são os mais estudados. activação metabólica de BaP e NNK por enzimas do citocromo P450 resulta na formação de metabolitos reactivos que mais se pode ligar covalentemente ao DNA, um passo importante na indução de cancro do pulmão [8] – [10].

Os diphosphoglucuronosyltransferases uridina ( UGTs) pertencem a uma superfamília de enzimas metabolizadoras responsáveis ​​para desintoxicar numerosos endobióticos xenobióticos e [11]. UGTs são responsáveis ​​pela desintoxicação de BaP e NNK [12] – [15]. Baixa actividade glucuronidação tinha sido implicado na susceptibilidade a cancro pulmonar [16]. Além disso, polimorfismos genéticos em UGTs têm correlacionado com o risco ea incidência de diferentes tipos de câncer, incluindo câncer de pulmão [12], [17] – [20]. Entre todas as isoformas UGT1A, UGT1A6 tinha sido mostrado ser a única isoforma UGT1A expressos no tecido pulmonar [21].

Nossa hipótese é que polimorfismos no UGT1A6 pode afetar a capacidade de desintoxicar cancerígenos câncer de pulmão e modular o risco de câncer de pulmão . Aqui, apresentamos os resultados de um estudo de caso-controle utilizando 2 coortes diferentes e funcionalmente caracterizada UGT1A6 105C . Polimorfismo T

in vitro

Materiais e Métodos

População do estudo

foram analisados ​​um total de 167 casos de câncer de pulmão chineses e 162 controles saudáveis ​​chineses a partir de 2 coortes independentes. O primeiro grupo composto por 72 pacientes com câncer de pulmão e 62 controles saudáveis, da Cancer Center e doação de sangue Center a partir do National University Hospital, Singapura, respectivamente. Uma segunda coorte consistiu de 95 pacientes com câncer de pulmão e 100 controles a partir de 4 estudos clínicos e foi usado como conjunto de validação. Os sujeitos deste grupo eram pacientes de câncer de pulmão a partir de dois estudos de fase terapêutica II (n = 44 e 14, respectivamente) e um estudo de biomarcadores germinativas (n = 37) e controles sem câncer elegíveis a partir de um estudo caso-controle de câncer colorretal familiar na Cingapura. O protocolo do estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional etnias no Hospital National University, Singapura, e todos os assuntos estudo forneceu consentimento informado por escrito.

Dados coleção

No primeiro grupo, sujeitos do estudo foram entrevistados pessoalmente por treinados profissionais médicos que usaram um questionário estruturado. informações demográficas, incluindo idade, sexo, tabagismo, maços de tabaco e tipo celular histológico foi coletado para todas as disciplinas. Informação semelhante para a segunda coorte foi recuperado a partir de registros de casos e informações sobre o estado de fumar para os controles não foi obtido. tabagismo foi categorizado em não-fumante, ex-fumante e fumante atual. tipos de células histológicos foram classificados em três grupos, a saber, o adenocarcinoma, o carcinoma de células escamosas e carcinoma pouco diferenciado.

Single Nucleotide Polymorphism (SNP) genotipagem

Oito SNPs que eram relativamente comum na população asiática com base na pesquisa bibliográfica passado, foram selecionados para este estudo. Dos quatro variantes do exão 1, três foram codificação (cSNPs), resultando em alterações de aminoácidos, UGT1A6 19T G (S7A), 541A G (T181A) e 552A C (R184S), ao passo que UGT1A6 105C T era um sinónimo variante. A sequência de três restantes variantes na região reguladora 5 ‘incluiu 2 SNPs, UGT1A6 -556C T e -427G C, e uma mutação de deleção -1.310–1.306 excluir (AGGAG). UGT1A6 variante intrônica mutação IVS1 + 130G . T também foi estudada

Genomic ácido desoxirribonucléico (DNA) foi extraído de frações revestimento buffy utilizando o kit de purificação de DNA Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN, EUA). A qualidade e quantidade de DNA foram avaliadas por NanoDrop (ND-1000 Spectrophotometer). Todos DNA tem uma A

260 /A

280 proporção de 1,7-1,9. A genotipagem foi realizada utilizando pirossequenciao. Para os ensaios de pirossequenciao, um positiva e um controlo negativo foram incluídos em cada placa de 96 poços. Resumidamente, os iniciadores foram desenhados com base na sequência UGT1A6. Os iniciadores de PCR e iniciadores de sequenciação foram projetados usando pirossequencia�o Assay Design de Software (versão 1.0.6: Biotage AB, Uppsala, Suécia). análise BLAST foi realizada para confirmar a especificidade dos iniciadores para cada exão. Detalhes das sequências de iniciadores e as condições de PCR estão listadas na Tabela S1. 250 ng de ADN genómico a 50 ng /mL foi utilizado para cada reacção de PCR e os produtos de PCR foram então submetidos a pirossequenciao com Device ID PyroMark ™ (pirossequenciao, Uppsala, Suécia). etapas de validação foram realizadas por reacções de sequenciação direta utilizando o ABI Big Dye PRISM® ™ terminator v 3.1 ciclo de sequenciação química

plasmídeo constrói

Estudos funcionais sobre polimorfismos nonsynonymous (UGT1A6 19T . G, 541A G e 552A C) ter sido feito, enquanto mutação IVS1 + 130G T é um SNP intrônica, portanto, foram selecionados UGT1A6 105C T, que é um polimorfismo sinônimo para o nosso teste funcional. Para avaliar se UGT1A6 105C T tem qualquer impacto na actividade UGT1A6, a variante 105TT foi gerado. Resumidamente, o plasmídeo vector de codificação de comprimento completo UGT1A6 * 1 sequência foi gentilmente cedido pelo Dr. Michael H. Tribunal (Escola de Medicina da Universidade Tufts, em Boston, Massachusetts). A região de codificação UGT1A6 foi subclonado em pcDNA 3.1 V5 /His expressão Topo vector plasmídico (Invitrogen). análise BLAST foi realizada para confirmar a sequência do plasmídeo UGT1A6. O plasmídeo foi então utilizado como molde para gerar substituição no nucleótido 105, utilizando o GeneEditor

in vitro dirigida ao local

sistema de mutagénese (Promega) com o iniciador indicado 105CT (5′-5Phos /CCC TCA GGA TGG AAG CCA C-3 ‘) e iniciador inferior Strand (fornecida). Todas as construções de DNA foram verificadas por análise de sequenciação. Resumidamente, as células HEK293 foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com soro bovino fetal a 10% e 50 U /mL de penicilina (Gibco) numa atmosfera humidificada de dióxido de carbono a 5% a 37 ° C. transfecções estáveis ​​de plasmídeo nas células HEK293 foram realizadas utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen) numa proporção de reagente de ADN de 3:01 em Opti-MEM® I Reduced Serum Medium (Gibco). Todas as experiências de transfecção foram realizadas em triplicata.

estabilidade RNA ensaio

A seguir, examinou o possível efeito da variante UGT1A6 105TT na estabilidade do mRNA. 10 ug /ml de actinomicina D (Sigma) foi aplicada às culturas de células cresceram durante a noite e as células foram colhidas em intervalos seleccionados até 24 horas. O Além disso Rneasy Mini Kit (Qiagen) foi usado para extrair o ARN total a partir de células transfectadas, antes e após a incubação com actinomicina D.

A quantificação de transcritos

O ARN foi isolado a partir de 5 × 10

5 células nos tempos indicados (0, 2, 4, 8 e 24 horas) após o tratamento com ActD e foram transcrito reversamente em ADNc utilizando SuperScript III (Invitrogen). A reacção de PCR foi então levada a cabo, compreendendo o seguinte: 1 uL de ADNc, 10 uM de cada um dos iniciadores (UGT1A6: 5′-cagctgtcctcaagagagatgtgga-3 ‘e 5′-ccaatgaagaccatgttgggc-3′, GAPDH: 5’-tgaaggtcggagtcaacggatttggt-3 ‘e 5 ‘-catgtgggccatgaggtccaccac-3’) e 2 × Poder master Mix SYBR Green (que incluem SYBR corante verde, Taq Polymearse, ROX e dNTP) num volume final de 20 ul. As células transfectadas com vector vazio foi utilizado como controle, com os dados normalizados pela expressão GAPDH. Todas as reacções de PCR foram realizadas em triplicado.

Western blotting

Examinámos ainda mais o efeito da variante UGT1A6 105TT sobre a estabilidade da proteína. As células tratadas foram lisadas e as concentrações da proteína foram medidas. Proteínas (7,5 ug /poço) foram resolvidos por 4 a 15% de electroforese em gel de gradiente de SDS-poliacrilamida (Invitrogen), seguido por transferência para um fluoreto de polivinilideno (PVDF) da membrana microporosa (Millipore, Billerica, MA, EUA) bloqueados em PBS com 5% leite. Após o bloqueamento, a membrana foi sondada usando um anticorpo de coelho anti-humana anticorpo primário diluído UGT1A6 1:1000 (WB-UGT1A6; BD Gentest, Woburn, MA) e um anti-coelho de rábano anticorpo secundário conjugado com peroxidase de cabra (1:10,000 diluída) . As manchas foram fotografadas pela reagentes ECL (ECL Prime, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suécia) e pelo processador de filme (Konica SRX 101). Os resultados são de duas experiências independentes.

Ensaio Enzimático

A serotonina foi usada como substrato, uma vez que demonstraram especificidade para o substrato para UGT1A6 [22], [23], no entanto, uma metodologia diferente plataforma foi utilizado em este estudo. 0,01 mg de proteínas foi submetido a 384 poços placa preta (Corning, NY) com Transcreener ® HTS intensidade de fluorescência (FI) estojo de ensaio (Bellbrook Labs, Madison, WI). Cada reacção da enzima foi realizada com os seguintes elementos: 50 mM de HEPES (pH 7,5), contendo NaCl (100 mM), MgCl

2 (4 mM), EGTA (2 mM), 0,01% de Brij-35, ditiotreitol (DTT ; 2 mM), DMSO (1%), UDPGA (5 mM) e com várias concentrações de serotonina (Sigma) 0,5-30 mM num volume final de 25 ul. A placa foi incubada à temperatura ambiente durante 45 minutos e as reacções foram interrompidas pela adição de 25 uL de metanol arrefecido em gelo. A placa foi então lida num leitor de placas Tecan Infinito M200. Todas as reacções enzimáticas foram realizadas em triplicado. As leituras iniciais foram convertidos para a quantidade de UDP formada utilizando o GraphPad Prism para interpolar estes valores a partir das curvas padrão UDPGA /UDP. curvas de Michaelis-Menten foram gerados utilizando o GraphPad Prism. Dados representados são de duas experiências independentes e os resultados são apresentados como a média ± S.D. de triplicados.

Análises Estatísticas

diferenças de caso-controle nas características basais foram avaliados utilizando testes t (para variáveis ​​contínuas) e testes de qui-quadrado (para variáveis ​​categóricas). odds ratio (OR) foram obtidos a partir do teste do qui-quadrado, e intervalos de 95% de confiança (IC) da OU foram dadas. A associação entre SNPs com a idade, sexo, tabagismo e estágios TNM foram testados em indivíduos com cancro do pulmão por meio do teste do qui-quadrado. Todas as análises estatísticas, incluindo a análise de regressão logística uni e multivariada foram realizadas usando SPSS versão 11.5 (SPSS Inc., Chicago, Ill., EUA). teste de equilíbrio de Hardy-Weineberg, análise de desequilíbrio de ligação (indicado como D ‘) e análise de haplótipos de caso-controle (teste de permutação) foram calculados utilizando SNPAlyze ver.7.

Resultados

Características dos pacientes e controles

As características basais dos pacientes e controles de ambos os grupos de câncer de pulmão estão resumidos na Tabela 1. Houve uma diferença estatisticamente significativa na idade, sexo e tabagismo entre pacientes com câncer de pulmão e os controles saudáveis, com mais masculino (p = 0,003) e fumantes (p 0,001) no grupo de câncer de pulmão. Em comparação com controles saudáveis, os pacientes com câncer de pulmão, eram geralmente mais velhos (p = 0,04). Adenocarcinoma foi o tipo histológico mais comum, representando 60% em pacientes com câncer de pulmão. Não houve diferença significativa nas características basais dos pacientes com câncer de pulmão e os controles saudáveis ​​entre os testes e validação coortes (dados não mostrados).

Genótipo e alélicas freqüências de polimorfismos UGT1A6 (Tabela 2)

dos oito SNPs genotipados, cinco foram significativamente associados com o risco de câncer de pulmão, quando testado na primeira coorte composta por 72 pacientes com câncer de pulmão e 62 controles. UGT1A6 19T G, 541A G e 552A C foram associados com risco aumentado de câncer de pulmão, enquanto que UGT1A6 105C T e mutação IVS1 + 130G T foram inversamente associados com o risco de câncer de pulmão. UGT1A6 19T G, 541A G e 552A C eram comuns em pacientes com câncer de pulmão com freqüências alélicas menores de 38%, 45% e 48%, respectivamente

Estes 5 SNPs foram ainda avaliadas no segundo coorte constituída. de 95 pacientes com câncer de pulmão chineses e 100 controles incomparáveis ​​chineses. UGT1A6 19T G, 541A G e 552A C permaneceu associado ao aumento do risco de câncer de pulmão, e UGT1A6 105C T e mutação IVS1 + 130G T permaneceu significativamente associado com o risco de câncer pulmonar reduzida

Determinação de fatores associados. de forma independente com câncer de pulmão: univariada e multivariada

Para determinar os fatores associados ao risco de câncer de pulmão, usado pela primeira vez análise uni e identificou os seguintes fatores: idade, sexo, tabagismo, e cinco SNPs (Tabela 3). Após o ajuste para co-variáveis ​​identificadas por análise univariada usando análise multivariada encontramos apenas tabagismo (OR: 3,385, IC 95%: 1,86-6,15, p 0,001), UGT1A6 541A G (OR: 3,582, IC 95%: 1,27-10,04 , p = 0,015), 552A C (OR: 5,364, IC 95%: 1,92-14,96, p = 0,001) e mutação IVS1 + 130G T (OR: 0,191, IC 95%: ,09-,36, p 0,001) foram fator preditivo independente para o risco de câncer de pulmão.

Hardy-Weinberg, Desequilíbrio de Ligação (LD) e análise de haplótipos

Uma análise mais aprofundada do conjunto de polimorfismos de DNA que são herdados juntos, também conhecido como haplótipos foi realizada com o seguinte results.UGT1A6 19T G e mutação IVS1 + 130G T mostrou desvio significativo do equilíbrio de Hardy-Weinberg nos controles. UGT1A6 552A C foi em estreita LD com UGT1A6 541A G (D ‘= 0,9706, r

2 = 0,7795) em pacientes com câncer de pulmão. alelo UGT1A6 105C foi fortemente ligada à UGT1A6 541G e alelo 552A no controle (Tabela 4). A Tabela 5 resume as frequências de haplótipos de comparações de caso-controle a partir de testes de permutação. UGT1A6 541A G foram excluídos desta análise porque foi em estreita LD com 552A C. Dez haplótipos únicos poderia ser inferida utilizando 4 risco modificando alelos, com dados censurados na frequência de 1%.

Entre estes, cinco haplótipos mostrou valor p significativo no teste de permutação, dos quais , três foram associados com risco aumentado de câncer de pulmão. Haplótipo # 2 contendo dois alelos de risco de UGT1A6 19G e 552C apresentaram maior OR de 13,57 (IC 95%: 6,15-29,93) em comparação com haplótipo # 4 (OR: 2,65, 95% CI: 1,26-5,59) contendo um alelo risco de UGT1A6 552A e haplótipo # 6 (OR: 2,35, 95% CI: 1,23-4,48), contendo dois alelos de risco de UGT1A6 19G e 552C, e um alelo ‘proteção’ da UGT1A6 intron 1 + 130T. Dois haplótipos foram associados com o risco de câncer pulmonar reduzida, incluindo haplótipo # 3 (OR: 0,23, 95% CI: 0,12-0,43) e haplótipo # 7 (OR: 0,13, 95% CI: 0,04-0,44).

In vitro caracterização funcional da variante UGT1A6 105TT

In vitro

, estabilidade do mRNA foi testado depois de bloquear a transcrição por tratamento de células com actinomicina D (ActD). Variante UGT1A6 105TT ARNm era mais estável do que o tipo selvagem, com significativamente mais elevado nível de ARNm observados 4 horas (p = 0,039) e 8 horas (p = 0,004) após o tratamento com ActD (Figura 1A). O aumento da estabilidade da variante UGT1A6 105TT ARNm resultou em maior expressão da proteína e a actividade da enzima em comparação com o tipo selvagem às 48 horas após o tratamento com ActD (Figura 1B, C e D).

UGT1A6 e UGT1A6 * 1 105TT construções eram estavelmente transfectado para células HEK293. (A) células foram recolhidas após tratamento com ActD em tempo diferente apontar até 24 horas. Os dados representados são mudanças de curso de tempo na quantidade restante de mRNA UGT1A6 após o tratamento ActD. Havia significativamente mais elevado nível de ARNm em UGT1A6 105TT que UGT1A6 * 1 células transfectadas a 4 horas (p = 0,039) e 8 horas (p = 0,004) após o tratamento com ActD. (B) Análise de transferência de Western. O lisado celular foi utilizado a partir de 5 × 10

5 células nos tempos indicados (0, 8, 24 e 48 horas) após o tratamento com ActD. Houve um sub-regulação da expressão da proteína em UGT1A6 * 1 em comparação com a variante UGT1A6 às 48 horas após o tratamento com ActD. actividade UGT1A6 foi avaliada por avaliação da produção de glucuronido serotonina utilizando lisado de UGT1A6 variante (VT) e UGT1A6 * 1 (WT), a 0 hora (C) e 48 horas (D) após o tratamento ActD, com concentrações de substrato variou de 0,5 a 30 serotonina mM. As atividades são expressos como velocidade de reação (nanomoles de glucuronido serotonina formada por minuto por miligrama de proteína).

Discussão

Este é o primeiro estudo a descrever a associação entre polimorfismos UGT1A6 e pulmão Câncer. O gene UGT1A6 é responsável pela desintoxicação de substâncias cancerígenas, como BaP da fumaça do cigarro [13] – [15]. alterações quantitativas ou qualitativas na expressão de UGT1A6 pode afetar a taxa de glucuronidação, modificando assim o risco de desenvolver câncer de pulmão.

Vários polimorfismos têm sido relatados na região 5′-regulação, exão 1 e íntrons de UGT1A6 [24 ], [25]. Entre estes, três polimorfismos não-sinônimas nos codões 7, 181 e 184 (UGT1A6 19T G, 541A G e 552 C, respectivamente), colectivamente referidos como UGT1A6 * 2, foi o mais comumente estudada. É classificada como uma variante “baixa atividade” por vários compostos fenólicos, incluindo a aspirina [26] e está associada com a redução da adenoma colorretal em indivíduos a tomar a longo prazo aspirina [27].

Neste estudo, tivemos demonstraram que indivíduos com UGT1A6 * 2 (haplótipo # 2 e 6) tinha aumentado o risco de câncer de pulmão. A nossa descoberta foi consistente com um relatório da actividade glucuronidação reduzida em indivíduos com o UGT1A6 * 2 alelo em comparação com o tipo selvagem [26]. Krishnaswamy

et al

também demonstrou 50% mais baixos níveis de mRNA UGT1A6 (p = 0,026) em portadores de UGT1A6 19T . Polimorfismo G comparação com não portadores, mas sem efeito significativo sobre o teor de proteína UGT1A6 ou atividades glucuronização [24]. Deve notar-se que houve relatos contraditórios de, pelo menos, 2 estudos, sugerindo um aumento da actividade da enzima em UGT1A6 * 2 aloenzimas [28], [29]. No entanto, a atividade aumentou no allozyme variante UGT1A6 não se traduziu em aumento da depuração substrato em microssomas hepáticos humanos variantes [29]. É provável que para além da actividade enzimática, degradação do mRNA podem ser responsáveis ​​pela variabilidade de uma actividade UGT1A6

Dois polimorfismos UGT1A6 105C . T e mutação IVS1 + 130G T foram encontrados para ser associada com o risco de cancro do pulmão reduzida . O UGT1A6 105C T é um sinónimo de SNP que está localizado no exão 1 do gene UGT1A6. Embora o polimorfismo não resulta em modificação qualitativa da UGT1A6, a

In vitro

resultados demonstram que o alelo T está associada com o aumento da estabilidade do ARNm e actividade elevada UGT1A6 em proteína variante em comparação com o tipo selvagem. Isto pode explicar o efeito protetor do alelo UGT1A6 105 T na redução do risco de câncer de pulmão. Além disso, o efeito protector do UGT1A6 105C T pode ser devido à sua ligação inversa com UGT1A6 * 2 (UGT1A6 541A G e 552A C).

UGT1A6 mutação IVS1 + 130G T verificou-se ser a única SNP associado à diminuição do risco de câncer de pulmão em análise multivariada. Não está claro como UGT1A6 mutação IVS1 + 130G T modula o risco de câncer de pulmão, uma vez que está localizado na primeira região intrônica do gene UGT1A6. In silico utilizando o programa de análise Humana Splicing Finder (https://www.umd.be/HSF/) sugeriu que este SNP não afecta quaisquer nucleótidos conservadas do local de ramificação na região intrónica (dados não mostrados) e seria não deve afetar a atividade splicing

Embora não tenhamos encontrado UGT1A6 mutação IVS1 + 130G . T estar em desequilíbrio de ligação moderada com UGT1A6 541A G (denotado como UGT1A6 * 5), ela não pode explicar o efeito protetor observado. Enquanto UGT1A6 é a isoforma predominante UGT1A expressa no pulmão, outras isoformas UGT1A (UGT1A1 e 1A9) expressa no fígado podem ainda afectar depuração sistémica de substâncias cancerígenas associadas com o tabagismo [30], [31].

É possível que mutação IVS1 + 130G T podem estar em desequilíbrio de ligação com polimorfismos em outras isoformas UGT1A que desempenham um papel ‘protecção’ no risco de câncer de pulmão. . Por exemplo, Saeki

et ai demonstraram que a mutação IVS1 UGT1A6 + 130G T é em estreita LD com UGT1A9 * 22, um alelo alta actividade enzimática que é conhecido para aumentar a transcrição. Além disso, foi demonstrado UGT1A6 estar em desequilíbrio de ligação com UGT1A1 e UGT1A7 [33] – [36]. Embora não seja expresso no pulmão, estas isoformas da UGT foram demonstrou ser importante no apuramento de BaP [30], [31].

A força principal deste estudo é que a nossa descoberta foi validado em uma coorte independente. A análise foi restrita a um grupo étnico para minimizar a probabilidade de resultados falso-positivos devido à heterogeneidade da população. Há, no entanto, várias limitações em nosso estudo que nós reconhecemos. Em primeiro lugar, os pacientes com câncer de pulmão e os controles saudáveis ​​não foram pareados por idade, sexo e tabagismo. Em segundo lugar, dois SNPs, UGT1A6 19T G e mutação IVS1 + 130g T desviou da equação de Hardy Weinberg. O desvio da equação Hardy Weinberg podem ser causados ​​por erros de genotipagem [37], [38]. Nós tinha tomado medidas para excluir erro genotipagem usando tanto pyrosequencing e método de sequenciação directa para identificar os SNPs variantes em nossos sujeitos do estudo.

Em conclusão, este estudo sugere que polimorfismos UGT1A6 pode modular o risco de câncer de pulmão. UGT1A6 105C T foi demonstrada para aumentar a estabilidade do mRNA, fornecendo uma explicação plausível para a sua associação com o risco de câncer de pulmão reduzida. Nosso estudo sugere que UGT1A6 genotipagem pode ser integrado na estratégia de rastreio do cancro do pulmão para ajudar a identificar populações susceptíveis.

Informações de Apoio

Tabela S1. : Lista de PCR e iniciadores de sequenciação. Lista de todos os iniciadores utilizados para amplificar e a sequência de cada um dos oito UGT1A6 SNPs é mostrado, com os dados de SNP RSID e sua localização fornecida. O tamanho dos produtos de PCR e a temperatura de recozimento para cada reacção de PCR também são mostrados. primers biotinilados para pyrosequencing ensaio são indicados com §

doi:. 10.1371 /journal.pone.0042873.s001

(DOC)

Reconhecimentos

Agradecemos Dr.Michael H. Tribunal (Escola Tufts University of Medicine, de Boston, Massachusetts) por nos fornecer plasmídeo vector de codificação de comprimento completo UGT1A6 * sequência 1.