Abstract

Fundo

O carcinoma hepatocelular (HCC) é a forma mais comum de câncer de fígado e o terceiro principal causa de morte por câncer no mundo. O tratamento sistêmico único aprovado para o HCC irressecável é a via oral inibidor da quinase, sorafenib. Recombinante esfingomielinase ácida humana (rhASM), que hidrolisa esfingomielina a ceramida, é um medicamento órfão em desenvolvimento para o tratamento de doenças do tipo B de Niemann-Pick (NPD). Devido à natureza hepatotrópico de rhASM e sua capacidade de gerar ceramida pró-apoptótica, este estudo avaliou o uso de rhASM como um tratamento adjuvante com sorafenib em modelos experimentais de HCC.

Metodologia /Principais Achados

In vitro

, rhASM tratamento /sorafenib reduziu a viabilidade de Huh7 células de câncer de fígado mais do que o sorafenib.

In vivo

, utilizando um modelo de tumor Huh7 subcutânea, a sobrevivência do mouse foi aumentada e proliferação nos tumores diminuiu para um nível semelhante, tanto em sorafenib e grupos /tratamento sorafenib rhASM. No entanto, o tratamento /sorafenib rhASM combinado reduziu significativamente o volume de tumor, aumento da necrose tumoral, e diminuição do tumor densidade dos vasos sanguíneos em comparação com o sorafenib. Estes resultados foram obtidos apesar da fraca entrega de rhASM para os tumores. Um segundo modelo (ortotópico) de tumores Huh7 também foi estabelecida, mas a atividade modesta ASM foi igualmente detectada nestes tumores em comparação com fígados saudáveis ​​do mouse. É importante ressaltar que nenhuma toxicidade hepática ou perda de peso crônica foi observada com a terapia rhASM em qualquer modelo.

Conclusões /Significado

A combinação rhASM /sorafenib exibiu um efeito sinérgico na redução do volume do tumor e dos vasos sanguíneos densidade em xenoenxertos Huh7, apesar de uma actividade modesta de rhASM nestes tumores. Não há aumento significativo na sobrevivência foram observados a partir do tratamento /sorafenib rhASM. A pobre entrega de rhASM para tumores Huh7 pode ser devido, pelo menos em parte, a partir da expressão dos receptores de manose. A segurança ea eficácia desta abordagem, em conjunto com as novas conclusões sobre segmentação enzima, merece uma investigação mais aprofundada

Citation:. Savić R, Ele X, Fiel I, Schuchman EH (2013) recombinante esfingomielinase ácida humana como um adjuvante para sorafenib Tratamento do cancro do fígado Experimental. PLoS ONE 8 (5): e65620. doi: 10.1371 /journal.pone.0065620

editor: Alexander Arlt, Christian-Albrechts-Universidade de Kiel, Alemanha |

Recebido: 03 de fevereiro de 2012; Aceito: 02 de maio de 2013; Publicado em: 28 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Savić et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. NIH HD28607 . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a mais recente estimativa da American cancer Society para 2013 é que cerca de 30.640 pessoas seriam diagnosticados com primário de fígado e câncer do ducto biliar nos Estados Unidos, com cerca de 21.670 (71%) mortes relacionadas ao câncer. HCC é o (~ 90%) forma mais comum de câncer de fígado, frequentemente diagnosticada em estágios avançados da doença [1]. HCC é uma malignidade geneticamente heterogénea em que numerosas vias de sinalização desregulados levar a proliferação e a angiogénese elevada, incluindo RAF /MEK /ERK, PI3K /AKT /mTOR, WNT /β-catenina, IGF e HGF /c-met [2]. Até recentemente, as opções de tratamento para o avançado /irressecável HCC têm sido relativamente ineficaz e complicada pelo subjacente da hepatite e cirrose hepática. Em 2007, a FDA aprovou uma droga oral para HCC irressecável – sorafenib, um inibidor de molécula pequena multiquinase com uma atividade

in vitro

contra dezenas de serina /treonina (por exemplo, RAF) e tirosina quinases (por exemplo, VEGFR) em células de tumor e vasculatura [3], [4]. Em estudos clínicos principais, sorafenib proporcionou 2,8 meses melhor sobrevida no grupo de tratamento (10,7 meses mediana) em comparação com placebo (7,9 meses), formando a base da sua aprovação pela FDA [3], [5]. No entanto, apesar da eficácia clínica demonstrou, alguns pacientes com doença avançada, não respondem ao sorafenib e aqueles que têm um benefício finito [5]. Consequentemente, as investigações sobre tratamentos alternativos /suporte de drogas foram ganhando força [6].

Em contraste com HCC, NPD compreende uma família de doenças monogênicas raras ultra-com anormalidades genéticas e bioquímicas conhecidas. Por exemplo, mutações no

SMPD1

gene resultam na deficiência de atividade ASM, levando ao acúmulo de esfingomielina nos lisossomos e outros compartimentos celulares. Tipo A NPD é o neurodegenerativa, forma infantil da deficiência de ASM, geralmente fatal nos primeiros 2-3 anos de vida. Em contraste, Tipo B NPD carece de envolvimento neurológico e sobrevivência pode estar em final da infância ou na idade adulta, embora os indivíduos afetados frequentemente apresentam hepatoesplenomegalia progressiva e doença respiratória [7]. terapia de reposição enzimática com rhASM exógena recebeu estatuto de medicamento órfão para Tipo NPD B em [8] 2000 e foi testado com sucesso em uma fase I de ensaios clínicos em pacientes B NPD adultos Tipo (identificador clinicaltrials.gov NCT00410566). Um estudo de fase Ib doses repetidas está em andamento. A hidrólise de esf ingomielina por rhASM produz um altamente bioactiva e citocida lípido, ceramida, que é capaz de induzir supressão tumoral [9]. Sabe-se que a elevação de ceramida na superfície da célula re-organiza membrana celular sinalização plataformas, provavelmente induzir as alterações celulares a jusante, mas os mecanismos exactos subjacentes a estes efeitos permanece uma área activa de investigação [9].

Devido para os efeitos pró-morte de ceramida, as células cancerosas desenvolveram vários mecanismos de defesa para superar este lípido, incluindo a redução da produção e /ou depuração reforçada, ou produção elevada de a contrariar pró-sobrevivência lípido, esfingosina-1-fosfato (S1P). Estes mecanismos de defesa podem também contribuir para a resistência mediada por esfingolipídios de drogas [10], [11]. Consequentemente, drogas terapêuticas visando o metabolismo dos esfingolípidos, incluindo excesso de produção de ceramida para matar células tumorais ou reduzir a angiogênese, representam abordagens atraentes para o tratamento do câncer. Muitas destas novas terapias de droga esfingolipídios foram avaliados em cultura de células e /ou modelos animais, e está voltada para a distribuição directa de ceramidas não-fisiológicos [12] para tumores, ou a administração de inibidores de ceramidases ou os esf ingosina-quinases responsáveis ​​pela síntese de S1P [13]. Desde rhASM é a) feita selectivamente pelo fígado após a administração sistémica, b) altamente eficazes na geração de ceramida, e c) disponível numa formulação de grau clínico, que voltada para investigar o potencial de rhASM como um adjuvante para o tratamento com sorafenib em fígado experimental câncer.

Anteriormente, mostramos que rhASM em combinação com irradiação teve um efeito profundo sobre melanoma

in vivo.

para recapitular esse efeito

in vitro

os meios de comunicação necessárias para ser acidificou-se (pH 6,5), uma condição que imita o microambiente do tumor e favorece a actividade ASM [14]. Também mostrou que rhASM sozinho (1 uM) não teve efeito reprodutível sobre a viabilidade de linhagens de células de 60 de cancro englobando leucemia, não-pequenas tumores do pulmão de células, do cólon, do SNC, melanoma, do ovário, renais, próstata e da mama, sugerindo que o

in vivo

microambiente do tumor foi importante para os efeitos observados [15], [16].

Considerando a natureza hepatotrópico de rhASM, temos a hipótese de que o câncer de fígado pode ser um modelo adequado em que a próxima testar a eficácia de rhASM como um adjuvante para o tratamento com sorafenib padrão de cuidado. Aqui, demonstramos que o tratamento com a combinação de dose elevada rhASM (25 mg /kg de três em três dias (q.72 h), intraperitonealmente (ip)) e sorafenib (30 mg /kg cada dia (QD), sonda) reduz o volume do tumor de Huh7 xenoenxertos subcutâneos

in vivo

, reduz a densidade dos vasos sanguíneos, e resulta no aumento da necrose nos tumores. Estes efeitos foram obtidos, apesar de fornecimento limitada da enzima para os tumores subcutâneos. O tratamento de combinação foi bem tolerado em ratinhos BALB /C sem quaisquer mortes relacionadas com o tratamento, sem perda de peso, e com a função normal do fígado. Também estabelecemos um modelo ortotópico de tumores Huh7 em fígados de ratos SCID /bege, e surpreendentemente semelhante pobres entrega de rhASM a estes tumores em relação ao fígado saudável. Outras investigações sugeriram que a baixa expressão de receptores de manose em tumores Huh7 pode explicar parcialmente este efeito.

Resultados

A desregulação da sinalização de esfingolípidos em humanos carcinoma hepatocelular

Comparação de fígados normais para carcinomas hepatocelulares, utilizando quatro conjuntos independentes de amostras disponíveis no banco de dados Oncomine, revelou diminuíram significativamente os níveis de ASM (

SMPD1

) e S1P fosfatase expressão de ARNm de (

SGPP1

) (Tabela 1). O gene

SMPD1

classificados entre os top 1, 9, 17 e 11% dos genes reprimidos no Mas [17], Chen [18], Wurmbach [19], e Roessler fígado 2 conjuntos de dados [20]. Da mesma forma, o

gene SGPP1

foi no top 4, 5 e 7% de genes reprimidos em 3 dos 4 conjuntos de dados [17], [18], [19]. S1P é um esfingolípido altamente bioactiva que promove a proliferação de células [11], e S1 P fosfatase é a enzima necessária para hidrolisar o grupo fosfato do S1P (Figura 1A). A repressão destes dois genes /enzimas, portanto favorecem baixo ceramida e níveis elevados de S1P, provavelmente levando à proliferação celular e /ou a resistência aos medicamentos.

(A) ASM dirige a produção de ceramida pró-apoptótico através da hidrólise de esf ingomielina, que é convertida em esfingosina por ceramidases tais como ácido ceramidase (AC). A esfingosina-quinase 1 (SphK1), em seguida fosforila esfingosina para esfingosina-1-fosfato (S1P), que é convertido de volta a esfingosina por S1P-fosfatase (SGPP1) ou metabolizados por S1P-liase 1 (SGPL1). (B) Actividade de ASM em células Hep3B foi significativamente maior (ANOVA, DF (2,6), F = 48,49, p 0,001) do que em Huh7 (do teste de Tukey post hoc de p 0,001, **) e células HepG2 (Tukey teste post hoc p 0,001). AC foi semelhante em todas as linhas de células, mas as células HepG2 teve aumento significativo da actividade SphK1 (ANOVA, df (2,6), F = 8,68, p = 0,017, *) do que Huh7 (teste de Tukey, p = 0,041) e Hep3B (teste de Tukey post hoc, p = 0,019). foram seleccionados células (C) Huh7 para mais estudos e a sua viabilidade testada a pH 6,5 (ver métodos) na presença de 500 ug /mL rhASM, 3 uM sorafenib, ou a combinação de rhASM e sorafenib em 48 horas. Sorafenib (Dunnett teste post hoc p 0,001, **) e combinado rhASM /sorafenib (Dunnett teste post hoc p 0,001, **) células tratadas tinha viabilidade significativamente menor do que as células de controlo (ANOVA, DF (3,38), F = 26,47, p 0,001). rhASM não foi significativamente diferente do controle (p = 0,118). A combinação rhASM e sorafenib exibiu significativamente menor viabilidade em relação à sorafenib sozinho (t-test, 1-sided, * p 0,05, ** p 0,001).

Seleção de um ser humano linha de células de hepatoma e

in vitro

efeito da rhASM na proliferação

a seguir, investigou as atividades de linha de base de três enzimas envolvidos no metabolismo dos esfingolípidos – ASM, ceramidase ácido (AC) e esfingosina quinase 1 (SphK1) – em três linhas de células de hepatoma humano vulgarmente utilizados: HepG2, Huh7 e Hep3B. células Hep3B teve a maior actividade de linha de base ASM, enquanto que a actividade SphK1 foi mais elevada em células HepG2 (Figura 1B). Todos os três células tinham actividade de AC comparável. Com base nestes resultados, as células Huh7 seleccionados para outras experiências uma vez que as actividades da linha de base foram moderadas e entre aqueles de HepG2 e Hep3B. Além disso, Huh7 xenoenxertos de ratinho por via subcutânea é um modelo bem estabelecido utilizado para avaliar diversos tratamentos com drogas experimentais de carcinoma hepatocelular [21], [22], [23]. O efeito de rhASM foi investigada em células Huh7 através de pré-tratamento (2 horas) com o rhASM num meio acidificado (6,5) – imitando o tumor microambiente pH – seguido de incubação durante 46 horas a pH 7,4. Não foi observado efeito significativo de tratamento rhASM sozinho sobre a viabilidade das células Huh7 nas 48 horas que, como foi anteriormente observado em células de melanoma [14]. Em contraste, sorafenib levou a uma redução significativa na proliferação, o que foi significativamente aumentada em células expostas a combinação rhASM /sorafenib (Figura 1C). Estes dados suportada ainda mais a noção de que rhASM sozinho tem pouco efeito sobre as células tumorais, e podem ser úteis como um tratamento adjuvante para sorafenib [14].

volume tumoral reduzida e aumento da sobrevivência em ratinhos tratados com rhASM e sorafenib

em seguida, investigaram os efeitos da rhASM tratamento combinado /sorafenib

in vivo

usando Huh7 tumores de xenoenxerto subcutâneo em ratos. Os animais foram divididos aleatoriamente em 4 grupos tratados com sorafenib (n = 10), rhASM (n = 13), rhASM /sorafenib (n = 14), ou de veículo (n = 9). Como em

in vitro

experimentos, tratamento rhASM sozinho não teve nenhum efeito benéfico

in vivo

(sobrevivência média de 10 dias, o volume do tumor 925 ± 80 milímetros

3 no dia 11) (dados não mostrado). No entanto, em comparação com veículo, os volumes dos tumores foram medidos significativamente mais baixos no grupo rhASM /sorafenib nos dias 8 e 11. Além disso, no dia 11, a redução do volume do tumor observada no grupo de combinação foi significativamente mais baixa do que em ratos tratados com sorafenib sozinho ( A Figura 2A). A sobrevivência dos animais foi significativamente maior tanto na sorafenib (13 dias) e ratinhos tratados combinação (19 dias) em relação ao veículo (11 dias) (Figura 2B). Embora tenha havido uma tendência de melhoria, não foram observadas diferenças significativas de sobrevivência entre os dois grupos de tratamento. É de notar, no entanto, dois animais do grupo de combinação /sorafenib rhASM tinham tumores 1,000 mm

3 e sobreviveu para além das 5 semanas. Estes ratos foram sacrificados no dia 43 como os seus volumes de tumor permaneceu relativamente estável (132 mm

3 (ID mouse # 452) e 267 mm

3 (mouse ID # 443) no momento do sacrifício.

(A) O volume médio do tumor de ratos tratados com rhASM e sorafenib foi significativamente menor do que a de ratos de controlo no dia 8 (teste post-hoc de Dunnett p = 0,035; ANOVA DF (2,30), F = 3,24, p = 0,053) no dia 11 tanto sorafenib (Dunnett teste post hoc p = 0,034) e combinado rhASM e sorafenib (Dunnett teste post hoc p 0,001) ratos tratados tinham tumores menores do que os ratos de controle (ANOVA, DF (2,27)., F = 12,22, p .. 0.001) o grupo de combinação /sorafenib rhASM também tinha tumores significativamente menores do que o grupo sorafenib no dia 11 (t = 2,32, df (20), p = 0,031) (B) a sobrevivência significativamente maior mediana ( observou-se 0,001); 13 dias) de ratos sorafenib tratada (qui-quadrado 5,02, df (1), p = 0,025) e camundongos /sorafenib tratados combinados rhASM (19 dias) (qui-quadrado 14,57, df (1), p 0,05, ** p . 0.001

reduziu a proliferação e densidade dos vasos sanguíneos e aumento da morte celular nos tumores de /sorafenib ratinhos tratados rhASM combinados

No molecular nível, o número de células positivas para o marcador de proliferação Ki67 foi significativamente diminuída em ambos os grupos e sorafenib rhASM /tratamento sorafenib a uma extensão similar (Figura 3A). No entanto, necrose foi significativamente aumentada no /sorafenib ratinhos tratados rhASM combinada (Figura 3B). Para investigar esta descoberta ainda mais, o próximo examinou vascularização dos tumores. O número de vasos sanguíneos corados com anti-αSMA foi significativamente menor nos tumores de ambos sorafenib (6,9 ± 0,5) e rhASM /sorafenib (5,5 ± 0,4) ratos tratados em comparação com o controlo (9 ± 0,6). Mais importante, o número de vasos sanguíneos positivo anti-αSMA foi significativamente menor no rhASM /sorafenib do que em ratinhos tratados sorafenib (p 0,001). Resultados semelhantes foram obtidos por coloração com anti-CD34, em que rhASM /sorafenib (5,3 ± 0,4) era significativamente mais baixa do que o sorafenib sozinho (7,5 ± 0,4), e ambos eram mais baixos do que o controlo (11,6 ± 0,9). Tanto anti-αSMA e anti-CD34 permitido para a coloração selectiva dos vasos sanguíneos em secções de tumores embebidos em parafina, tal como representado nas Figuras 3 E, F. Os ratos rhASM /sorafenib longo sobreviventes (ID # 452 e # ID 443) estavam dentro da gama de medições para o grupo de combinação utilizando um dos ensaios acima.

(A) O número médio de células positivas Ki67 em os tumores de ratos tratados com sorafenib (de Dunnett post-hoc de p 0,005) e com rhASM combinação /sorafenib (de Dunnett post-hoc de p 0,001) foi significativamente inferior do veículo (ANOVA DF (2,30), F = 14,63, p 0,001). Não foi observada diferença significativa entre coloração Ki67 em tumores de sorafenib e /sorafenib ratinhos tratados rhASM (t = 1,19, df 22, p = 0,249). (B) A necrose foi significativamente aumentada (ANOVA, DF (2,30), F = 3,66, p = 0,038) em murganhos /sorafenib tratada rhASM (de Dunnett post-hoc controlo, p = 0,043) em comparação com ratos tratados com veículo, enquanto ratinhos tratados sorafenib não foram diferentes do controle (de Dunnett post hoc controle, p = 0,760). Necrose em ratinhos /sorafenib rhASM tratado foi significativamente maior do que nos ratinhos tratados apenas com sorafenib (t = -2,39, DF (22), p = 0,26). (C) Anti-αSMA coloração dos vasos sanguíneos revelou um número significativamente menor de vasos (ANOVA df (2,30), F = 12,57, p 0,005) em sorafenib (Dunnett teste post hoc p = 0,020) e ratos /sorafenib tratada rhASM (teste post hoc p Dunnett 0,001). O grupo /sorafenib rhASM também tiveram significativamente menos vasos sanguíneos do que o grupo αSMA sorafenib (t = 2,25, df (22), p = 0,031). (D) anti-CD34 coloração vaso sanguíneo confirmou os resultados αSMA, que mostra um número significativamente menor de vasos (ANOVA DF (2,30), F = 32,07, p 0,001) em sorafenib (de Dunnett O teste post hoc p 0,001) e camundongos /sorafenib tratada rhASM (Dunnett teste post hoc p 0,001). O grupo /sorafenib rhASM combinada teve significativamente menos do CD-34 positivas vasos sanguíneos do que o grupo sorafenib (t = 3,56, df (22), p = 0,002). coloração selectiva dos vasos sanguíneos em secções de tumores embebidos em parafina coradas é mostrado com anti-αSMA (E) e marcadores de anti-CD34 (F). * P 0,05, ** p . 0,001

A análise dos níveis de ceramida em tumores, que não mostrou diferença entre os grupos (dados não apresentados), foi feito como uma medição de ponto final após a conclusão do estudo (até 48 horas após a última injecção). Uma vez que a elevação de ceramida em células em resposta a ASM é rápida e pode retornar à linha de base dentro de minutos, analisámos a de necrose tumoral e a densidade dos vasos sanguíneos (acima) como marcadores substitutos para os efeitos biológicos do tratamento. Uma vez que observamos uma diminuição no volume do tumor, aumento da necrose, e diminuição da densidade de vasos sanguíneos no grupo /sorafenib rhASM, nós não medir os níveis de outros metabolitos esfingolipídios tais como S1P. Em geral, no entanto, é evidente dos seus dados que o efeito predominante do tratamento de combinação foi rhASM morte celular e, assim, qualquer S1P a jusante que pode ter sido gerado não impedem que estes /alterações induzidas pelo sorafenib rhASM.

distribuição modesta de rhASM em tumores subcutâneos em comparação com

fígado saudável

Os dados acima demonstrado um positivo, embora modesto, impacto do tratamento /sorafenib combinada rhASM neste modelo Huh7 HCC subcutânea. Para examinar a biodistribuição da enzima para os tumores, medimos a actividade ASM no final do estudo. Cada animal recebeu a última injecção rhASM 1, 24 ou 48 horas antes de serem sacrificados de acordo com regime de dosagem do animal individual. Não se observaram diferenças aparentes na actividade ASM em relação ao tempo esperado após a última injecção rhASM. Como esperado, a actividade de ASM foi significativamente maior em extractos de tumores dos murganhos /sorafenib rhASM tratados em comparação com o sorafenib sozinho (Figura 4A). No entanto, a actividade ASM nos fígados saudáveis ​​destes ratinhos era 12 vezes maior do que nos tumores subcutâneos (Figura 4B). Assim, biodistribuição modesta de rhASM para os tumores subcutâneos pode explicar a modesta eficácia do tratamento de combinação neste modelo.

(a) Actividade ASM em extractos de tumores de ratinhos /sorafenib rhASM tratado foi significativamente maior (ANOVA, df (2,30), F = 22,58, p 0,001; teste post hoc de p 0,001) do que o controlo, enquanto sorafenib não teve nenhum efeito sobre a actividade da linha de base ASM. (B) actividade ASM em extractos de fígado de ratos /sorafenib tratada rhASM também foi maior do que os ratos tratados com o veículo (ANOVA, DF (2,30), F = 11,17, p 0,001; de Dunnett O teste post hoc p 0,001), e sorafenib não teve efeito sobre a atividade basal ASM. De nota, os animais do grupo de tratamento com combinação tinha 12 vezes maior actividade do que nos fígados ASM em tumores, demonstrando a natureza hepatotrópico de rhASM durante a administração crónica e distribuição relativamente modesta para os tumores subcutâneos. ** P 0,001. atividade Y-eixos (10

-6 mol /L /hora) foi medido em partes iguais de 20% extratos de tecidos de peso /volume como descrito em Materiais e Métodos

Segurança de: Note. rhASM /sorafenib tratamento combinado

na fase I de ensaios de segurança de rhASM em pacientes NPD tipo B, a mais alta dose inicial cofre foi determinado a ser de 0,6 mg /kg [24]. Devido às doses muito elevadas de rhASM utilizados no presente estudo (25 mg /kg q.72 h), foi examinada a toxicidade potencial do tratamento de combinação, monitorando os pesos corporais ao longo do estudo e examinando a função do fígado dos murganhos no final do tratamento. Os pesos no início e no final do tratamento não foram significativamente diferentes (Figura S1A). Além disso, não foi observada nenhuma diferença significativa na alanina transaminase (ALT) ou em qualquer sorafenib /sorafenib rhASM ratinhos tratados, em comparação com o controlo (Figura S1B). Dois animais com altos valores discrepantes de ALT tinha bolsos de células inflamatórias (Figura s1b) em um fígado de outra maneira saudável, sem sinais de lesão crônica (Figura S1C). De nota, a longa vida rhASM /sorafenib ratos ID # 452 (ALT 52 U /L) e ID # 443 (ALT 53 U /L) não foram os valores atípicos. Aspartato transaminase (AST, Figura S1D) e bilirrubina total (Figura S1E) também não foram significativamente alteradas pelo tratamento combinado. Em conjunto, estes dados sugerem que a combinação de rhASM (25 mg /kg q.72 h) e sorafenib (30 mg /kg QD) é bem tolerada.

Avaliação de rhASM tratamento /sorafenib num modelo ortotópico de tumores Huh7

os resultados positivos acima de rhASM tratamento /sorafenib foram obtidos apesar do mau biodistribuição de rhASM aos tumores subcutâneos. Por isso, concluiu que os resultados podem ser melhorados em um modelo ortotópico de HCC. Para estabelecer um modelo deste tipo, as células Huh7 que expressam de forma estável o gene repórter de luciferase foram injectados no parênquima do fígado de ratinhos bege SCID /. Os animais foram fotografadas 24 horas e 1 semana após a cirurgia, e monitorizados cada 4-5 dias até um aumento contínuo na luminescência foi observado (Figura 5A). Isto foi feito para assegurar que as células sobreviveram ao procedimento de implantação e começou a se expandir e gerar tumores. Todos os ratinhos tinham áreas luminescentes detectáveis ​​na região do fígado, no início do tratamento, e as áreas de luminescência extremamente aumentados no final do estudo. – Correspondentes aos tumores que crescem no fígado (Figura 5B)

(A ) Após injecção cirúrgica de células Huh7 marcado com luciferase, luminescência foi monitorizada ao longo do tempo. Aumento da luminescência da linha de base ≥6 vezes (dia 1) foi usado como prova de implantação com sucesso de células, a iniciação do crescimento do tumor e um ponto de randomização de ratinhos em grupos de tratamento. (B) Imagens representativas de ratos no início do tratamento com medicamentos que mostram luminescência bem detectável a partir do fígado (inserir a), da área luminescente grande correspondente ao tumor Huh7 fígado, no momento do sacrifício (inserções b, c). Fígado e tumor foram removidos e separados (d) para posterior processamento. barra de escala na inserção d é 1 cm. (C) significativamente maior média de sobrevivência de ratos tratados sorafenib (n = 5, 42 dias, qui-quadrado 4,88, df (1), p = 0,027) e combinadas /sorafenib ratinhos tratados rhASM (n = 5, 44 dias, qui 4,43 quadrado, df (1), foi observada p = 0,035) comparado com o controlo (n = 4, 14 dias). Não foi observada diferença significativa entre rhASM sozinho (n = 4, 19 dias) e controle ou entre sorafenib e rhASM /sorafenib. (D) A atividade rhASM no HCC ortotópico de veículo e ratos tratados sorafenib (virgens de tratamento rhASM; baseline rhASM) foi significativamente, 6,4 ± 1,4 vezes, menor do que a atividade rhASM em tumores de rhASM e ratos /sorafenib tratada rhASM (t = -3,99 , DF (15), p = 0,001). Da mesma forma, linha de base rhASM no fígado foi significativamente inferior, de 13,6 ± 1,6 vezes, do que a actividade de rhASM nos fígados de ratinhos que receberam rhASM ou rhASM /sorafenib (t = -9,07, DF (14), P = 3,1 · 10

– 7). Importante, a diferença entre a actividade de rhASM em ratinhos tratados (rhASM e rhASM /sorafenib) entre CHC ortotópico e fígado foi muito maior no fígado, 20,8 ± 2,4 vezes (t = -8,7, DF (13), P = 8,8 · 10

-7, **). Nota:.-Y actividade eixos (10

-6 mol /L /h) foi medido em partes iguais de extractos de tecido de 20% peso /volume, tal como descrito em Materiais e Métodos

e Aleatorização o início do tratamento foram realizadas como descrito em Materiais e Métodos. Os ratinhos que receberam a combinação /sorafenib rhASM foram iniciados no mesmo esquema de dosagem e tratamento que no modelo subcutâneo – 30 mg /kg q.d. sorafenib por sonda e 25 mg /kg rhASM q.72 horas i.p. Embora nós não foram capazes de quantificar de forma precisa o tamanho do tumor ao longo do tempo por luminescência (provavelmente devido ao pequeno número de animais e uma cinética de activação luciferina dentro de tumores), não houve patamar aparente de luminescência nos ratinhos tratados. Portanto, a frequência de administração rhASM foi aumentada (2 dias-on, 1 dia-off) 2 semanas para o estudo em uma tentativa de reduzir possíveis sub-dosagem de rhASM.

Os perfis de sobrevivência da ratinhos tratados foram semelhantes aos observados no modelo de administração subcutânea, ou seja, não houve diferença significativa entre o sorafenib sozinho e /sorafenib grupos de combinação rhASM (Figura 5C). Surpreendentemente, contudo, a actividade ASM nos fígados saudáveis ​​dos ratinhos tratados era várias vezes maior do que nos tumores Huh7 ortotópicos dos mesmos animais. Isto é similar aos resultados dos tumores subcutâneos (Figura 4B), indicando que a fraca biodistribuição de rhASM para tumores Huh7 foi independente da localização de xenoenxerto.

Devido ao perfil de actividade ASM semelhante nos dois modelos diferentes nos próximos explorou a expressão de dois receptores importantes na internalização celular de rhASM – insulina como receptor do factor de crescimento 2 (IGF2R) e um receptor de manose (MRC1) – em HCC. A análise da base de dados Oncomine indicaram que a expressão de

IGF2R

não é consistentemente desregulada entre os 4 conjuntos de dados HCC humana diferentes, enquanto que a expressão de

MRC1

foi regulada para baixo em 3/4 conjuntos de dados (fileiras de genes: top 11, 2 e 5%). (Tabela 2)

por isso, investigou a expressão de

MRC1 /MRC1

no fígado e tumores Huh7 ortotópicos. Dois conjuntos diferentes de iniciadores de PCR foram concebidos para estimar a expressão do ser humano e do rato

MRC1

e

MRC1

, respectivamente. Os resultados (Tabela 3) revelou nenhuma expressão detectável de

MRC1

em células Huh7 humanos ou os tumores Huh7 ortotópicos. A expressão foi detectada no fígado humano saudável como um controlo positivo. A expressão de rato

MRC1

era detectável no fígado não-tumoral e nos tumores Huh7. Este último está em linha com hospedeiro-enxerto de “contaminação”, que tem sido documentada antes [25]. Dado que o C

foram observados valores de T de ~21 tanto para

MRC1

e

Srsf4

gene housekeeping no fígado do rato, e -25 para

MRC1 Comprar e

Srsf4

em tumores hepáticos Huh7, a expressão de

MRC1

nos tumores parece ser ~ 10 vezes menor.

Srsf4

foi usado como um gene de manutenção com base na expressão estável durante as diferentes fases de desenvolvimento de HCC [26]. No geral, estes resultados revelam muito baixo

expressão MRC1

em Huh7 células /tumores foram consistentes com a baixa atividade ASM observada nos tumores de xenoenxerto após o tratamento.

Discussão

Alterações nos lípidos da membrana das células tumorais, incluindo glicoesfingolípidos, foram reconhecidos por mais de 40 anos [27]. Desde então, os papéis estruturais de esfingolipídeos ter sido expandida para incluir uma intrincada rede de lipídios bioativos com diversos papéis em muitos processos celulares, incluindo a morte celular e sobrevivência. Hoje em dia, os papéis importantes de dois destes lípidos, ceramida e S1P, têm sido bem estabelecidas no cancro. O foco em ceramidas e S1P para a terapia do cancro é bem colocado desde a manutenção de um equilíbrio de ceramida /S1P adequado é fundamental para determinar o destino celular, e alterações no metabolismo dos esfingolípidos é uma característica comum de muitos cancros, levando à redução da ceramida e /ou a elevação de S1P [10]. Assim, as drogas esfingolipídios em desenvolvimento são destinadas a restaurar este equilíbrio metabólico e /ou intensificar a morte mediada por ceramida de células tumorais ou microcirculação tumor [10], [11]. Várias terapias baseadas em ambos elevando ceramida pró-morte ou reduzindo S1P pró-activamente a sobrevivência estão sob investigação, incluindo a utilização de análogos de ceramida e inibidores de esf ingosina-quinases ceramidases ou [28]. Durante a última década, numerosos trabalhos elucidaram as funções de ceramida e, em particular ASM, em sinalização celular e o potencial de modular esta via no tratamento do cancro [14], [29], [30]. Kolesnick e colegas foi o primeiro a sugerir que a enzima lisossomal, ASM, pode ter um papel nestes processos, e demonstraram a importância da ceramida gerado-ASM no radiossensibilidade de células tumorais do tumor e microvasculatura [31].

Aqui, nós trazemos a atenção para uma possível aplicação da modulação esfingolipídios no HCC experimental usando rhASM, que foi produzido para uso humano e avaliadas para a terapia de reposição enzimática em pacientes B NPD Tipo. HCC é um tumor maligno sólido particularmente mortal com uma incidência global crescente e mortalidade [32]. Em parte, os resultados não promissoras em doentes com HCC são devidas à patogénese da doença, a qual inclui a activação aberrante de grandes vias de sinalização como a RAF /MEK /ERK, PI3K /AKT /mTOR, WNT /β-catenina, IGF, o HGF /c-MET e angiogênese [2].