Abstract

RBP2 foi encontrado a participar ativamente na progressão do cancro. Ela inibe a senescência das células cancerosas, medeia a proliferação de células cancerosas e promove a metástase do cancro. É também essencial para a tolerância à droga. No entanto, os efeitos de RBP2 na transição epitelial-mesenquimal ainda são desconhecidos. Neste estudo, foram analisados ​​os efeitos da RBP2 sobre a transição epitelial-mesenquimal no câncer de pulmão de células não pequenas. Os resultados mostraram que RBP2 regulada negativamente a expressão de E-caderina através da inibição da actividade do promotor de E-caderina e supra-regulados a expressão de N-caderina e caracol através da activação de sinalização de Akt, e a sobre-expressão de epithelial- induzida RBP2 mesenquimal em células do cancro do pulmão de células não-pequenas. Nosso estudo indicou ainda thatRBP2 pode ser um alvo potencial para a terapia do cancro anti-lung

Citation:. Wang S, Wang Y, Wu H, Hu L (2013) RBP2 Induz transição epitelial-mesenquimal em não-pequenas células Câncer de pulmão. PLoS ONE 8 (12): e84735. doi: 10.1371 /journal.pone.0084735

editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 18 Agosto, 2013; Aceito: 19 de novembro de 2013; Publicação: 20 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Natural Science Foundation da província de Shandong [Z2005C02]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a causa mais comum de mortalidade por câncer, e sua morbidade está a aumentar em todo o mundo [1]. cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é responsável por 85% de todos os cânceres de pulmão. Infelizmente, muitos pacientes com NSCLC desenvolver metástases distantes durante a fase precoce da doença. Além disso, a mortalidade entre os pacientes com NSCLC é mais frequentemente causada por metástase ao invés de seus tumores primários. Portanto, a detecção precoce e prevenção de metástases é um passo fundamental em parar a progressão da NSCLC [2].

Retinoblastoma proteína-2 de ligação (RBP2) foi originalmente identificada como uma proteína crítica do retinoblastoma (pRb) liga�o ao proteína [3]. Em 2007, RBP2 foi encontrado pela primeira vez ser um desmetilase histona para tri- e lisina dimetilado 4 em histona H3 (H3-K4me2 e H3K4me3) [4,5]. É amplamente aceite que a metilação das histonas é muito importante para a expressão de vários genes e desempenha um papel importante na progressão do cancro [6-8]. metilação aberrante contribui para a proliferação excessiva de células e tumorigênese, eo estado H3K4me0 está altamente correlacionada com mau prognóstico em pacientes com câncer de mama [9]. Como demethylase histona, RBP2 participa ativamente na progressão do cancro. No entanto, ao contrário de outras enzimas modificadoras de histonas, RBP2 pode ligar diretamente DNA alvo. Ele tem um domínio de interacção rica em AT (áridas) que reconhece especificamente a sequência de ADN CCGCCC [10]. Esta sequência de ADN é enriquecida em especial as regiões promotoras dos genes alvo RBP2. No cancro gástrico, RBP2 se liga às regiões promotoras do INK4a p16

, p21

CIP1 e p27

KIP1 genes que inibem suas expressões e diminuir a senescência das células cancerosas [11]. No cancro do pulmão, RBP2 se liga à região do promotor de p27, a ciclina D1 e integrina b1 para mediar a proliferação de células de cancro e metástase [12]. Neste estudo, foram analisados ​​os efeitos da RBP2 sobre a transição epitelial-mesenquimal (EMT) em NSCLC.

Declaração de Materiais e Métodos

Ética

Foram obtidas informações de pacientes e amostras com o consentimento informado por escrito. Cada paciente neste estudo deram seu consentimento informado para publicar estes detalhes do caso. A pesquisa foi aprovada pelo comitê de ética da Qilu Hospital.

Os pacientes

Os espécimes de câncer de pulmão (n = 61) e distantes tecidos pulmonares normais (n = 47, 5 cm da margem do cancro do pulmão) foram coletadas de pacientes com NSCLC em Qilu Hospital de 2007 a 2008. Os tecidos foram armazenadas a -80 ° C até o uso. Todas as amostras eram de pacientes que não haviam sido submetidos a radioterapia pré-operatória ou quimioterapia. O estadiamento patológico dos 61 pacientes foi realizada de acordo com o sistema tumor-nódulo-metástase (TNM) [13].

Imunohistoquímica

As amostras de tecidos foram embebidos em parafina. Os cortes foram desparafinados em xileno e re-hidratadas em um gradiente de etanol. Após os antigénios foram recuperadas, as secções foram tratadas com 3% H

2O

2 durante 10 min, seguido de albumina de soro bovino a 5% (BSA) durante 30 min. Em seguida, as secções foram incubadas com anticorpos primários contra RBP2 (diluição 1: 250), a E-caderina (diluição 1: 200), N-caderina (diluição 1: 200) ou caracol (diluição 1: 200) durante a noite a 4 ° C , e anticorpos secundários conjugados com HRP (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, EUA) foram adicionados durante 1 h a 37 ° C. A visualização da ligação do anticorpo foi realizada utilizando coloração DAB. Os núcleos foram corados com hematoxilina. Os resultados imunocoloração foram avaliadas independentemente por dois patologistas. A percentagem das células cancerosas positivas foi estimado de acordo com os seguintes critérios: 0 = nenhum positivo células cancerosas, 1 = 10% de células cancerosas, 2 = 10% de células cancerosas -35% positivos, 3 = 35% de células positivas -75% Câncer positiva e 4 = 75% de células cancerosas positivas. A intensidade da coloração foi estimada de acordo com os seguintes critérios: 1 = nenhuma coloração, 2 = leve coloração amarela (coloração fraca), 3 = coloração amarela (coloração intermediária) e 4 = coloração marrom (coloração forte) [14]. A pontuação final foi igual à pontuação área ea pontuação intensidade [15]. Pontuação um coloração definitiva ≥ 4 foi definida como a sobre-expressão, e uma pontuação 4 foi definida como nonoverexpression [15].

Cultura de Células, interferência de RNA e Gene superexpressão

O cancro do pulmão linhas celulares A549 humana e SK-MES-1 e da linha epitelial brônquica humana celular Beas2B foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). células Beas2B e A549 foram cultivadas a 37 ° C com 5% de CO

2 em meio RPMI-1640 (Sigma, Santa Clara, CA, EUA) meio suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Gibico, Carlsbad, CA, EUA). Os SK-MES-1 foram cultivadas em MEM (Gibico, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de FBS. Quando foram analisados ​​os efeitos de sinalização de Akt sobre a expressão de N-caderina e caracol, as células A549 foram tratadas com 24? M de inibidor de PI3K (LY294002) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) durante 24 h. Para interferência de ARN e a sobre-expressão do gene, as células foram cultivadas em placas de 6 poços (1,0 x 10

5 células /poço) durante a noite, seguida por transfecção com 5 ul de RBP2 siRNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) ou dois ug do plasmídeo pcDNA3-HA-RBP2 (uma oferta generosa do WG Kaelin) utilizando 5 ul de Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA); as células foram então cultivadas durante 48 h. As seguintes sequências de siRNA foram utilizados neste estudo: RBP2 siRNA1 5′-AAUAUCCAGGGCCUUCAUGUAGCCC-3 ‘; RBP2 siRNA2 5’-UUGUGUACUCGUCAAACUCUACUCC-3 ‘; RBP2 siRNA3 5’-UUAACAUGCCGGUUAUCCAGGCUCU-3 ‘; ARNsi de controlo 5’-UUCUCCGAAGGUGUCACGUTT -3 ‘. O siARN RBP2 que poderá ser mais eficazmente esgotar RBP2 foi utilizado nas experiências seguintes.

Extração de RNA e quantitativa PCR em Tempo Real

O ARN total a partir dos espécimes de tecidos e linhas celulares foi isolado utilizando o Trizol reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). O ADNc foi sintetizado utilizando a primeira cadeia de cDNA Synthesis Kit (Thermo, San Jose, CA, EUA). Para a análise por PCR em tempo real, os ADNc foram amplificados utilizando SYBR Premix Ex Taq (Takara, Otsu, Shiga, Japão) e foram detectados utilizando um Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System. a expressão do gene foi normalizado em relação à expressão de β-actina e foi calculada utilizando a 2

– método de [16] (△△ CT). Os seguintes iniciadores foram utilizados nesta experiência: β-actina directo 5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3 ‘e inverso 5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′; RBP2 frente 5’-GCTTGGCAATGGG AACAAAA-3 ‘e reverso 5′-CCGTTGTCTCATTTGCATGTTAA-3’.

Western Blot

proteínas celulares totais foram extraídas com tampão de lise Radio Immunoprecipition Ensaio, e 50 ug de proteínas totais foi usada para análise de western blot. As membranas de difluoreto de polivinilideno foram sondadas com anticorpos contra β-actina (diluição 1: 1000), RBP2 (diluição 1: 1000), da E-caderina (diluição 1: 1000), N-caderina (diluição 1: 1000), caracol (1 : 1000 de diluição), P-Akt (1: (1 diluição 1000) ou Akt: 1000 de diluição) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA), seguido por incubação com uma peroxidase de rábano anti-coelho (HRP) de imunoglobulina -conjugated G (IgG) (diluição 1: 2000). As manchas foram subsequentemente desenvolvida utilizando o método de quimioluminescência aumentada (Millipore, Billerica, MA, EUA). O sinal β-actina foi utilizado como um controlo.

Imunofluorescência

células A549 foram cultivadas numa placa de 96 cavidades e foram transfectadas com ARNsi RBP2 durante 48 h. Em seguida, as células foram fixadas com 4% de paraformaldeído, permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100, e incubados com anticorpos primários contra RBP2 (1: 250 de diluição) ou E-caderina (diluição 1: 200) durante 1 h a 37 ° C . As células foram, então, incubadas com anticorpos secundários conjugados com FITC (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, EUA) durante 30 min a 37 ° C. As imagens fluorescentes foram capturadas usando um microscópio confocal de varrimento laser

Transwell Invasão Assays

Transwell membranas (8 mm de tamanho de poro, 6,5 mm de diâmetro; Corning, Tewksbury, MA, EUA). Foram pré- revestido com matrigel (1 ug /ml, diluído com meio RPMI-1640 isento de soro). Depois de interferência de ARN ou a sobre-expressão do gene tratamento durante 48 h, 1,0 × 10

5 células em 200 ul de meio RPMI-1640 sem FBS foram colocadas nas cavidades superiores. Em seguida, 500 ul de meio RPMI-1640 com FBS a 10% foi adicionada à câmara inferior. Após 12 h, as células sobre a superfície superior das membranas Transwell foram removidos por um cotonete. As células que invadiram através da membrana para a superfície inferior foram fixadas com metanol e coradas com eosina. As células foram contadas sob um microscópio de luz.

Wound Ensaios cura

ensaios de cicatrização de feridas foram realizadas conforme relatado anteriormente [17]. Resumidamente, as células foram transf ectadas e cultivadas durante 48 h e crescido a uma monocamada de células confluentes. Em seguida, uma linear ” ferida ” foi desenhado na monocamada de células com uma ponta de pipeta de plástico. As células foram incubadas a 37 ° C, e a ferida foi fotografada imediatamente e monitorizados após 24 h. Calculou-se a distância entre as duas margens da “ferida”.

luciferase Ensaios

células A549 foram transfectadas com ARNsi RBP2 no dia 1 e com a E-caderina repórter promotor plasmídeo (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) no dia 2. Para monitorizar a transfecção eficiência, um controlo de luciferase de Renilla plasmídeo repórter controlados pelo promotor da timidina-quinase foi co-transfectados para dentro das células. Beas2B células foram co-transfectadas com o plasmídeo pcDNA3-HA-RBP2 e os dois plasmídeos repórter acima. Depois de 48 h, um sistema de ensaio de duplo repórter de luciferase (Promega, Madison, WI, EUA) foi utilizado para determinar a actividade da luciferase. O plasmídeo repórter E-caderina tinha a mesma sequência de promotor (-799 a -579), que foi descrito anteriormente [18].

Análises Estatísticas

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o SPSS17.0 Programas. A χ

2 teste foi utilizado para analisar a relação entre as características clínicas e expressão RBP2. Bivariadas correlações entre RBP2, E-caderina, N-caderina e caracol também foram analisadas pelo χ

2 teste. Outras análises estatísticas foram realizadas utilizando um teste t de Student. Os dados são apresentados como a média ± SD de 3 ensaios independentes. A diferença estatisticamente significativa foi considerada quando

P Art 0,05.

Resultados

Relações entre RBP2 e as características clinicopatológicas de NSCLC

Para estudar os papéis de RBP2 em câncer de pulmão, detectado pela primeira vez a expressão de RBP2 em tecidos NSCLC e seus correspondentes tecidos normais utilizando imuno-histoquímica (Figura 1A). Os resultados foram resumidos na Tabela 1. As amostras que overexpressed RBP2 representaram 52,46% das amostras de câncer, ea maioria destas amostras apresentaram intermediário a coloração forte. No entanto, as amostras com superexpressão RBP2 representaram apenas 29,79% dos tecidos pulmonares normais adjacentes, ea maioria destas amostras exibiram fraca para coloração intermediária. A expressão de RBP2 foi significativamente superior nas amostras de NSCLC do que nos tecidos normais do pulmão (Tabela 1). Os níveis de RBP2 em 10 tecidos de câncer de pulmão e seus tecidos pulmonares normais correspondentes foram ainda detectados utilizando Western blot e análises em tempo real PCR. Os resultados mostraram que ambas as proteínas RBP2 e ARNm foram aumentadas em tecidos de cancro do pulmão (Figuras 1B 1C).

. análise Immunohistochemistrical de RBP2, E-caderina, N-caderina e caracol (ampliação de × 200). RBP2, N-caderina e caracol foram fortemente positivos em ambas as amostras de adenocarcinoma eo carcinoma espinocelular, enquanto a E-caderina foi fracamente manchado ou sem manchas. análise de mancha B. ocidental da proteína RBP2. N = tecido pulmonar normal, C = tecido de câncer de pulmão. C. em tempo real A análise de PCR de ARNm RBP2. O nível de mRNA RBP2 foi maior nos tecidos de cancro do pulmão do que nos tecidos pulmonares normais (

P

= 0,0011). *

P Art 0,05 e **

P Art 0,01.

Variável superexpressão * (n)

taxa de superexpressão (%)

χ

2

P

Cancer tissue613252

n

. .465.5810.018Adjacent tissue471429.79Table 1. a expressão de RBP2 em tecidos NSCLC e os seus tecidos normais adjacentes

*: a coloração contagem final ≥ 4 foi definida como a sobre-expressão, e uma pontuação 4 foi definida como nonoverexpression. CSV Baixar CSV

Em seguida, analisamos a relação entre RBP2 e “características clínico-patológicas, incluindo os pacientes” Os pacientes idade, sexo, tipo patológico, diferenciação e classificação TNM. Os resultados mostraram que não houve uma clara associação entre a superexpressão de RBP2 e esses recursos (Tabela 2).

RBP2 (superexpressão *)

Variável

No. dos pacientes

não

sim

P

Age0.099≤50 years321220 50 years291712Gender0.167Male331320Female281612Pathological type0.757Squamous371720Adeno241212Differentiation0.532Well1064Moderate261313Poor251015T classification0.415T1-2411823T3-420119N classification0.533N0291514N1321418Table 2 .. a correlação de variáveis ​​clínico-patológicas com a proteína RBP2 em tecidos NSCLC

*: marcar um coloração definitiva ≥ 4 foi definida como a sobre-expressão, e uma pontuação 4 foi definida como nonoverexpression. CSV Baixar CSV

Efeitos de RBP2 em NSCLC migração celular

Para explorar o papel da RBP2 na metástase do cancro do pulmão, nós investigamos se RBP2 regula a migração celular. Em primeiro lugar, foi verificada a inibição da RBP2 pelos três siRNAs RBP2 em células A549 para escolher o siRNA mais eficaz. A análise de transferência de Western mostrou que o nível de proteína RBP2 foi elevada nas células de controlo A549 e diminuíram após a interferência de ARN de RBP2. Importantemente, o grupo RBP2 siRNA2 exibiu a menor expressão de proteína RBP2 (Figura 2A). Além disso, a expressão de RBP2 no grupo RBP2 siRNA2 foi detectada por análise de imunofluorescência. Os resultados mostraram que RBP2 foi negativa no grupo RBP2 siRNA2 mas positiva no grupo de controlo (Figura 2B). Assim, nós escolhemos RBP2 siRNA2 para a depleção de RBP2 nas experiências seguintes. Em seguida, os comportamentos migratórios celulares das células A549 e as células foram estudados utilizando Beas2B Transwell ensaio de invasão e cura de feridas ensaio. Comparado com o grupo controle, menos células A549 passaram pelo matrigel após deleption de RBP2 enquanto mais células Beas2b passado quando RBP2 foi regulada (Figuras 3A 3B). Consistentemente, havia menos células A549 que migraram a partir da extremidade “ferida” para o centro do espaço quando RBP2 foi regulada para baixo, mas o número de células Beas2b migraram foi significativamente aumentada após a sobre-expressão de RBP2 (Figuras 3C 3D). Estes dados indicaram que RBP2 provavelmente desempenha um papel na migração celular.

. Os níveis de proteína RBP2 nas células A549 tratadas separadamente com diferentes ARNsi. B. A análise de imunofluorescência de RBP2 em células A549 não tratadas e células tratadas com RBP2 siRNA2 (ampliação x 200).

A. análise de invasão Transwell (ampliação x 200). B. O número de células invadidas. Mais Beas2B células invadidas após transfecção com o plasmídeo pcDNA3-HA-RBP2 (

P

= 0,0011), enquanto que o número de células A549 invadidos diminuiu significativamente quando tratados com RBP2 siRNA2 (

P = 0,0005

). *

P Art 0,05, **

P Art 0,01 e ***

P Art 0,001. C. O número de células que migraram. O número de células Beas2B migraram aumentou significativamente quando transfectadas com o plasimid pcDNA3-HA-RBP2 (

P

= 0,0010), enquanto que menos células A549 migraram para o espaço central quando transfectadas com RBP2 siRNA2 (

P

= 0,0014). *

P Art 0,05, **

P Art 0,01 e ***

P Art 0,001. D. Wound Healing (ensaios de ampliação x 100).

correlações bivariadas de RBP2 com a E-caderina, N

–

caderina ou caracol nos tecidos NSCLC

Para investigar os papéis de RBP2 na metástase do cancro, nós estudaram o efeito de RBP2 em EMT, como EMT está estreitamente correlacionada com a metástase do cancro [19]. Em primeiro lugar, a caderina-E, N-caderina e caracol foram detectados nos tecidos de cancro do pulmão e os seus tecidos normais do pulmão usando imuno-histoquímica (Figura 1A) correspondente. A taxa das amostras que sobre-expressa a caderina-E diminuído nos tecidos de cancro em comparação com os seus tecidos adjacentes normais (vs normal do cancro, 80,85% vs 40,98%,

P

0,01), mas a taxa de amostras que sobre-expresso de N-caderina ou caracol aumentado nos tecidos de cancro (cancro vs normal, N-caderina, 12,77% vs 72,13%,

P

0,01; cancro vs normal, caracol, 17,02% vs 68,85%,

P Art 0,01). Subsequentemente, as correlações bidimensionais de RBP2 com cada uma destas três proteínas foram analisadas pelo χ

2 teste. Os resultados mostraram que a expressão de RBP2 foi significativamente inversamente correlacionada com a expressão de E-caderina (Tabela 3), mas não houve associação significativa entre RBP2 e N-caderina ou caracol (Tabela 3).

RBP2 (superexpressão *)

Variável

No. do patients

no

yes

P

E-cadherin0.032overexpression*25169nonoverexpression*361323N-cadherin0.095overexpression*441826nonoverexpression*17116Snail0.276overexpression*421824nonoverexpression*19118Table . 3. Correlações entre RBP2 e E-caderina, N-caderina e caracol em tecidos NSCLC

*: A coloração contagem final ≥ 4 foi definida como a sobre-expressão, e uma pontuação de coloração 4 foi definida como nonoverexpression. CSV Baixar CSV

Efeitos de RBP2 sobre EMT em linhas celulares de NSCLC

Para confirmar ainda mais os efeitos da RBP2 na EMT, detectamos a expressão de RBP2, E-caderina, N-caderina e caracol na Beas2B , células A549 e SK-MES-1 usando células de western blot e análises em tempo real PCR. A análise Western blot mostrou que a expressão de RBP2, N-caderina e caracol aumentado, ao passo que a expressão de E-caderina diminuiu nas células Beas2B transfectadas com o plasmídeo pcDNA3-HA-RBP2 (Figura 4A). Enquanto isso, tanto a A549 e SK-MES-1 células exibiram níveis inferiores de RBP2, N-caderina e proteínas caracol e nível mais elevado de proteína E-caderina, quando transfectadas com RBP2 siRNA2 (Figura 4A). Da mesma forma, a análise por PCR em tempo real mostraram ainda que a RBP2, N-caderina e ARNm caracol aumentado e o nível de ARNm da E-caderina diminuiu nas células Beas2B tratados com o plasmídeo pcDNA3-HA-RBP2 (Figura 4B). Além disso, foram observados níveis mais baixos de RBP2, N-caderina e ARNm caracol e um nível mais elevado de ARNm de caderina-E, tanto na A549 e SK-MES-1, células que foram tratadas com RBP2 siRNA2 (Figura 4C).

A. A análise de Western blot de RBP2, E-caderina, N-caderina e caracol expressão nas Beas2B, SK-MES-1 e células A549. Quando as células foram transfectadas com Beas2B o plasmídeo pcDNA3-HA-RBP2, os níveis de RBP2, proteínas N-caderina e caracol aumentada, e o nível de proteína E-caderina diminuiu. Quando as células SK-MES-1 e A549 foram transfectadas com RBP2 siRNA2, os níveis de RBP2, N-caderina e proteínas caracol foram aumentados, e o nível de proteína E-caderina diminuiu. B. análise em tempo real dos níveis de E-caderina, N-caderina e mRNAs caracol nas células Beas2B. O nível de ARNm da E-caderina foi mais elevada nas células Beas2B tratados com o plasmídeo pcDNA3-HA-RBP2 do que nas células de controlo (Beas2B

P

= 0,0005), mas os níveis de N-caderina e ARNm caracol foram menores (N-caderina,

P

= 0,0063; caracol,

P

= 0,0101). *

P Art 0,05, **

P Art 0,01 e ***

P Art 0,001. C. análise em tempo real dos níveis de E-caderina, N-caderina e ARNm em caracol as células A549. O nível de ARNm da E-caderina foi menor nas células A549 tratadas com RBP2 siRNA2 do que nas células de controlo (A549

P

= 0,0007), mas os níveis de N-caderina e ARNm caracol foram maiores (N- caderina,

P

= 0,0037; caracol,

P

= 0,0014). *

P Art 0,05, **

P Art 0,01 e ***

P Art 0,001.

Efeitos de RBP2 sobre o promotor de E-caderina

Porque Huang et al. confirmou que RBP2 pode ligar directamente à região promotora (-799 a -579) de E-caderina [18] utilizando um ensaio CHIP, foi examinada a actividade da mesma região do promotor de E-caderina, utilizando um ensaio de luciferase na A549 e Beas2B células. Quando as células A549 foram transfectadas com RBP2 siRNA2, a actividade do promotor de E-caderina aumentou significativamente (Figura 5A), enquanto que a actividade do promotor de E-caderina diminuiu dramaticamente após a sobre-expressão em células RBP2 Beas2B (Figura 5B).

A. atividade do promotor de E-caderina Eelevated nas células A549 transfectadas com RBP2 siRNA2 (

P

= 0,0098). *

P Art 0,05, **

P Art 0,01. B. A inibição da actividade do promotor em células Beas2B transfectadas com o plasmídeo pcDNA3-HA-RBP2 (

P

= 0,0075). *

P Art 0,05, **

P Art 0,01. C. A expressão das proteínas P-Akt e Akt nas células A549 tratadas com RBP2 siRNA2. D. Os níveis de p-Akt, proteínas N-caderina e caracol nas células A549. Quando as células A549 foram tratadas com LY294002, a expressão destes três proteínas foi reduzida

Efeitos de RBP2 sobre N

-.

Caderina e caracol

Ambos N- caderina e caracol foram mostrados para ser a jusante da via PI3K /Akt [20,21]. Portanto, a hipótese de que RBP2 regulada N-caderina e caracol através da activação de sinalização de Akt, e foram examinados os níveis de P-Akt e Akt nas células A549 utilizando análise de Western blot. Os resultados mostraram que a proteína P-Akt estava elevada nas células A549 e diminuíram após o esgotamento de RBP2 (Figura 5C). A expressão de P-Akt estava positivamente correlacionada com a expressão de RBP2. Em seguida, para confirmar os efeitos de sinalização de Akt sobre a expressão de N-caderina e caracol, que trataram células A549 com um inibidor de PI3K (LY294002), durante 24 h e examinados os níveis de N-caderina e proteínas caracol. LY294002 foi mostrado para bloquear a actividade de fosforilação e Akt quinase dependente de PI3K. Interessantemente, os níveis tanto de N-caderina e caracol diminuiu (Figura 5D). Portanto, a expressão de N-caderina e caracol foi positivamente associado com a expressão de p-Akt.

RBP2 Discussão

, um demethylase histona recém-identificado, pertence à família Jarid e possui uma ÁRIDO (Um domínio rica interação /T). É muitas vezes ocupa e regula os promotores de genes múltiplos que contêm o H3K4me3 [5,22]. Mais importante ainda, RBP2 Acredita-se que participam em muitas funções biológicas de células, especialmente na biologia do tumor. O nosso estudo revela uma visão nova para a fisiopatologia da EMT, e nós fornecemos evidências de que RBP2 induz EMT em NSCLC.

RBP2 desempenha um papel importante no câncer humano. Por exemplo, a sobre-expressão de RBP2 inibe a senescência das células de cancro gástrico [11]. O esgotamento dos RBP2 prejudica a proliferação, mas promove a senescência e diferenciação em camundongos sem Men1 e Rb1 [23]. tolerância à droga de células de câncer de pulmão exige RBP2 [24]. Knockdown de RBP2 levou ao aumento dos níveis de H3K4me3 aos promotores do DAF e genes HMOX1 nas células Beas2B [25]. RBP2-regula a expressão de ciclina D1, ciclina E1 e integrina b1 para aumentar a proliferação celular, migração e invasão [12]. Neste artigo, nós também detectada a expressão de RBP2 em tecidos NSCLC e analisadas as relações entre RBP2 e cada uma das características clínico-patológicas de NSCLC. Os resultados mostraram que RBP2 foi sobre-expresso em NSCLC humano, mas não houve relação significativa entre a superexpressão de RBP2 e cada recurso clínico-patológico. Além disso, foram estudados os efeitos da RBP2 sobre a migração de células de câncer de pulmão, e descobrimos que RBP2 poderia aumentar NSCLC migração celular. Todos estes dados sugerem que RBP2 é um oncogene e fornecer orientações para tratamento de câncer.

EMT é um passo crucial na metástase do câncer. Durante este processo, as células cancerígenas derivadas de células epiteliais de perder as suas características epiteliais, tais como a adesão celular, mas adquirem características mesenquimais, tais como a motilidade celular, a fuga a partir do tecido primário e invadem o estroma circundante [26-30]. Epitelial caderina (caderina-E), uma molécula de adesão celular, é uma molécula-chave da EMT. Ela desempenha um papel fundamental na manutenção do fenótipo epitelial. A ausência de E-caderina conduz a uma perda de morfologia epitelial [31]. Curiosamente, a expressão reduzida de E-caderina é muitas vezes acompanhado por um aumento da expressão de caderina neuronal (N-caderina) [32]. N-caderina tem sido mostrado para enfraquecer a adesão celular e promover a capacidade de invasão de células de cancro da mama [32,33]. Caracol é outra molécula importante da EMT. Foi confirmado que a sobre-expressão do caracol aumenta a invasão do cancro, através da promoção da motilidade de células [34]. Nesta experiência, foi demonstrado RBP2 para sobre-regular a expressão de E-caderina e infra-regular a expressão de N-caderina e caracol. Estes resultados indicam que RBP2 é capaz de induzir EMT. Recentemente, Teng et ai. confirmou que RBP2 promoveu a metástase do câncer, ativando β1 integrina [12]. Aqui, apresentamos um novo mecanismo que RBP2 pode desempenhar um papel na metástase do câncer através da indução de EMT.

E-caderina foi bem demonstrado ser um mediador chave da EMT, e interrupção de E-caderina é provou ser uma causa de EMT. Por exemplo, Cheng et al. e Masszi et ai. encontrado que o TGF-β1 foi incapaz de induzir EMT na presença de contacto célula-célula [35,36]. Masszi et ai. ainda concluir-se que a ausência de contacto célula-célula mediada por E-caderina foi permissiva para a indução de EMT. Consistente com Masszi et al., Zheng et al. relataram que o TGF-β1 não poderia induzir EMT em células epiteliais confluentes tubular, mas que a sobre-expressão de E-caderina em fibroblastos induzida transição mesenquimais-epiteliais e EMT inibida em células epiteliais tubulares [37]. Vários factores de transcrição têm sido mostrados para controlar EMT suprimindo a actividade do promotor de E-caderina e reprimindo a expressão de E-caderina [38,39]. Neste trabalho, nós investigamos se RBP2 EMT induzida por suprimir a atividade do promotor E-caderina e inibir a expressão da caderina-E. Porque Huang et al. confirmou que RBP2 directamente ligado à região do promotor de E-caderina (-799 a -579) [18], foi examinada a actividade da mesma região promotora de E-caderina e verificaram que, de facto enfraquecido RBP2 actividade do promotor de E-caderina. Estes resultados indicam que RBP2 sub-regula a expressão de E-caderina através da inibição da actividade do promotor de E-caderina.

O mecanismo pelo qual regula RBP2 N-caderina e caracol foi também estudada no presente documento. Muita evidência aponta para um papel crítico da Akt sinalização na EMT. Por exemplo, a activação da sinalização de Akt promove TGFβ- e EMT dependentes de EGF [40,41]. Akt também pode fosforilar IKKα para aumentar a expressão de Snail [20]. Biflorina bloqueou a capacidade de invasão das células por regulação para baixo-N-caderina, mais provavelmente através de sinalização de Akt [21]. Aqui, as nossas observações demonstraram que RBP2-regulado a expressão de N-caderina e caracol através da activação de sinalização de Akt, e o inibidor da Akt poderia bloquear os efeitos de RBP2 sobre a expressão de N-caderina e caracol.

recentemente, Teng et ai. fez análise de cDNA microarray em células NSCLC [12]. E eles descobriram que 10 genes que participam na metástase foram significativamente alterados após a depleção de RBP2, incluindo dihydropyrimidinase-like 3, β1 integrina, soluto família transportadora 7 membros 11, soluto família transportadora 7 membros 5, Desmogleína 2, liase esfingosina-1-fosfato 1 , colágeno tipo 1 α1, 1α tropomiosina, ciclo de divisão celular 42 e β10 protocadherin. No entanto, este estudo não analisou os efeitos da RBP2 sobre E-caderina, N-caderina e caracol que são moléculas importantes envolvidas na metástase do câncer. A nossa investigação enriquece os mecanismos de metástases do cancro mediada por RBP2.

Além disso, EMT foi mostrado resultar em resistência adquirida a gefitinib em células NSCLC [42]. Enquanto isso, RBP2 é essencial a gefitinib resistência em células NSCLC [24]. De acordo com nossos resultados, podemos inferir que a resistência gefitinib mediada por RBP2 em células NSCLC pode estar intimamente relacionada com o efeito de RBP2 na EMT.

A terapia medicamentosa é um tratamento importante para o câncer de pulmão. Considerando a taxa de sobrevivência pobres atual, são urgentemente necessários novos alvos terapêuticos. Tem sido demonstrado que RBP2 é sobre-expresso no cancro do pulmão, e a sua expressão é altamente associado com a proliferação de células de cancro, invasão, migração e tolerância ao fármaco. Nossos experimentos mostraram que RBP2 poderia induzir EMT em NSCLC. Todos estes estudos indicam que RBP2 é um alvo potencial para a terapia do cancro anti-pulmão.

Reconhecimentos

Gostaríamos de agradecer William G. Kaelin, Jr. (Howard Hughes Medical Institute, Dana Instituto -Farber Câncer e Hospital Brigham and Women, Harvard Medical School, EUA) para os plasmídeos.