Abstract

Entre os muitos genes regulados por andrógenos identificados, sGCα1 (guanilato ciclase solúvel α1) parece desempenhar um papel fundamental na mediação dos efeitos pró-cancerosas de andrógenos e receptor de andrógeno. O papel clássico para sGCα1 é para heterodimerizar com a subunidade sGCβ1, formando sGC, a enzima que medeia a sinalização de óxido nítrico por catalisar a síntese do monofosfato de guanosina cíclico. Os dados publicados mostram que sGCα1 pode conduzir a proliferação celular do cancro da próstata independente de hormonas e fornecer células cancerosas de uma função pró-sobrevivência, através de um novo mecanismo para a inibição de p53, ambos os quais são independentes um do sGCβ1, NO e de cGMP. Todas essas propriedades fazem sGCα1 um importante novo alvo para terapia de câncer de próstata. Assim, os péptidos foram concebidos visando sGCα1 com o objectivo de interromper actividades pró-cancro desta proteína. Um péptido (A-8R) foi determinada como sendo citotóxicos fortemente às células cancerosas da próstata, rapidamente induzir apoptose. A citotoxicidade foi observado em ambas, células de cancro da próstata refractário a hormonas e, significativamente dependentes de hormonas, abrindo a possibilidade de que este péptido pode ser utilizado para tratar o cancro da próstata resistente à castração normalmente letal. Em estudos de xenotransplante de rato, Peptide A-8R foi capaz de parar o crescimento do tumor de células não só hormono-dependentes, mas o mais importante a partir de células independente de hormonas. Além disso, o mecanismo de Péptido A citotoxicidade é a geração de espécies de oxigénio reactivas, que foram recentemente reconhecidos como um importante mecanismo de acção de medicamentos contra o cancro importantes. Assim, este trabalho fornece fortes evidências de que a segmentação um gene regulado por AR importante é um novo paradigma para a terapia eficaz do câncer de próstata

Citation:. Gao S, Hsieh CL, Bhansali M, Kannan A, Shemshedini L (2013) a Peptide contra solúvel guanilato ciclase α1: Uma nova abordagem para tratar o cancro da próstata. PLoS ONE 8 (5): e64189. doi: 10.1371 /journal.pone.0064189

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria

Recebido: 18 Janeiro, 2013; Aceito: 13 de abril de 2013; Publicado em: 27 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Gao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Institutes of Health. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Um importante tecido alvo de andrógenos e receptor de andrógeno (AR) é a próstata. Como o desenvolvimento de próstata normal, o crescimento e a progressão do cancro da próstata estão também dependentes de androgénios e AR [1]. Tanto no desenvolvimento da próstata e na próstata normal, carcinogénese, andrógenos e AR são importantes na regulação da proliferação e sobrevivência de células da próstata [2]. Andrógeno ablação por castração em ratos leva a uma diminuição da proliferação e aumento da apoptose de células epiteliais luminais da próstata, resultando na regressão da glândula da próstata. Quando os níveis fisiológicos de androgénios são substituídos num rato castrado, proliferação de células epiteliais da próstata é aumentada e a apoptose é diminuída, conduzindo a reconstituição de uma próstata normal de [3]. Recentemente, demonstrou-se que a mutação do AR é suficiente para provocar o desenvolvimento do cancro da próstata e progressão [4] e que a sobre-expressão de AR converte o crescimento do cancro da próstata a partir de para-dependente de androgénio-andrógeno independente [5]. Todos os dados acumulados até ao momento sugerem fortemente que os andrógenos, através da actividade de AR, regular a taxa de proliferação celular enquanto inibem a taxa de morte celular na próstata [6]. A desregulação deste equilíbrio entre a proliferação celular e a morte celular é, sem dúvida, crítica para o desenvolvimento de cancro da próstata

Nós mostramos anteriormente que um importante mediador da proliferação de células de cancro da próstata é solúvel α1 guanilil ciclase (sGCα1;. Do gene

GUCY1A3

) [7]. sGCα1 foi originalmente identificado como um componente de sGC, uma enzima heterodimérica, constituída por subunidades sGCα1 e sGCβ1, que medeia as funções biológicas do óxido nítrico (NO) [8]. Nesta via de sinalização fisiologicamente importante e ubíquo, NÃO se liga e activa sGC, levando à formação do segundo mensageiro cGMP (3 ‘, 5’-monofosfato cíclico de guanosina), que, em seguida, activa uma variedade de alvos a jusante, incluindo a proteína cinase G [9]. Nosso laboratório recentemente identificado sGCα1 como um novo gene AR-regulamentada [7]. Mostrámos que o promotor sGCα1 é um alvo de regulação de AR e resulta em níveis muito mais elevados de proteína do que de sGCα1 sGCβ1 em células LNCaP [7]. sGCα1 é essencial para o crescimento de ambas as células de cancro da próstata andrógeno-dependentes e independentes de androgénios. Importante, este efeito é independente da sGCβ1, NO e de cGMP e, assim, a actividade da enzima GCs [7]. Além disso, a expressão sGCα1 é apenas detectável em tecidos normais da próstata e é marcadamente elevada em tecidos de cancro da próstata, com os níveis de expressão com aumento estágio da doença e aumentando os níveis mais elevados observados no cancro da próstata refractário a hormonas [7]. Mais recentemente, o nosso laboratório relatou que sGCα1 pode bloquear a actividade de p53 em e, assim, melhorar a sobrevivência de células de cancro da próstata [10].

Todas essas funções pró-cancerosas de sGCα1 sugerem que esta proteína pode ser um bom alvo para terapia de câncer de próstata. Para resolver isso, usamos os nossos dados anteriores que mostram que sGCβ1 e atividade da enzima GCs não estavam envolvidos em sGCα1 funções pró-cancerígenas e, assim, a hipótese de que sGCβ1 dimerização com sGCα1 pode perturbar suas funções pró-proliferação e de pró-sobrevivência. Isto levou-nos a considerar uma abordagem baseada em peptídeo por perturbar sGCα1 funções pró-cancerosas, projetando peptídeos que imitavam os domínios de heterodimerização sGCβ1. Colocámos a hipótese de que tais péptidos seria capaz de se ligar especificamente a sGCα1 e interromper as suas funções. Entre os quatro peptídeos utilizados, dois deles apresentaram atividade citotóxica contra células cancerosas da próstata. Um péptido, denominado A-8R, mostrou a actividade mais forte e, assim, foi seleccionado para posterior estudo. Péptido A-8R não só foi citotóxico para as células em cultura, mas também tinha actividade anti-cancro contra tumores da próstata forte resistente à castração em estudos de xenoenxerto de ratinho. Além disso, os nossos dados mostram que o péptido A-8R mata as células cancerosas através da geração de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e indução de dano do ADN. Nossos resultados aqui identificar um novo peptídeo que pode parar o crescimento do câncer de próstata resistente à castração (CRPC).

Materiais e Métodos

Cultura de Células e Transfection siRNA

LNCaP, C81, PC-3 e células COS foram cultivadas como previamente descrito [7]. células CWR-22Rv1 foram cultivadas em meio RPMI-1640 com FBS a 10% e 50 ug /ml de gentamicina (Gibco). ARNsi de controlo, sGCα1 siARN e AKT siRNA (Dharmacon) a 50 nM de concentração final foi transfectado em células utilizando Lipofectamina Simax (Invitrogen).

A geração de linhas celulares estáveis ​​

A geração de linhagens de células estáveis ​​foi descrito previamente [11]. As células LNCaP foram transfectadas com 2? g de cada vector pCI-neo (controlo negativo da Promega), sGCα1 /pCI-neo usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) e seleccionadas em meios RPMI 1640 completo contendo 0,9 mg /mL de neomicina (Sigma). As colónias foram seleccionadas através da detecção de ARNm e os níveis de proteína sGCα1 utilizando PCR e transferência de Western.

Peptide Synthesis

Todos os péptidos utilizados neste estudo foram sintetizados pelo ChiScientific, em ≥95% de pureza, e eram Dissolveu-se em 70% de DMSO (ACROS orgânico).

adenovírus Infecção

C81 células foram infectadas com 5-50 MOI de qualquer um adenovirus expressando Akt (SignaGen) ou um adenovírus vazio como um controlo. Após 48 horas, as células foram sujeitas a um tratamento de péptido, seguida por ensaio de imunotransferência ou proliferação Ocidental.

Os ensaios de proliferação e apoptose

para a proliferação, as células foram cultivadas em meio contendo 2% de FBS extraído com carvão vegetal revestido com dextrano (DCC). 48 horas mais tarde, etanol ou 1 nM R1881 foi adicionado às células, seguido por tratamento com péptido. O ensaio de MTT (Sigma) foi usada como anteriormente [11], para determinar o número de células. Para a apoptose, 5000 células foram semeadas em placas de 96 poços e tratadas com veículo (DMSO), péptido A-8R (25 uM), etoposido (50? M) (Sigma) a diferentes pontos de tempo. O (3/7) actividade de caspase foi medida utilizando Apo-ONE Homogéneo A caspase-3/7 kit de ensaio (Promega). clivagem de PARP também foi utilizado para medir a apoptose, e é descrito abaixo.

Western Blotting

transferência de Western foi realizada como descrito [7] utilizando anticorpos primários contra sGCα1 (Cayman Chemical), Pan-Akt (Cell Signaling Technology), fosfo-AKT (S473, T308) (Cell Signaling Technology), fosfo-PDK1 (Cell Signaling Technology), fosfo-GSK-3β (Cell Signaling Technology), PARP (Cell Signaling Technology), e β- actina (Abcam).

a imunocitoquímica

imunocitoquimica foi usado para estudar a localização subcelular de sGCα1 e biotina marcada com péptido-8R em células LNCaP. Marcado com FITC-anticorpo anti sGCα1 (1:100 diluição; Santa Cruz Biotechnology), anticorpo anti-biotina; foram utilizados (1:200 Santa Cruz Biotechnology) para immunocytochemisty como descrito [12]

A imunoprecipitação, Biotina. suspenso, e Afinidade de ligação

imunoprecipitação (IP) em células LNCaP foi realizada como descrito anteriormente [10]. extractos de células completas a partir de células LNCaP foram sujeitos a IP utilizando proteína A /G mais agarose (Santa Cruz). IP anticorpos foram contra sGCα1 (Cayman Chemical), sGCβ1 (Cayman Chemical), ou IgG de coelho (Santa Cruz) como controlo. Para Biotina suspenso, 5 ug biotina marcada com péptido A foi incubado com NeutrAvidin agarose resina (Thermo Scientific) durante 3 horas a 4 ° C, após o que foi adicionado extracto de células inteiras a partir de células LNCaP e incubadas durante a noite a 4 ° C. A resina foi lavada e eluida com tampão de amostra de SDS, seguido por electroforese em gel de SDS-PAGE. Para o ensaio de competição, a mesma experiência foi repetida com a seguinte alteração: extracto celular de LNCaP foi dividido em 3 partes iguais, com cada parte de recepção 5 ug Péptido A-8R-Biotina e veículos, 150 ug de péptidos C-8R, ou 150 ug péptido a-8R.

para experiências de ligação de afinidade, extracto de células inteiras a partir de células C81 foi incubado com diferentes concentrações de péptido a-8R marcado com FITC à temperatura ambiente durante 2 horas. IPs foram realizadas utilizando anticorpos contra sGCα1 ou IgG de coelho como controlo. Péptido A-8R-FITC suspenso foi medida através de um sinal de fluorescência a comprimentos de onda de excitação e emissão de 485 e 521 nm, respectivamente, utilizando um leitor de fluorescência de placas multi-poços.

Medição ROS e salvamento

níveis intracelulares ROS foram avaliados utilizando a sonda fluorescente 5- (e-6) -Clorometil-2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetato (CM-H

2DCFDA) (Invitrogen). Após os tratamentos com o péptido A-8R, células C81 foram carregados com 20 um CM-H

2DCFDA e incubou-se a 37 ° C durante 30 min no escuro. As células foram então lavadas com PBS e a fluorescência foi medida nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 490 e 535 nm, respectivamente, utilizando um leitor de fluorescência de placas multi-poços. Para NAC (N-acetilcisteína) (Sigma) experiência de recuperação, as células foram pré-tratadas com 1 ou 5 mM de NAC durante 2 horas antes da adição de Péptido A-8R.

Comet Ensaio

C81 células eram tratados com Péptido a-8R durante 1 hora, após um pré-tratamento de 2 horas com 5 mM de NAC ou veículo, e tratadas com tripsina, e misturado com o cometa LM-agarose (CometAssay, Trevigen) e transferidas para lâminas. A electroforese e coloração Sybr-Green foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante.

Estudos de xenoenxerto de tumor do rato

2 × 10

6 C81 células em 50 ul de meio de crescimento foi misturado com 50 uL Matrigel (BD Biosciences) e injectado em ambos os flancos de ratinhos machos SCID idade 4-6 semanas. Quando os tamanhos do tumor atingiu 200 mm

3, 50 uL de péptido A-8R (40 mg de peptídeo A-8R /kg de animal) ou veículo (DMSO) foi injectado directamente para os tumores a cada dois dias. As injecções foram paradas após 5 vezes e os tumores foram medidos a cada 3 dias. Os ratinhos foram sacrificados após 3 semanas e os tumores foram excisados. Todos os procedimentos foram aprovados pela Universidade de Toledo Divisão de Laboratório recursos interpostos Animais (DLAR). Os extractos de proteína foram preparadas por fervura do tecido tumoral em 3 tampão × SDS, e avaliadas por gel de SDS-PAGE.

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações contidas no Guia para o Cuidado e Uso de Laboratório animais dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use da Universidade de Toledo (número de protocolo: 106.418). Durante os experimentos todos os animais foram monitorados diariamente para morbidade e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. No final do estudo todos os animais foram sacrificados usando inalação de dióxido de carbono, após o que a cirurgia foi realizada a ressecção de tumores de todos os animais.

Resultados

Os péptidos de direccionamento são sGCα1 citotóxico para as células do cancro da próstata

os nossos dados demonstram que sGCα1 é necessário para a sobrevivência [10], e proliferação de [7], de células de cancro da próstata sugerem que esta proteína pode ser um bom alvo para a terapia do cancro da próstata. Para começar a abordar esta possibilidade, usamos esses dados anteriores que mostram que sGCα1 funções pró-cancerosas são independentes NO sinalização e sGCβ1 [7], [10] e que sGCβ1 pode aliviar a repressão sGCα1 mediada da atividade transcricional p53 [10], sugerindo que sGCβ1 dimerização com sGCα1 pode perturbar sGCα1 funções pró-cancerosas. Isto levou-nos a considerar uma abordagem baseada em peptídeo para interromper as funções sGCα1, utilizando peptídeos que imitam os quatro domínios sGCβ1 heterodimerização conhecidos [13]. Estes péptidos, denominados Péptido A, B, C, e D, variaram em comprimento de 11 a 19 aminoácidos. Cada péptido continha 8 argininas no terminal carboxilo (Fig. 1A), uma sequência conhecida por mediar a translocação da membrana do plasma e a internalização celular [14]. Os péptidos foram testados quanto à actividade em células LNCaP, uma linha celular que expressa ambos RA e sGCα1 [7]. Como mostrado na Fig. 1B, Peptide A-8R teve, uma atividade citotóxica forte, dependente da dose, matando quase todas as células no dia 4. Peptide B-8R também teve um efeito negativo, suprimindo o crescimento celular, mas não reduzir o número de células que o Peptídeo A-8R fez ( A Fig. 1B). Por outro lado, Péptidos C e D-8R-8R teve pouco efeito (Fig. 1B). Em virtude da sua actividade citotóxica forte, péptido A-8R foi seleccionado para posterior estudo.

(a) Quatro péptidos foram concebidos visando sGCα1, com cada péptido contendo oito argininas na extremidade C-terminal para a translocação da membrana. (B) As células LNCaP foram crescidas em soro a 10%, sob diferentes concentrações dos quatro péptidos, como mostrado. O número de células foi medido após 0-4 dias de incubação. Os pontos de dados representam as médias de três experiências independentes e mais desvios padrão. Os asteriscos indicam significância estatística (P 0,0002). Of Peptide A atividade, em relação ao veículo

Peptide um Associates com endógena sGCα1 em células cancerosas da próstata

Peptide A-8R foi projetado para interagir com sGCα1, o que foi confirmado por meio de três métodos. Péptido A-8R foi sintetizado com uma etiqueta de biotina na extremidade C-terminal, dando péptido A-8R-Biotina. No primeiro ensaio, as células LNCaP foram tratados com Péptido A-8R-Biotina e submetido a imunocitoquímica, utilizando um anticorpo contra Biotina para detectar o péptido A-tagged 8R e outro contra sGCα1 para detectar esta proteína (Fig. 2A). Tal como observado anteriormente, sGCα1 endógena foi encontrado exclusivamente no citoplasma de células LNCaP, em torno do núcleo [7]. Importante, péptido A-8R-biotina também foi encontrada no citoplasma e colocaliza com sGCα1, como mostrado pelas imagens fundidas. Estes resultados sugerem que o péptido A-8R-Biotina interage com sGCα1 endógena, o qual foi verificada por meio de uma experiência de pull-down. Neste segundo ensaio (Fig. 2B), extracto de células inteiras de LNCaP foi incubado com péptido A-8R-Biotina e submetido a purificação estreptavidina-agarose, conduzindo a co-purificação de sGCα1. Em contraste, as esferas de agarose foram incapazes de pull-down sGCα1 na ausência de Péptido A-8R-Biotina. Para medir a especificidade da ligação, o experimento suspenso foi repetido sob condições em que a quantidade em excesso não marcado de Péptido A-8R ou péptido C-8R foi adicionado à reacção com biotina marcada com péptido A-8R. Como mostrado na Fig. 2B, péptido A inibiu significativamente-8R Péptido interacção A-8R-Biotina com sGCα1, enquanto que o peptídeo C-8R não teve nenhum efeito, mostrando uma interacção específica do péptido A-8R com sGCα1. Utilizamos imunoprecipitação (IP) de sGCα1 para determinar a sua afinidade de ligação para o péptido A-8R. Péptido A-8R marcado com FITC foi usada para determinar se a ligação do péptido de afinidade (K

D) para sGCα1 foi de 11,6 uM (Fig. 2C), a qual cai dentro do intervalo activo de concentração de citotoxicidade péptido A-8R mediada . Colectivamente, estes resultados confirmam uma associação física específica entre o péptido A-8R e sGCα1. FIG. 2D mostra que a adição de um marcador de biotina para o Péptido A-8R não afectar a sua eficácia citotóxica.

células LNCaP (A) foram tratados com 25 uM péptido A-8R durante 2 horas e submeteu-se a imunocitoquímica marcado com biotina utilizando anti-sGCα1 ou anticorpo anti-biotina para medir a co-localização subcelular de sGCα1 endógena e péptido a-8R. DAPI foi utilizado para corar núcleos. extractos citossólicos (B) LNCaP foram incubadas com Péptido A-8R-Biotina e sujeito a purificação utilizando estreptavidina-agarose. Este experimento pull-down foi repetido com competindo quantidade excessiva de não marcado Peptídeo C-8R ou peptídeo A-8R. Em ambos os casos, transferência de Western foi utilizada para medir a co-purificação de sGCα1. (C) Os extractos de células de LNCaP foi incubado com diferentes concentrações de péptido A-8R-FITC e sGCα1 endógena foi imunoprecipitada. Péptido A-8R-FITC Purificou-Co foi quantificada medindo a emissão do sinal de fluorescência. A análise de regressão não-linear foi utilizada para determinar uma afinidade para ligação ao péptido A-8R para sGCα1. (D) As células LNCaP foram crescidas em soro a 10% com diferentes concentrações do péptido A-8R ou A-8R-Biotina, como mostrado. O número de células foi medido após 0-48 horas de incubação. Os pontos de dados representam as médias de três experiências independentes e mais desvios padrão. Os asteriscos indicam significância estatística (P 0,02). Of Peptide A atividade, em relação ao veículo

Peptide A não afeta atividade enzimática GCs

Desde Peptide A foi projetado para imitar um sGCβ1 domínio de heterodimerização, é possível que este péptido pode afectar sGCα1-sGCβ1 heterodimerização e, assim, a actividade da enzima. Para resolver a primeira possibilidade, medimos diretamente a interação de sGCα1 com sGCβ1 por IP usando anticorpos contra sGCα1 e sGCβ1. Péptido A-8R não teve nenhum efeito em ambos os co-sGCα1 IP com sGCβ1 sGCβ1 ou co-IP com sGCα1 (Fig. S1A), demonstrando claramente que o Péptido A não perturbar sGCα1-sGCβ1 heterodimerização. Confirmação para este foi obtido a partir de uma experiência de ELISA medindo a síntese de cGMP. Como mostrado na Fig. S1B, o tratamento R1881 marcadamente elevados níveis de cGMP, consistente com os nossos dados publicados anteriormente que mostra a indução de andrógeno de expressão sGCα1 e síntese de cGMP [7]. Importante, péptido A-8R foi incapaz de reprimir de forma significativa os níveis de cGMP, quer na ausência ou na presença de androgénio (Fig. S1B). Estes dados demonstram colectivamente que o Péptido A não perturbar a actividade da enzima e, portanto, GCs sugerem que o NO sinalização não esteja envolvido na sua citotoxicidade. Para testar diretamente isso, nós adicionamos 8-Br-cGMP para células tratadas. 8-Br-cGMP não teve efeito sobre veículo- ou células tratadas com Péptido A-8R, ao mesmo tempo que era capaz de células de resgate parcialmente tratados com o inibidor da enzima de ODQ sGC (Fig. S1C). A segunda abordagem foi a de adicionar o agente de sequestro NO C-PTIO, o que aumentou em vez de aliviada a citotoxicidade de Peptide A-8R em 10 e 25 um, mas curiosamente não 50? M (Fig. S1D). Estes dados mostram coletivamente que Peptide A-8R não interfere com nem dependem NO sinalização.

péptido A bloqueia o crescimento de ambas as células dependente de hormonas e células cancerosas da próstata resistente à castração, mas não sGCα1 deficientes

Para determinar se androgénio influenciou a actividade citotóxica do péptido a-8R, a experiência na Fig. 1B foi repetida na presença de hormona. Como mostra a fig. mostra 3A, Peptide A-8R tinha a mesma atividade citotóxica potente com ou sem andrógenos, causando todas as células a morrer por dia 6, quando tratadas com 50? M de peptídeos. Um péptido inactivo, o peptídeo C-8R, não teve efeito significativo na mesma concentração (Fig. 3A), o que demonstra que foi necessária a sequência de aminoácidos do Péptido A para o efeito citotóxico e excluindo potencial citotoxicidade induzida pela sequência de 8-arginina .

veículos ou diferentes concentrações de péptido a-8R ou C-8R, como mostrado, foi adicionado às células LNCaP dependente de hormonas (a) crescidas em soro a 2%, sem ou com 1 nM R1881, (C) células C81 ou CWR-22Rv1 resistente à castração, ou células (e) sGCα1 com deficiência de PC-3 ou COS. O número de células foi medida após vários dias de incubação. Os pontos de dados representam as médias de três experiências independentes e mais desvios padrão. Os asteriscos indicam significância estatística (P 0,03) do péptido A actividade, em relação ao veículo. Western blot foi usado para monitorar a expressão de sGCα1 endógeno em células (B) C81 e CWR-22Rv1, tratados com ou sem 1 nM R1881, ou (E) células COS PC-3 e, em comparação com células LNCaP. Note-se que β-actina foi utilizada para controlar a carga de proteína.

Para investigar se é necessário o sinal de translocação de membrana para a citotoxicidade do péptido A-8R, analisou-se a actividade de Péptido A falta 8 argininas . Como mostrado na Fig. S2, péptido A sem as argininas teve pouco efeito negativo, em contraste com o efeito citotóxico forte do péptido A-8R. Estes dados sugerem fortemente que a internalização celular é necessária para o efeito citotóxico péptido.

que anteriormente mostraram que sGCα1 promove a proliferação do cancro da próstata, e a sua expressão aumenta na fase superior de cancro da próstata [7]. Como foi mostrado anteriormente, a expressão da proteína sGCα1 é up-regulada por andrógenos em células andrógeno-dependentes, e constitutiva em células C81 e CWR-22Rv1 andrógeno-independente, com células CWR-22Rv1 que expressam níveis mais baixos do que as células C81 (Fig. 3b). Assim, estávamos interessados ​​para estudar o efeito de péptidos sobre essas células de câncer de próstata hormônio-refratário. Péptido A-8R foi muito eficaz na supressão do crescimento de células C81 (Fig. 3C), combinando o efeito sobre as células LNCaP dependente de hormonas. Péptido A-8R também foi eficaz na outra linha celular de cancro da próstata refractário a hormonas, células CWR-22Rv1, que são distintos a partir de células LNCaP (Fig. 3C). Mais importante, estes dados demonstram que as células de cancro da próstata refractário a hormonas são sensíveis ao efeito citotóxico do péptido A-8R como são células dependentes de hormonas, o que sugere que este péptido pode ser eficaz contra CRPC, a forma letal da doença.

endógena sGCα1 é expresso em LNCaP, C81, e células CWR-22Rv1 (ver Fig. 3B), todas as quais são sensíveis ao efeito citotóxico do péptido a-8R. Estes dados sugerem que o efeito de péptidos requer expressão sGCα1 endógena, um achado esperado uma vez que o alvo sGCα1 foi concebido de Péptido A-8R. Para obter mais evidências para esta hipótese, duas linhas celulares de cancro foram estudadas que não expressam sGCα1 endógeno (Fig. 3D). Péptido A-8R teve pouco ou nenhum efeito no PC-3 (cancro da próstata) ou células COS (cancro do rim do rato) (Fig. 3E). Estes dados apoiam fortemente a afirmação de que a atividade citotóxica de Peptide A-8R depende de proteína sGCα1 endógeno.

Peptide A Down-regula AKT em células cancerosas da próstata

Para entender celular como sGCα1 está mediando proliferação, utilizou-se um inibidor de qualquer das MAPK ou PI3K sinalização por AKT, duas vias de sinalização importantes que regulam a proliferação e a sobrevivência das células. proliferação de células LNCaP Curiosamente, o inibidor de PI3K LY294002-AKT dramaticamente reprimido (Fig. S3A). Isso nos levou a explorar a possibilidade de que sGCα1 pode induzir a proliferação através desta via de sinalização. Utilizando linhas de células LNCaP estáveis ​​que sobre-expressam sGCα1 (Fig. S3B), que apresentam uma melhor proliferação induzida por androgénio (Fig. S3C), verificou-se por transferência de Western que os níveis de AKT total e AKT fosforilado são muito elevados nestes e LNα1-6 LNα1-4 células (Fig. S3B); estas células também expressaram níveis mais elevados de PDK1 fosforilado, uma quinase que actue em AKT, e GSK-3β, um alvo de AKT [15]. Para confirmar que o aumento dos níveis de AKT eram devidas a sobre-expressão sGCα1, siARN foi usada para knockdown de expressão em células sGCα1 LNα1-6, resultando em níveis significativamente reduzidos de AKT total e fosforilada (Fig. S3D). Importante, sGCα1 não influenciaram os níveis de ARNm de AKT (dados não mostrados), sugerindo que actua sobre o sGCα1 proteína AKT, talvez afectar a sua estabilidade. Curiosamente, siRNA knockdown de sGCα1 (Fig. S3F) inibiu significativamente o crescimento de células LNCaP (Fig. S3E), demonstrando claramente que sGCα1 endógena fornece as células uma função de sobrevivência e estimulam o crescimento.

Tendo em vista o nosso dados acima (ver Figs. S3B, S3D) sugerindo que sGCα1 actua sobre a proteína AKT, ligação a sGCα1 Péptido a-8R pode ser esperado para afectar AKT. De facto, o tratamento de células LNCaP com o péptido A-8R teve um forte efeito negativo, dependente do tempo na proteína AKT, de tal modo que em 50 minutos a maior parte do AKT mensurável é ido (Fig. S4A). Como seria de esperar, AKT fosforilado foi afectada de forma semelhante (Fig. S4A). O controlo inactivo Péptido C-8R não teve nenhum efeito em ambos os níveis de AKT, total ou AKT fosforilada (Fig. S4A). Curiosamente, foi observado o mesmo efeito negativo sobre os níveis de proteína AKT (Fig. S4B) em tumores de xenoenxerto de ratinho (ver abaixo) tratados com Péptido A-8R, como observado em células LNCaP (Fig. S4A).

Estes resultados são consistentes com a hipótese de que o péptido a-8R perturba as funções pró-cancerosas de sGCα1 e sugerem que, pelo menos, um mecanismo da sua acção citotóxica é através de perturbação da proteína AKT. Para testar esta hipótese directamente, que sobre-expresso AKT utilizando um sistema de adenovírus, o que resultou em níveis significativamente elevados de AKT em células tratadas com 10 e 25 uM de péptido A-8R (Fig. S4C). Surpreendentemente, AKT-expressa adenovírus foi incapaz de salvar as células tratadas com 10- 50 uM péptido A-8R (Fig. S4D), sugerindo que a AKT sub-regulação não está envolvida na citotoxicidade Péptido A-8R-mediada.

células Peptide um câncer de próstata Kills pela geração de ROS

Desde AKT sobre-expressão não conseguiu resgatar células Peptide a-tratados (ver Fig. S4D), nós verificamos para um mecanismo diferente de citotoxicidade. Curiosamente, dados recentes têm mostrado que os medicamentos contra o câncer mais eficazes, incluindo a cisplatina e doxorrubicina, induzir a morte de células tumorais pela elevação dos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) [16], [17]. Tendo em vista a rápida citotoxicidade induzida por péptido A (dados não apresentados), foi examinada a possibilidade de que ROS foi envolvido. De facto, o tratamento com Péptido A-8R resultou na indução significativa de ROS nas células LNCaP no prazo de 30 minutos (Fig. 4a), enquanto que as células sGCα1-negativas PC-3 não respondem (Fig. S5A). Importantemente, o péptido inactivo, C-8R, falha para induzir a produção de ROS (Fig. S5B). Como esperado, a produção de ROS nas células LNCaP aumentou quando a concentração de péptido A-8R foi aumentada de 10 a 25 uM, mas, surpreendentemente, diminuiu com 50 uM (Fig. 4a). Estes resultados sugerem que a produção de ROS pode ser responsável pela citotoxicidade Péptido A-8R nas concentrações mais baixas de 10 e 25 uM, mas não a 50 uM.

células C81 (A) foram tratados com veículo ou umolar diferente As concentrações de Péptido a-8R e sem ou com 0-5 mM de NAC e monitorizados para a produção de ROS após 0-30 min, conforme medido por intensidade de fluorescência (FI). Os gráficos de barras representam médias de três experiências independentes e mais desvios-padrão. Observe que asteriscos em gráficos de barras encontrados com NAC são comparados aos dados equivalente sem NAC. células (B) C81 foram tratados com veículo ou concentrações diferentes de péptido A-8R, como mostrado, e NAC 0-5 mM, tal como mostrado, e monitorizados para o número de células após 0-6 dias de incubação conforme medido pelo ensaio de MTT. Os pontos de dados representam as médias de três experiências independentes e mais desvios padrão. Os asteriscos indicam significância estatística (P 0,04). células (C) C81 foram tratados com concentrações do veículo ou diferentes de péptido A-8R, como mostrado, e com ou sem 5 mM de NAC, como mostrado, e monitorizada danos do ADN após incubação de 1 h, conforme medido pelo ensaio do cometa.

Para fazer face a esta possibilidade, foi utilizado o limpador ROS NAC (N-acetilcisteína) [18]. Como mostrado na Fig. 5B, a NAC foi capaz de resgatar completamente a proliferação das células tratadas com 10 pM péptido A-8R ou quase completamente com 25 uM. Estes efeitos sobre a proliferação de NAC correspondem aos efeitos sobre a geração de ROS NAC Péptido A-8R-mediada (Fig. 4A), sugerindo fortemente que a geração de ROS é responsável por Péptido A citotoxicidade. Curiosamente, NAC não conseguiu recuperar de forma significativa o crescimento das células tratadas com 50 pM péptido A-8R (Fig. 4B). Esta constatação, juntamente com o nosso resultado anterior, mostrando a indução ROS mínimo com 50 mM Peptide A-8R (ver Fig. 4A), argumentam que essa alta concentração de péptido A-8R mata células via mecanismo independente de geração de ROS.

(a) LNCaP, (B) PC-3, ou (C), células COS foram tratados com veículo, o péptido a-8R (10 uM), ou etoposido (20 uM) durante 0-24 horas e sujeita a um ensaio de caspase para medir a apoptose. Os gráficos de barras representam médias de três experiências independentes e mais desvios-padrão. Todas as actividades são relativas à primeira condição, e esta actividade foi definido como 1. Os asteriscos indicam significância estatística (P 0,005). (D) As células LNCaP foram tratadas com o veículo, o peptídeo C-8R, péptido A-8R, ou etoposido (cada droga a 50 uM) durante 8 horas e monitorizada por apoptose medindo a clivagem de PARP utilizando Western blotting. Note-se que β-actina foi utilizada para controlar a carga de proteína.

a morte celular induzida por ROS está associada a danos no ADN [19], a qual é induzida fracamente por 10 uM péptido A-8R e muito mais fortemente por 25 uM, tal como medido por um ensaio de cometa (Figura 4C.); importante ainda, esta indução é completamente bloqueada por NAC, demonstrando claramente a danos no ADN induzida por péptido-A-8R requer a produção de ROS. Curiosamente, 50 uM péptido A-8R, que mata a maior parte das células, não desencadeia um sinal de cometa (Fig. 4C). Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig.