Abstract

Fundo

transmembranar proteína Lisossomo associada 4b-35 (LAPTM4B-35) é um membro da superfamília de proteínas 4-tetratransmembrane abrangendo de mamífero, que é sobre-expressa em vários tumores sólidos. No entanto, a expressão de LAPTM4B-35 e o seu papel na progressão do cancro da próstata (CaP) é desconhecida. O objetivo do presente estudo foi investigar a expressão LAPTM4B-35 em APC e sua relevância potencial para variáveis ​​clínicas e prognóstico.

Métodos

A imuno-histoquímica foi utilizada para determinar a expressão de LAPTM4B-35 proteína em tecidos 180 CaP em comparação com 180 espécimes normais da hiperplasia prostática benigna (BPH). Foi analisada a correlação entre a expressão da proteína LAPTM4B-35 e as características clínico-patológicas de pacientes com PCA.

Resultados

A análise estatística mostrou que LAPTM4B-35 expressão foi significativamente elevado em comparação com CaP os controlos HBP. Alta LAPTM4B-35 coloração estava presente em 71,11% de todos os casos com PCA. A superexpressão de LAPTM4B-35 foi significativamente associada com a metástase de linfonodo, vesícula seminal invasão, estágio APC, maior pontuação de Gleason, maior PSA pré-operatório e recorrência bioquímica (BCR). A análise de sobrevivência de Kaplan-Meier mostrou que a alta expressão de LAPTM4B-35 estava relacionado com os pobres sobrevida global e BCR-livre sobrevida de pacientes com PCA. Multivariada Cox análise mostrou que LAPTM4B-35 foi um fator prognóstico independente tanto para a sobrevivência e BCR-livre sobrevida global dos pacientes com PCA.

Conclusões

A superexpressão de LAPTM4B-35 pode estar associada a tumor progressão e mau prognóstico em APC e, portanto, pode servir como um novo marcador molecular para prever o prognóstico de pacientes com CaP

Citation:. Zhang H, Wei Q, Liu R, Qi S, Liang P, Qi C, et ai. (2014) sobre-expressão de LAPTM4B-35: A Novel marcador de mau prognóstico do câncer de próstata. PLoS ONE 9 (3): e91069. doi: 10.1371 /journal.pone.0091069

editor: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 25 de agosto de 2013; Aceito: 07 de fevereiro de 2014; Publicação: 20 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (nO: 81172451), Tianjin grande projeto Anti-Câncer (12ZCDZSY17200) e Science Foundation de Tianjin Medical University. (NO: 2009GSI18). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Como a neoplasia maligna mais comum em homens, o câncer de próstata (PCA) é a segunda causa mais comum de mortes relacionadas com tumores nos Estados Unidos [1]. Embora o prognóstico para pacientes com doença localizada ou regional é bom, para os pacientes nos Estados Unidos que desenvolvem a doença metastática, a taxa de sobrevida em 5 anos é de apenas 29% [2]. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes à carcinogênese e progressão do CaP ainda não foram totalmente explicados. Portanto, os esforços para identificar marcadores moleculares mais que poderia ser usado para detectar CaP, bem como individualizar o prognóstico do paciente e terapia são de grande importância clínica.

fatores prognósticos convencionais, tais como pontuação de Gleason, PSA níveis pré-operatórios ou proporção de biópsias envolvidos prever de modo insuficiente o resultado do paciente para terapias disponíveis atualmente. Eles são ainda mais limitadas na identificação de câncer de próstata insignificante, o cancro ou seja, que pode ser deixada sem tratamento, sem encurtar a expectativa de vida do paciente, mas poupando-lhe a morbidade do tratamento injustificada. Portanto, mais esforços para encontrar novos caminhos de diagnóstico e opções terapêuticas são urgentemente exigidos para otimizar a gestão do paciente [3] – [6]. A identificação de biomarcadores de câncer de próstata novos devem ser de primeira prioridade clínica, quando se toma em consideração a heterogeneidade problemática de tumores na próstata e as soluções que a medicina personalizada pode proporcionar. Esses biomarcadores deve ser capaz de melhorar o diagnóstico diferencial e indicando o curso da doença CaP tão cedo e tão preciso quanto possível, assim, em última análise, limitando a quantidade de procedimentos médicos não essenciais [7] – [10]. biomarcadores de tecido pode enriquecer significativamente esta abordagem, fornecendo informações significativas para a gestão das PCA através da utilização de espécimes de biópsias ou prostatectomies [8], [11].

Recentemente, LAPTM4B (lisossômico proteína transmem-brana 4A) , o qual foi inicialmente identificado como um novo gene regulado positivamente no carcinoma hepatocelular humano [12], [13], foi clonado com sucesso por exibição diferencial de fluorescência, amplificação rápida das extremidades de ADNc, e reacção em cadeia da polimerase-transcriptase reversa. Foi demonstrado que o gene LAPTM4B está mapeado no cromossoma 8q22.1 com um ARNm que consiste em 7 exões e codifica uma proteína de 35 kDa, LAPTM4B-35, que é uma proteína transmembranar de tipo-III com quatro regiões transmembranares putativos. Estudos têm demonstrado que a actividade de LAPTM4B-35 é elevado em vários cancros humanos. Além disso, a sobre-expressão de LAPTM4B-35 está associado com um prognóstico pobre e contribui para a transformação celular, tumorigênese e progressão destes cancros metastáticos em [14] – [18]. No entanto, o significado clínico-patológica e papel biológico da LAPTM4B-35 em CaP permanecem obscuros.

Até o momento, não houve relatos publicados avaliando o papel de LAPTM4B-35 expressão em CaP. Assim, o objetivo do presente estudo foi investigar a expressão de LAPTM4B-35 em CaP e analisar sua relação com várias características clínico-patológicas, incluindo o resultado do paciente CaP.

Materiais e Métodos

Paciente e amostras de tecidos

o consentimento informado foi obtido de todos os pacientes. Aprovação da Comissão de Ética Médica da Universidade de Medicina de Tianjin foi obtida para fins de investigação (TMUhMEC2012015). Após a aprovação Institutional Review Board, arquivado em formol fixa, amostras embebidos em parafina foram obtidos de 180 pacientes com CaP e 180 pacientes com hiperplasia prostática benigna (BPH), que foram tratados cirurgicamente no segundo hospital da Universidade de Medicina de Tianjin, Tianjin, China entre Janeiro de 1999 e Dezembro de 2010 [19] – [21]. Todas as amostras de tecido e slides foram examinados por patologistas experientes. Nenhum dos pacientes receberam quimioterapia, imunoterapia, cirurgia ou radioterapia antes. As características clinicopatológicas dos pacientes, incluindo PSA pré-operatório, a pontuação de Gleason, estágio APC, status do nó de linfa, estado invasão angiolinfática, status da margem cirúrgica, estado invasão das vesículas seminais e BCR estão resumidos na Tabela 1.

imuno-histoquímico de coloração

foram obtidas secções de quatro micrômetros nas amostras, embebidos em parafina fixadas em formalina, seguido por hematoxilina e eosina para confirmação patologia CaP. Nós levamos as secções imediatamente adjacente a hematoxilina e peças manchadas de eosina para imuno-histoquímica e desparafinados os tecidos selecionados em xilol e reidratados com concentrações de álcool graduadas sob procedimentos padrão. Subsequentemente, as secções desparafinadas foram imersos em tampão de 0,01 mol /L de citrato (pH 6,0) e aqueceu-se durante quinze minutos num forno de microondas. Após incubação sequencial com 3% de peróxido de hidrogénio e soro de cabra normal a 10% durante dez minutos, individualmente, a actividade da peroxidase endógena e a ligação não específica de imunoglobulina foram consecutivamente bloqueada nessa ordem. Em seguida, a técnica de imunoperoxidase avidina-biotina foi adotada para executar coloração imuno-histoquímica. As secções foram incubadas durante uma hora com anticorpo primário de coelho policlonal LAPTM4B-35 anticorpo anti-humano (diluição, 1:100) (LAPTM4BN199-Pab; Abcam Co) à temperatura ambiente, lavadas, e incubadas durante 30 minutos com anticorpo secundário biotinilado. Depois, as secções foram lavadas extensivamente com água, elas foram incubadas com um anticorpo secundário marcado com biotina seguido de estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano durante trinta minutos cada. A incubação com tetracloridrato de 3,3′-diaminobenzidina em 0,01% de H2O2, durante 10 minutos, o desenvolvimento de cor fornecidos. Em seguida, as lâminas foram contrastadas com hematoxilina de Meyer de trinta a sessenta segundos, e foram montadas em meio de montagem aquoso. Finalmente, imuno-histoquímica foi realizada com um estojo de imuno-histoquímica, seguindo as instruções do fabricante. lâminas de controlo negativos foram coradas com soro de coelho.

Coloração Avaliação

LAPTM4B-35 níveis de expressão de proteína foram classificados semiquantitativa com base nos escores totais combinados de a percentagem de células tumorais de coloração positiva e intensidade da coloração [21]. A percentagem de células positivas, medido como a extensão da imunocoloração, foi pontuado como se segue: 0, inferior a 5% da coloração; 1, 5% a 50%; e 3, 50% da coloração. A intensidade da coloração foi pontuada como se segue: 0, sem coloração, ou apenas fraca coloração; 1, coloração moderada; e 2, de coloração forte. A pontuação da intensidade da coloração mais a percentagem de coloração positiva foi utilizado para definir os níveis de expressão: 0 a 2, e baixa expressão de 3 a 4, de expressão elevada [21]. O procedimento de pontuação foi realizada em duplicado por 2 patologistas independentes que são experientes na avaliação de imuno-histoquímica e não tinha conhecimento da informação clínico-patológica ou os correspondentes hematoxilina e eosina slides. A taxa de concordância entre os dois patologistas primários foi maior do que 96%. Em casos de discordância significativa, as lâminas em questão foram re-avaliação simultaneamente pelos dois patologistas originais, juntamente com um terceiro patologista em um microscópio com várias cabeças, a fim de resolver a divergência de opinião.

Análise Estatística

O teste do qui-quadrado foi utilizado para analisar as diferenças de variáveis ​​categóricas. sobrevida global e BCR-livre foram calculados de acordo com o método de Kaplan-Meier e avaliados pelo teste de log-rank. regressão de Cox (modelo de riscos proporcionais) foi realizada para análise multivariada de preditores prognósticos. P 0,05 foi considerado significativo. A análise estatística foi realizada usando SPSS 17.0 software.

Resultados

LAPTM4B-35 proteína é overexpressed em tecidos CaP

LAPTM4B-35 expressão foi sobre-expressos em casos CaP comparação com BPH , ea diferença foi estatisticamente significativa (P 0,001) (Tabela 1). Como mostrado nas Figuras S1, S2, S3, S4, a expressão LAPTM4B-35 estava localizada no citoplasma das células da próstata. Dos 180 espécimes com PCA examinados, LAPTM4B-35 expressão era baixo em 52 (28,89%) de 180 pacientes com PCA e rica em 128 (71,11%) de 180 pacientes. expressão LAPTM4B-35 foi significativamente maior nos casos mais elevados de palco e vesícula seminal invasão APC; LAPTM4B-35 de expressão também foi significativamente aumentada em pacientes APC com metástases em linfonodos, maior PSA pré-operatório, maior pontuação de Gleason, e BCR. Além disso, não foi observada associação significativa entre LAPTM4B-35 imunorreatividade e idade, invasão angiolinfática e status margem cirúrgica. A associação entre LAPTM4B-35 de expressão e clínico-patológicas fatores é mostrada na Tabela 2.

O impacto da LAPTM4B-35 expressão na sobrevivência BCR-livre em CaP

Para examinar se LAPTM4B- 35 nível de expressão é um preditor significativo do tempo de BCR-livre após a prostatectomia radical, as curvas de Kaplan-Meier foram plotados entre a alta ou baixa LAPTM4B-35 e o tempo de BCR-livre. A baixa LAPTM4B-35 expressão tinham significativamente mais BCR-tempo livre após a prostatectomia radical em comparação com pacientes com alta LAPTM4B-35 expressão (P 0,001; Figura S5). Na análise univariada, alta expressão de LAPTM4B-35, maior pontuação de Gleason, e invasão de vesículas seminais foram relacionados a uma menor sobrevida livre de BCR para pacientes com PCA. A análise multivariada mostrou que a alta expressão LAPTM4B-35, pontuação de Gleason, e invasão de vesículas seminais foram os fatores prognósticos independentes para a sobrevivência BCR-free. Os resultados estão presentes na Tabela 3.

O impacto da LAPTM4B-35 expressão na sobrevida global em CaP

Para analisar o impacto da LAPTM4B-35 superexpressão na sobrevida global, nós primeira realizada a análise univariada de variáveis ​​clínico-patológicas tradicionais de prognóstico. variáveis ​​significativas na análise de sobrevida global incluído LAPTM4B-35 expressão, estágio APC, pontuação de Gleason, invasão das vesículas seminais e PSA pré-operatório. A análise de regressão multivariada de Cox se matricular parâmetros significativos acima mencionados mostraram que LAPTM4B-35 expressão, estágio APC, pontuação de Gleason, e PSA pré-operatório foram fatores prognósticos independentes para a sobrevida global dos pacientes com PCA. Os resultados são apresentados na Tabela 4.

Discussão

Neste estudo, foram analisados ​​LAPTM4B-35 expressão por imuno-histoquímica em CaP usando 180 espécimes cirúrgicos. Analisou-se a associação entre LAPTM4B-35 expressão e características clinicopathogical tradicionais em CaP. Os presentes dados mostraram que LAPTM4B-35 superexpressão foi associada a menor sobrevida, analisando a sobrevivência sobrevivência global e BCR-free. expressão alta LAPTM4B-35 foi significativamente correlacionada com maior palco APC, vesícula seminal invasão, metástases em linfonodos, maior PSA pré-operatório, maior pontuação de Gleason, e BCR, mas não com a idade, status da margem cirúrgica e invasão angiolinfática. Além disso, nossos dados também demonstraram que os pacientes com expressão alta LAPTM4B-35 teve sobrevida global e BCR-livre sobrevivência significativamente pobres, utilizando o método de Kaplan-Meier e teste log-rank. A análise multivariada demonstrou que LAPTM4B-35 expressão era um fator prognóstico independente tanto para a sobrevivência e BCR-livre sobrevida global em pacientes com PCA. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a demonstrar em detalhe uma associação de parâmetros clínico-patológicas e significado prognóstico da LAPTM4B-35 superexpressão em CaP. Estes resultados sugerem que a expressão elevada LAPTM4B-35 desempenha um papel fundamental na progressão da APC e está significativamente associado com um prognóstico pobre independentemente de outros factores. Isso levanta a possibilidade de que LAPTM4B-35 pode ser um parâmetro prognóstico para CaP que é tão ou mais confiável do que os fatores clínico-patológicas atualmente em uso e sugere a possibilidade de usar LAPTM4B-35 na individualização de ambos prognóstico do paciente e terapia. Os nossos resultados são consistentes com os relatórios anteriores dos papéis de LAPTM4B-35 na progressão tumoral, incluindo o carcinoma da vesícula biliar, carcinoma do ovário, carcinoma hepatocelular, câncer de mama e cholangiocarcinoma extra-hepática, e apoiar uma relação entre alta expressão de LAPTM4B-35 proteína e desfavorável comportamento biológico em CaP.

no entanto, se LAPTM4B-35 é eficaz para a aplicação clínica como substitutos para, ou em adição a, os parâmetros prognósticos atualmente em uso ainda não está claro, e uma investigação mais aprofundada é chamado para identificar se detecção combinada de LAPTM4B-35, juntamente com algumas dessas outras moléculas seria muito valiosa para melhorar a eficácia do prognóstico. A estreita relação entre LAPTM4B-35 sobre-expressão e as características clinicopatológicas previu que LAPTM4B-35 pode desempenhar um papel importante na carcinogênese e progressão tumoral. Actualmente, tem havido algumas pistas que são capazes de ajudar a explicar os seus mecanismos. De acordo com os dados publicados por alguns autores, a sobre-expressão de LAPTM4B-35 resulta na activação de alguns proto-oncogenes, tais como c-myc, c-jun e c-fos, e transformação maligna em algumas linhas de células [22], [23] . Assim, o gene LAPTM4B pode servir como um proto-oncogene por meio de seu produto de tradução, LAPTM4B-35. Estes dados fornecem evidências importantes para explicar o mecanismo pelo qual LAPTM4B expressão contribui para carcinogênese e progressão do tumor, embora o papel da LAPTM4B nas vias de transdução de sinal em células tumorais é certamente vale mais pesquisas.

Além disso, o papel significativo do LAPTM4B no câncer sugere a possibilidade de torná-lo um alvo potencial para terapias anticâncer. Foi revelado que a transfecção do gene LAPTM4B promoveu o crescimento independente de ancoragem e a formação de colónias de células HLE, enquanto que os oligonucleótidos anti-sentido contra LAPTM4B inibiu a proliferação de BEL-7402, uma linha celular de carcinoma hepatocelular na qual foi encontrada expressão LAPTM4B. Além disso, uma elevada homologia com LAPTM4A indicou que LAPTM4B pode ter uma função semelhante na resistência a múltiplas drogas [24], [25]. Além disso, o papel importante da LAPTM4B no câncer sugere a possibilidade de torná-lo um alvo potencial para terapias anticâncer. Alguns estudos anteriores indicaram que LAPTM4B pode ser um novo alvo de terapia. Todos estes resultados indicam a possibilidade de fazer LAPTM4B como um alvo potencial para a terapia do CaP. Definitivamente, são necessários mais fortes suportes de investigações básicas.

Nosso estudo tem algumas limitações. O tamanho da amostra não é grande o suficiente. Para resolver este problema, um estudo randomizado investigar a associação entre LAPTM4B-35 de expressão e do prognóstico devem ser realizados para confirmar se LAPTM4B-35 pode ser utilizado como um novo preditor de CaP prognóstico. Em resumo, este é o primeiro estudo a mostrar uma associação entre LAPTM4B-35 superexpressão e PCA. Nós demonstramos que LAPTM4B-35 é abundante em uma grande proporção de pacientes com CaP e alta LAPTM4B-35 expressão correlacionada com a progressão da APC e mau prognóstico em CaP. Além disso, LAPTM4B-35 pode ser um alvo atraente para a terapia de CaP. No entanto, estes resultados ainda precisam ser confirmados por estudos futuros.

Informações de Suporte

Figura S1.

fotografia Representante mostrando alta LAPTM4B-35 expressão em CaP por imuno-histoquímica. ampliação original, × 200

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091069.s001

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Figura S2.

fotografia Representante mostrando baixo LAPTM4B-35 expressão em CaP por imuno-histoquímica. ampliação original, × 200

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091069.s002

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Figura S3.

fotografia Representante mostrando baixa expressão LAPTM4B-35 em BPH por imuno-histoquímica. ampliação original, × 200

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091069.s003

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Figura S4.

fotografia Representante mostrando nenhuma expressão LAPTM4B-35 em CaP por imuno-histoquímica (controle negativo). ampliação original, × 200

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091069.s004

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Figura S5.

Associações entre LAPTM4B-35 expressão e tempo de BCR-livre após a prostatectomia radical em pacientes APC. Pacientes com alta LAPTM4B-35 expressão mostraram significativamente menor sobrevida BCR-livre do que aqueles com baixa LAPTM4B-35 expressão (P 0,001, teste log-rank)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091069.s005

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