Abstract

DRAM é uma proteína de membrana lisossomal e é fundamental para a autofagia mediada por p53 e apoptose. DRAM tem uma função potencial de um tumor-supressor e é regulada negativamente em muitos cancros humanos. No entanto, a regulação da expressão DRAM é pouco descrito até agora. Aqui, demonstramos que a privação de soro induz fortemente a expressão de DRAM em células de cancro do fígado e uma sequência de ADN do núcleo do promotor de DRAM é essencial para a sua capacidade de resposta à privação de soro. Observou-se ainda que os marcadores eucromatina para transcrições activo representado pela diacetil-H3, tetra-acetil-H4 e o trimetil-H3K4 na região do promotor do núcleo do gene DRAM são aparentemente aumentada de uma maneira dependente do tempo após privação de soro, e, concomitantemente, o dimetil -H3K9, um marcador associado com herterochromatin genes silenciados, era dependente do tempo diminuiu. Além disso, o factor de remodelação da cromatina Brg-1 é enriquecido na região do promotor do núcleo do gene DRAM e é necessária para a privação de soro expressão induzida DRAM. Estas observações preparar o terreno para uma investigação mais aprofundada da expressão do gene DRAM

Citation:. Ni P, Xu H, Chen C, Wang J, Liu X, Hu Y, et al. (2012) Expressão Sérum fome Induz DRAM no fígado células cancerosas através de histona Modificações dentro de seu promotor Locus. PLoS ONE 7 (12): e50502. doi: 10.1371 /journal.pone.0050502

editor: Austin John Cooney, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 27 Março, 2012; Aceito: 24 de outubro de 2012; Publicação: 12 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Ni et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pelo Comité de Ciência e Tecnologia de Xangai Metropolitan (11ZR1423100); a National Science Foundation da China (Grant No .: 30772233, 30873057 a Y. Lu, e 81.172.028 a Z. Hou); Key Projeto Básico de Xangai Municipal de Ciência e Tecnologia da Comissão (No .: 08JC1413600); Comitê de Xangai da Ciência e Tecnologia (11DZ2260200); e Fundação Joint 985 Tumor. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Inactivação de percursos de morte celular é um componente central da progressão do cancro [1]. Existem vários mecanismos em células humanas normais para invocar a morte celular e erradicar as células danificadas que podem crescer para formar tumores aberrante [2] – [4]. Em condições macroautofagia normal (doravante referida como “autofagia”) é um processo de membrana de tráfico fortemente regulada para degradar e reciclagem de proteínas citosólicas e organelas em níveis basais. Pode ser induzida acima do nível basal em resposta a diversos estímulos incluindo inanição de nutrientes, infecção, agentes genotóxicos, ou citocinas [5] – [8]. Autophagy pode funcionar em diferentes contextos para promover ou inibir a sobrevivência de células [1], [5], [7], [9] – [11], sugerindo que pode desempenhar um papel patológico importante na carcinogénese

Humano

DRAM

gene (regulada por danos autofagia modulador) foi identificado como um gene activado por p53 que codifica uma proteína de membrana lisossomal altamente conservado e é constituída por 238 aminoácidos de comprimento [12]. DRAM é não só importante para a capacidade de p53 sobre-expresso ou ADN de p53 activada por danos para modular autofagia [13], mas também para a capacidade da p53 para induzir apoptose [9]. A DRAM é especificamente localizada em lisossomos, uma organela participar na última etapa da autofagia [12]. Por isso, é plausível que DRAM pode regular a fusão autophagosome-lisossoma, um processo requerido para a geração de autophagolysosomes.

Tem sido demonstrado que a DRAM tem uma função potencial de um tumor-supressor e é regulada negativamente em muitos cancros humanos [ ,,,0],12]. A regulação negativa do ARNm de DRAM nestas células cancerosas ocorre tanto por hipermetilação directo no interior da ilha de CpG da região promotora deste gene e por outro lado, ainda não identificados, tais como mecanismos de modificações epigenética de histonas nucleares próximos do gene DRAM [12]. Neste relatório, nós caracterizamos o promotor do gene DRAM humano e identificou o DNA sequências essencial para a sua regulamentação.

Resultados

inanição Serum estimula a expressão DRAM em células de câncer de fígado

Privação de soro induz a apoptose e autofagia em muitos tipos de células incluindo as células HepG2 e HepB3. Estas observações levaram-nos a examinar se privação de soro poderia induzir a expressão DRAM em células de câncer de fígado. As células HepG2 e Hep3B foram cultivadas até 70% de confluência em DMEM contendo 10% de FBS. Estas células foram lavadas três vezes com PBS e foram alimentadas com meio omitindo FBS durante vários períodos de tempo. As células resultantes foram colhidas e os ARNs totais foram extraídos. A expressão de ARNm de DRAM foi examinado por RT-PCR quantitativo (qRT-PCR). Em ambas as células HepG2 e Hep3B do ARNm de DRAM foi induzida significativamente 24 h privação pós-soro, e atingiu o nível mais elevado às 48 h (Figura 1A, B) de um modo semelhante, sugerindo que a privação de soro induz a expressão de DRAM em células de cancro do fígado . O nível de proteínas em células HepG2 DRAM em vários pontos de tempo foi analisada por ensaios de transferência de Western. Consistente com a expressão de ARNm de DRAM observadas por qRT-PCR, DRAM proteína foi fracamente detectada às 3 horas após a privação de soro e atingiu nível elevado às 24 e 48 horas de privação de soro (Figura 1C).

(A) nível de ARNm do gene DRAM após privação de soro a diferentes pontos de tempo foram quantificados por em tempo real de RT-PCR em células HepG2. (B) Expressão em células Hep3B DRAM é semelhante à observada em células HepG2. (C) Análise da expressão de proteína em células HepG2 DRAM. CD166 serviu como um controlo positivo para a expressão da proteína privação de soro induzido. As células foram cultivadas até 70% de confluência em DMEM contendo 10% de FBS. Estas células foram lavadas com PBS e alimentadas com meio DMEM FBS a omissão de vários pontos de tempo. As células resultantes foram colhidas e os ARNs totais e os lisados ​​celulares totais foram extraídas e a expressão de ARNm e proteína de DRAM foi examinada por qRT-PCR ou Western blot. GAPDH foram utilizados como um controlo interno. (D) Inibição da síntese de proteínas não afecta a expressão de DRAM induzida por privação de soro de células HepG2. As células foram tratadas com CHX (10 mM) sob privação de soro durante 24 horas, e o ARN total foi extraído para análise da expressão de DRAM por PCR em tempo real. Todos os resultados são apresentados como médias ± D.P.. de três experiências independentes. **,

p

. 0,01 nível usando o teste t

Para determinar se a nova síntese protéica era necessário para a privação de soro para induzir a expressão DRAM, Cycloheximide (CHX) foi aplicado aos meios isentos de soro durante 30 minutos para inibir a síntese de novas proteínas. O pré-tratamento das células com HepG2 CHX não inibiu a privação de soro induzida expressão DRAM (Figura 1D), o que sugere que a sobre-regulação da expressão de DRAM é independente da síntese de proteínas em células HepG2.

A região proximal do promotor DRAM é sensível à digestão por nuclease

para identificar os elementos reguladores que resposta à privação de soro no promotor DRAM, primeiro estabelecidos para determinar o local de início da transcrição (TSS) do gene DRAM, empregando 5 ‘ensaios RACE . A sequenciação do ADN confirmou que três produtos de PCR designado como um produto (~216 pb), o produto 2 (~172 pb), e o produto 3 (~106 pb) foram amplificações directos a partir do 5 ‘UTR do gene DRAM (Figura 2A). A banda mais baixa (~47 pb) no gel era de amplificação não específica dos próprios iniciadores. Os primeiros nucleótidos para o produto 1, 2, e 3 foram identificados como A, T e A, respectivamente (Figura 2B). Produto 1 e 2 do produto foram de 65 pb e 20 pb a montante, enquanto o produto 3 foi de 107 pb a jusante do primeiro nucleótido da sequência de cDNA DRAM encontrado no banco de genes do National Center for Biotechnology Information (Gene ID: 728655). Para uma descrição conveniente seguir, nós arbitrariamente refere o nucleótido A no produto 1 como o TSS (+1).

(A) em gel de agarose mostrou vários produtos 5 ‘RACE PCR. (B) O mapeamento do potencial TSS do

DRAM gene

. A seta indicada se a nested iniciador reverso 5 ‘RACE. O GeneRacer PCR, baseado em ARN e o oligo-capping amplificação rápida de ADNc, foi realizada de acordo com as instruções do fabricante mediada por ligase. Os produtos de PCR foram resolvidos em gel de agarose, e bandas de potenciais foram recolhidas e confirmado por sequenciação de ADN. * Indica uma amplificação não específica dos dimmers de primers.

Para fornecer mais pistas em busca dos elementos reguladores do promotor DRAM, foram realizados ensaios CARTA-PCR para avaliar a acessibilidade do promotor DRAM ADN a digestão por nuclease. Núcleos isolado a partir de células HepG2 e células Hep3B foram submetidos a digestão com DNase I ou MNase e os fragmentos de DNA genómico resultantes entre -7216 e + 289 pb (em relação à localização do TSS) foram analisadas utilizando ensaios de PCR quantitativa (Figura 3A). Os dados foram apresentados como o percentil entre o ADN intacto a partir das amostras tratadas com a nuclease e não tratados, e foram inversamente reflectida a proporção de o DNA protegido. Os fragmentos de DNA abrangendo o promotor proximal (R5, R6 e R7) foram mais sensíveis à DNase I e digestão MNase, particularmente com R6 (a partir de -144 a 72) que apresenta o menor protecção de ~ 35% em ambas as células examinados, enquanto que uma maior foram observados níveis de protecção contra a DNase I ou digestão MNase na região R1 e R2, indicando que a ADNase I e a acessibilidade MNase estão limitados a região promotora proximal, especialmente para a região de R6 (Figura 3B).

(a) representação esquemática dos conjuntos de iniciadores utilizados para o DIAGRAMA-PCR. região (B) R6 do promotor de DRAM é mais sensível a ADNase I e a digestão MNase. O ADN genómico foi isolado a partir de células Hep3B e HepG2 e analisados ​​por PCR quantitativa. Os dados foram apresentados como percentagem de ADN digerido ADNs digeridos. (C) de soro de privação aumenta a acessibilidade das regiões R5, R6 e R7 a digestão por nuclease em células Hep3B e HepG2.

Para examinar o efeito da privação de soro sobre a acessibilidade do ADN do promotor de DRAM à DNase I e digestão MNase, núcleos isolados a partir de células HepG2 e Hep3B cultivadas em meio livre de soro durante 48 horas foram sujeitas a digestão por nuclease e análise gráfica-PCR. A acessibilidade de todas as regiões R5, R6 e R7 a digestão por nuclease foi significativamente aumentada em ambas as células após privação de soro com a região de R6 exibindo o menor nível de protecção (Figura 3C). Em conjunto, esses dados implicam que a região proximal do promotor DRAM contém cis-regulatórias putativos elementos responsivos a privação de soro.

privação de soro induz mudanças na modificação da histona na loci promotor DRAM

Para mais fortalecer a observação de que a região proximal do promotor DRAM contém cis-reguladoras putativas elementos a privação de soro, examinou-se o estado das histonas modificação neste local utilizando os ensaios de chip. acetilações histonas, tais como lisina acetilação em H3 e H4 são geralmente conhecidos por estarem associados com genes transcritos activamente e estrutura aberta da cromatina [14] – [16]. Os anticorpos específicos para H3 diacetilado (K9 e K14) e H4 (K5, K8, K12 e K16) acetilada-tetra foram usadas para realizar a análise de chip para determinar o padrão de modificações de histonas no promotor locus de DRAM com ou sem soro. Em células Hep3B tanto H3 e H4 foram acetilados na região R1, R6 e R7, com o locus R6 mostrando o mais alto nível de acetilação. A acetilação da histona foi aparentemente aumentada de uma maneira dependente do tempo após a privação de soro para as regiões R6 e R7, mas não a região de ensaios R1 (Figura 4A, B)

Hep3B foram preparadas células de IP da cromatina (ChIP) . Os ADNs de cromatina foram imunoprecipitadas com anticorpos específicos para H3K4me3 (A), anti-di-acetil-H3 (B), anti-H3K9me2 (C) e anti-tetra-acetil-H4 (D), e os fragmentos de ADN enriquecidos que flanqueia o promotor DRAM foram analisadas por PCR quantitativa. Os dados foram apresentados como a quantidade de ADN recuperado por meio de anticorpos específicos em relação ao ADN enriquecido com os controlos IgG adequadas. Os resultados foram expressos como a média ± desvio padrão de três experiências independentes. *: P 0,05

Em seguida, examinou-se o estado de metilação da histona no locus do promotor DRAM.. O trimetil-H3K4, um marcador euchromatic [17] – [18], exibiu um padrão semelhante com diacetil-H3 e tetra-acetil-H4 em células Hep3B (Figura 4C), enquanto a dimetil-H3K9 foi pontuada mais baixa na região R6 nas nível basal e diminuiu juntamente com privação de soro prolongada (Figura 4D). O dimetil-H3K9 serve como um sinal para o silenciamento da cromatina, recrutando as proteínas HP1 (proteína heterocromatina 1) e é mutuamente exclusiva com H3-K9 acetilação [19]. Tomados em conjunto, estas observações indicam que a activação da transcrição do gene de DRAM é correlacionado com o aumento marcadores eucromáticos locais e concomitantemente diminuiu marcadores de heterocromatina.

NF-kB não é responsável pela activação do promotor DRAM

Para identificar os elementos reguladores mínimas a privação de soro no promotor de DRAM, vários fragmentos do promotor proximal DRAM foram inseridos a montante do vector repórter de luciferase de pirilampo. As actividades de transcrição destas construções foram testadas em células Hep3B e HepG2. O repórter contendo o fragmento -1741 /+ 299 apenas fracamente respondeu ao soro privação, enquanto os repórteres contendo -863, -75, 19 /+ 299 fragmentos exibidos atividades significativas alta luciferase em responsivo a privação de soro. Surpreendentemente, o repórter contendo o fragmento de + 28 /+ 299 não mostram nenhuma actividade de privação do soro (Figura 5A). Estes dados indicam que os elementos reguladores cis a privação de soro no promotor de DRAM é residido a região flanqueadora -19 /+ 28 nucleótidos (Figura 5B). O repórter promotor contendo o fragmento de ADN mais curto abrangendo -19 /+ 28 região foi nomeado como Luc-DCP a seguir.

(A) células Hep3B e HepG2 foram transitoriamente transfectadas com plasmídeos repórter contendo versões truncadas da região do promotor de

DRAM

gene como indicado. Luc-DCP é definido como o repórter contendo a região de promotor mais curto (-19~ + 28). (B) A região promotora nuclear contém um sítio de ligação de NF-kB putativo. factor de transcrição locais apresentados na região promotora do núcleo (-19~ + 28) de ligação foram predicado pela TFSEARCH software de web e MatInspector e a mutação ou deleção plasmídeos foram gerados utilizando o método de mutagénese dirigida ao local. (C) A mutação ou deleção do local de ligação do NF-kB não afecta a actividade do promotor do núcleo.

Em um esforço de pesquisa para o factor de transcrição potenciais locais de ligação em -19 /+ 28 região, nós próxima realizados análise bioinformática abrangente e encontrou um site de NF-kB de ligação canônica residiu nessa região. Para confirmar se esse local de NF-kB de ligação putativo é funcional, fizemos deleção e mutação neste sítio (Figura 5B). Surpreendentemente, a deleção ou mutação deste local de NF-kB de ligação não teve nenhum efeito aparente sobre a actividade do promotor em responsivo a privação de soro (Figura 5C). Estes dados sugerem que outros fatores, não NF-kB é necessária para a indução DRAM por privação de soro.

Os principais componentes do complexo mecanismo de transcrição são obrigados a região proximal do promotor DRAM

Brg I e RNA polimerase II são os principais componentes da ARN-polimerase II Holoenzimas que participam na transcrição de genes [20]. A cromatina de células Hep3B e HepG2 foram colhidas e precipitados com anti-Brg I e anticorpos anti-Pol II. Os ADNs precipitados foram avaliadas por PCR em tempo real. Brg I ligado a mais ao ADN na região do R 6 em ambas as células, enquanto Pol II ligado às regiões R6 e R7, com afinidade mais elevada do que na região R4 (Figura 6A). Surpreendentemente, privação de soro resultou numa ligação acrescida da Brg I e pol II ao ADN na região de R6 e estes aumentos foram observadas tão cedo quanto 5 min após a privação de soro e alcançou o mais alto nível em 30 minutos em ambas as células, respectivamente (Figura 6B).

(a) Brg-1 está ligada à região proximal do promotor da DRAM. ChIP ensaios foram realizados em células Hep3B e HepG2. (B) privação de soro aumenta Brg-1 e de pol II de ligação ao local promotor DRAM. (C) A exaustão das Brg-1 utilizando segmentação shRNA abole a privação de soro expressão DRAM específica induzida.

Brg-1 é necessária para a indução privação de soro de expressão DRAM

Para examinar o papel de Brg I na indução da expressão de DRAM, células HepG2 foram transfectadas com oligos siRNA especificamente contra Brm ou Brg I durante 24 h seguida por ensaios de RT-PCR (Figura 6c, painel esquerdo). A indução da expressão de DRAM por privação de soro foi abolida pela depleção de Brg I. No entanto, knockdown de Brm não afectou a expressão de DRAM (Figura 6C). Estes resultados demonstram que Brg-I é essencial para a indução de DRAM no responsivo a privação de soro.

Discussão

DRAM tem uma função potencial de um tumor-supressor e é crítica para o p53 para modular a apoptose e autofagia [ ,,,0],12]. Portanto, a descoberta de factores de regulação que governam a expressão DRAM irá fornecer alvos para novos agentes terapêuticos. No entanto, a regulação da expressão DRAM é pouco descrito até agora. Aqui, nós demonstramos pela primeira vez que a privação de soro induzida fortemente expressão DRAM em câncer de fígado células HepG2 e Hep3B e identificou uma sequência de DNA do núcleo no promotor DRAM, que é essencial para a sua capacidade de resposta à privação de soro.

Anteriormente DRAM foi identificado como um gene de p53 induzida e um elemento de resposta p53 funcional encontra-se em 2,3 kb a montante do promotor DRAM [21]. Aqui, demonstramos que a privação de soro induz a expressão de DRAM em HepG2, uma célula positiva de p53, e Hep3B, a p53 em células negativas de modo semelhante, sugerindo que o p53 não pode ser um factor-chave envolvidos neste indução [22]. No entanto, é um grande interesse para ver se há qualquer tipo de cooperação entre a privação de soro p53and na regulação da expressão DRAM.

Nossos dados mostraram que quanto mais tempo fragmento (-1.714) fracamente respondeu ao soro fome. Postulamos que, a longo fragmento existem elementos cis repressivas que poderia diminuir a atividade basal do promotor de DRAM. A versão curta do promotor não contém tais elementos, e exibir alta atividade transcricional

A acetilação e metilação em resíduos de lisina das caudas das histonas núcleo são essenciais para a transcrição de genes [23] – [24].. Acetilações de lisinas em H3 e H4 são geralmente conhecidos por estarem associados com genes transcritos activamente e estrutura aberta da cromatina [15] – [16], [25]. Consistentemente, foi observado que em células Hep3B e HepG2 acetilação lisina em H3 e H4 foi aparentemente aumentada de uma maneira dependente do tempo após privação de soro na região promotora do gene do núcleo DRAM. O trimetil-H3K4, um marcador euchromatic para a transcrição ativa, exibido um padrão semelhante com diacetil-H3 e Tetra-acetil-H4 na célula Hep3B. Em contraste, o dimetil-H3K9 foi pontuada mais baixa na região R6 a nível basal e foi dependente do tempo diminuiu após a privação de soro. O dimetil-H3K9 serve como um sinal para o silenciamento da cromatina, recrutando as proteínas HP1 e é mutuamente exclusiva com H3-K9 acetilação. Estes dados sugerem que a privação de soro pode induzir a montagem cooperativa de histona acetiltransferase, desacetilases e metiltransferases, complexo de transcrição para a cromatina alvo para modificar códigos de histonas. No entanto, não são claros quais modificadores histonas são recrutados para esse locus. Curiosamente, observou-se que as mudanças na repressivo para marcas de histona activas ocorrem em primeiros 15 minutos, e não alteram significativamente em todos os até 24 horas, enquanto que o ARNm de DRAM foram gradualmente aumentou e atingiu nível elevado até às 24 horas e 48 horas. Este atraso resulta da expressão de ARNm de DRAM pode ser devido ao tempo para a montagem do mecanismo de transcrição para conduzir eficazmente a expressão do gene de DRAM. No entanto, o mecanismo exacto precisa de ser elucidados. Actualmente, estamos a tentar identificar os complexos de proteínas potenciais que poderiam se ligam a esta sequência de DNA do núcleo usando suspenso DNA e Espectrometria de Massa abordagens e identificou várias proteínas, incluindo p300 que pode potencialmente ligar ao promotor núcleo da DRAM. Seus papéis na regulação da expressão DRAM estão agora a ser exaustivamente interrogados.

O supressor de tumor Brg-1 é um componente central do SWI /SNF chromatin- remodelação complexo [26]. Este complexo pode activar a transcrição de genes pela remodelação da estrutura da cromatina sobre interações DNA-histona perturbadores nos nucleossomos. Nós demonstramos que Brg-1 é enriquecido na região do promotor do núcleo do gene DRAM e é necessária para a privação de soro expressão induzida DRAM.

A proteína Brm (Brahma) pode substituir Brg-1 e cumprir a helicase /ATPase função do complexo in vitro. No entanto, Brg-1 e Brm não são funcionalmente intercambiáveis ​​in vivo. Homozigotos

Brg1

knockout embriões morrer antes de implantação e camundongos heterozigotos são propensos a tumores epiteliais em desenvolvimento [26] – [27], enquanto que

Brm

nocautes são viáveis ​​e não desenvolvem tumores [28] – [29]. Consistentemente, depleção de Brg-1 em células HepG2 abolida privação de soro induzida por expressão de DRAM, enquanto a depleção de Brm não afectou a expressão de DRAM. BRG-1 foi mostrado para desempenhar um papel-chave na regulação da apoptose celular e autofagia, mas os mecanismos subalterno são obscuras. Identificação de DRAM é um alvo direto de Brg-1 vai lançar uma nova luz sobre a regulação molecular de autofagia.

Materiais e Métodos

cultura de células, transfecções e plasmídeos

HepG2 e células Hep3B (ATCC) foram mantidas em DMEM contendo 10% de FBS (Gibco), 2 mM de L-glutamina, e penicilina (50 U /mL) /estreptomicina (50 ug /ml) a 37 ° C sob 5% de CO

2 numa câmara humidificada.

as células de transfecção foi realizada utilizando o Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os oligos siRNA visando especificamente BrgI (CGCGCUACAACCAGAUGAATT), Brm (GGAUUGUAGAAGACAUCCATT) ou controle negativo (corrida RNA, UUCUCCGAACGUGUCACGUTT) foram adquiridos (GenePharma Co., Ltd, Shanghai, China).

A transcrição reversa PCR (RT-PCR )

o RNA total foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen). A mistura de reacção (20 ul) contendo 1 ug de ARN total foi transcrito de modo reverso em ADNc na utilização de PrimeScript RT-polimerase (Takara). Os ADNc resultantes foram analisados ​​por meio de PCR quantitativo (Mx3000P sistema real ime-PCR, Stratagene, La Jolla, CA, EUA) com pares de iniciadores específicos para o DRAM e GAPDH. Os dados foram apresentados como percentagens dos níveis de ARNm total de DRAM contra β-actina.

5′-RLM-RACE

O sistema GeneRacer (Invitrogen), com base em ARN mediada pela ligase e o oligo -capping amplificação rápida de ADNc, foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. O kit assegura a amplificação de apenas transcritos de comprimento completo, eliminando mensagens truncadas a partir do processo de amplificação. iniciadores específicos para o DRAM (F, TGCGAAACGAGTGAAGTCACAAAGC; R, GCGAGCTCCAAGCGGACGCGACTAC) foram usadas para a amplificação por PCR utilizando o sistema de LaTaq GC-rich PCR (Takara, Inc., Dalian, China)

análise da acessibilidade da cromatina

.

acessibilidade de ADN para a digestão com DNase I e de MNase (Takara, Inc., Dalian, China) foram analisados ​​utilizando a acessibilidade da cromatina através ESQUEMA-PCR como descrito previamente [30] – [31]. Os ensaios foram repetidos por três vezes, independentemente. pares de primers para regiões diferentes como se segue: R1 (F: TCCAACCCTCATGGATGGCTTTTAG; R: ATTCAGTCACATCTTCAGGCTCTAC); R2 (F: ATGAATCAGTAGTAGGGCACGAAAG; R: CAGCCTGGTCAACAGATAGAG); R3 (F: TTGCGGGTCTCACTATATTGTCCAG, R: GGGCAGACTAGTATTTCAAGAGATC); R4 (F: TCCAGAACACAAATCCCTTTCACAG, R: GAGCCTTTATCACACCACTTCACTC); R5 (F: CGCTCTCCTGGAAAGCAGCACAATG, R: AGTGTTCAATGAGGTTCGCCAGGTC); R6 (F: ACCTCATTGAACACTTCTGCCCGAC; R: GCTCTTGCGCAACTCTGGAGAAAAG); R7 (F: CGAGTGTCCAAACCAAAAGCGAAAG; R: TGCGAAACGAGTGAAGTCACAAAG).

cromatina imunoprecipitação (CHIP)

ensaios ChIP foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante (Ativo Motif, Carlsbad, CA, EUA). Os complexos de DNA-proteína foram imunoprecipitadas com 4 ug anticorpos RNA polimerase II (SC-9001, Santa Cruz Biotechnology), e Brg1 (SC-10768); dimetil-H3-K9 (ab1220, Abcam), tetra-acetil-H4 (06-866, Upstate) e diacetil-H3 (07-593, Upstate); e trimetil-H3-K4 (9751, Cell Signaling Technology). As reacções de PCR em tempo real foram efectuadas em triplicado, com 1 ul de ADN precipitado. ADN recuperado a partir de amostras que contenham um anticorpo foi comparado com os controlos IgG realizados em ali quotas a partir da mesma preparação da cromatina. Os dados foram apresentados como a quantidade de ADN recuperado em relação ao controlo de IgG adequada fornecida pelos fabricantes. Os resultados foram expressos como a média ± desvio padrão de três experiências independentes.

Construção de plasmídeos repórter o dram de promotor-luciferase e o ensaio de luciferase

Os ensaios de PCR foram realizados utilizando conjuntos de iniciadores específicos para o

DRAM

promotor (F-1714): AGGAACGCGTACTCCACGGCCACAGTGATCTCTTG; F (-863): TGGAACGCGTGGCCACATATGTTGGGCTCAGACTC; F (-75): TGACACGCGTGGTGGCCACTCTCACTGCTGCGAAG; F (-19): TGACACGCGTTCGGGGTGCGAGGCCCGGCACTC; F (+28): TGACACGCGTGTTGGGAGAAATAAATCCTTTTCTC; R (299): CGTACTCGAGCGGGCTTGTTGCGAAACGAGTGAAG). Estes produtos de PCR foram clonados nos locais de Mlu I /Xho I do vector pGL3-Basic (Promega, Madison, WI, EUA). mutações promotor e deleções foram gerados por um kit de mutagénese dirigida ao local baseada em PCR (Takara), utilizando o plasmídeo correspondente como os modelos. Para a substituição de nucleótidos e eliminação do promotor mínimo, um oito sequência de ADN de nucleótidos GCGCGCGC foi usado para substituir o ADN do tipo selvagem no promotor mínimo, ou o núcleo local de ligação de NF-kB foi suprimido utilizando o método de mutagénese dirigida ao local. plasmídeos repórter do promotor, foram transientemente transfectados para células utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen). pTRL-TK plasmídeo (Promega) foi co-transfectado como um controlo interno para avaliação da eficiência de transfecção. Vinte e quatro horas após transfecção, as células resultantes foram colhidos e preparados para análise de actividade de luciferase. As actividades de luciferase foram medidos usando a luciferase dual-sistema de ensaio Repórter (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante com o luminômetro (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA, EUA).

Análise Western Blot

As células foram colhidas e lisadas em tampão RIPA (Beyotime Inc.). Os lisados ​​celulares foram clarificados por centrifugação a 15.000 g durante 10 min. 20 ug de proteínas totais foi resolvido em 8% de gel SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas electroforeticamente para uma membrana Immobilon P (Millipore). As transferências de Western foram descritos anteriormente [32]. Os anticorpos DRAM (AP1825a, Abgent) e β-actina (SC-130656, Santa Cruz Biotechnology) foram adquiridos.

A análise estatística

análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste t. P-valores .. 0,05 foram considerados estatisticamente significativa

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Kevin M. Ryan para compartilhar o plasmídeo DRAM