Abstract

ABCG2 Humano, um membro do ATP de ligação superfamília de cassete transportador, desempenha um papel-chave na resistência a múltiplas drogas e protegendo as células-tronco do câncer . ABCG2-knockout não teve nenhum efeito adverso aparente sobre o desenvolvimento, bioquímica e de vida de camundongos. Assim, ABCG2 é um alvo interessante e promissor para o desenvolvimento de agentes sensibilizadores de quimioterapia para um melhor tratamento de cânceres resistentes aos medicamentos e para eliminar as células-tronco do câncer. Anteriormente, relatou um novo inibidor de duas agindo modo ABCG2, PZ-39, que induz a degradação ABCG2 além de inibir a sua actividade. Neste artigo, apresentamos os nossos recentes avanços na identificação de dois grupos diferentes de inibidores ABCG2 com uma inibição única função ABCG2 (estático) e a outra induz a degradação ABCG2 no lisossoma além de inibir a sua função (dinâmico). Assim, a degradação ABCG2 induzida por um inibidor pode ser mais comum do que anteriormente previsto e uma investigação mais aprofundada dos inibidores dinâmicas que induzem a degradação ABCG2 pode fornecer uma maneira mais eficaz de sensibilizar MDR mediada por ABCG2 na quimioterapia do cancro.

Citation : Peng H, Qi J, Dong Z, Zhang JT (2010) dinâmico

vs

estático ABCG2 Inibidores de sensibilizar drogas células cancerosas resistentes. PLoS ONE 5 (12): e15276. doi: 10.1371 /journal.pone.0015276

editor: Wenqing Xu, da Universidade de Washington, Estados Unidos da América

Recebido: 21 Setembro, 2010; Aceito: 03 de novembro de 2010; Publicação: 07 de dezembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Peng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Institutes of Health concede CA113384 e CA120221 (JTZ) e por uma concessão Showalter Foundation (ZD). Jing Qi é um destinatário do Departamento de Defesa Breast Cancer Research Programa de pós-doutorado. Hui Peng é actualmente suportada, em parte, por NNSF da China concessão No. 30873083. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Conflito de interesses os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

ABCG2 é membro da cassete de ligação a ATP (ABC) transporter superfamília e sobre-expressão de ABCG2 demonstrou causa. multirresistência (MDR) em linhas celulares de cancro modelo e correlacionar-se com mau prognóstico, tanto em pacientes oncológicos adultos e leucemia infantil e da mama (para revisões ver [1], [2], [3]). Ao contrário da maioria dos outros membros do transportador superfamilia ABC como a P-glicoproteína (MDR1 /ABCB1), ABCG2 é considerada como meio transportador que consiste de um domínio de ligação ao nucleótido (NBD) no terminal amino e um domínio que atravessa a membrana (MSD) a terminal carboxilo. Tem, por isso, foi pensado para existir e funcionar como um homo-dímero. No entanto, a evidência recente mostrou que ABCG2 podem existir e como função de uma ordem mais elevada de oligómero que consiste em subunidades idênticas 8-12 [4], [5] e os sítios de oligomerização são provavelmente situados na MSD [6].

no processo de apontar para sensibilizar MDR mediada por ABCG2, uma série de inibidores de ABCG2 foram recentemente descobertos [7], [8], [9], [10], [11], [12] para além do anteriormente aqueles identificados como Fumitremorgin C (FTC) (para uma revisão ver [2]). Um desses inibidores ABCG2, PZ-39, era muito eficaz e distinto de outros, tais como FTC, com a capacidade de causar degradação dependente de lisossoma de proteína ABCG2 [7].

Para determinar adicionalmente se o inibidor-induzida ABCG2 a degradação é exclusivo para PZ-39, testamos outros inibidores ABCG2 gerados durante a triagem inicial que levou à identificação de PZ-39. Encontrámos dois tipos de inibidores ABCG2 com uma inibição da actividade ABCG2 única (estático) e a outra actividade ABCG2 inibindo assim como induzindo degradação ABCG2 através lisossoma (dinâmico). Estes achados sugerem que inibidor-induzida degradação ABCG2 no lisossoma pode ser mais comum do que foi anteriormente previsto e investigar mais os inibidores dinâmicas que induzem a degradação ABCG2 no lisossoma pode fornecer uma maneira mais eficaz de sensibilizar MDR na quimioterapia do cancro mediada por ABCG2.

resultados

Dois tipos de inibidores ABCG2

Anteriormente, relatou que a triagem racional de representantes de diferentes tipos de biblioteca de compostos de Specs (www.specs.net) levou a identificação de um inibidor agindo ABCG2 de dois modos PZ-39 [7]. Durante o rastreio inicial, vários outros inibidores ABCG2, que são estruturalmente diferentes dos PZ-39 e seus derivados (fig. 1), também foram identificados e a sua actividade para inibir o efluxo de fármacos mediado-ABCG2 foi confirmada utilizando células HEK293 com sobre-expressão de ABCG2 ectópica (HEK293 /ABCG2) (Fig. 2A). Para determinar se estes inibidores também possuem a propriedade de actuar de dois modos, primeiro testado o efeito destes inibidores sobre a expressão ABCG2 utilizando análise de Western blot. Como mostrado na Fig. 2B, três dos quatro novos inibidores (PZ-8, 34 e 38), juntamente com PZ-39 inibir a expressão ABCG2 enquanto PZ-16 não. Juntamente com a nossa conclusão anterior de que FTC inibe a única atividade ABCG2 [7], concluímos que há provavelmente dois tipos de inibidores ABCG2 com um inibem única atividade ABCG2 enquanto o outro inibir tanto a atividade e expressão de ABCG2.

as estruturas químicas são mostradas para PZ-8, (12E)-N’-((5-(3,4-dihydro-4-oxo-3-phenylquinazolin-2-ylthio)furan-2-yl)methylene)-2-(4-ethylphenoxy)acetohydrazide; PZ-16, 2- (4- (4-nitrofenoxi) fenil) -2-oxoethyl2- (2- (4- cloro benzamido) acetamido) etilo; PZ-34, (E) -2- (4-etoxifenil) -N ‘- (1- (4- (furano-2-carboxamido) fenil) etilideno) quinolina-4-carbo-hidrazida; PZ-38, (N-(2,5-dimethoxyphenyl)-2-({4-[4-(dimethylamino)benzylidene]-5-oxo-1-phenyl-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl}sulfanyl)acetamide); e ZP-39 (N- (4-clorofenil) -2 – [(6 – {[4,6-di (4- morfolinil) -1,3,5- triazin-2-il] amino} -1,3 benzotiazol-2-il) sulfanil] acetamida).

A, acumulação mitoxantrona. células /ABCG2 HEK293 foram incubadas com mitoxantrona durante 30 min na presença de DMSO (linha fina) ou 10 pM compostos PZ (linha grossa), seguido por análise de FACS de nível mitoxantrona. B, expressão ABCG2. células HEK293 /ABCG2 foram incubadas com compostos PZ 3,3 m ou controle de DMSO para várias vezes seguidas por recolha de células e análise de Western blot de ABCG2 sondado com anticorpo monoclonal BXP-21.

A supressão da expressão ABCG2 por os conhecidos e existentes inibidores ABCG2

os resultados acima sugerem que a supressão induzida por inibidor de expressão ABCG2 pode ser mais comum do que o previsto. Para testar essa possibilidade, nós investigamos o efeito de dois outros inibidores publicados ABCG2 (NSC-168201 e NSC-120668) [12] sobre a expressão ABCG2 usando análise de Western blot. Como mostrado na Fig. 3A, tanto NSC-168201 e NSC-120668 efetivamente suprimir a expressão ABCG2. No entanto, o inibidor de controlo ABCG2 FTC embora não todos os três inibidores de aumentar eficazmente a acumulação de mitoxantrona em /ABCG2 linhas celulares HEK293 (Fig. 3B). Assim, podemos concluir que a supressão induzida por inibidor de expressão ABCG2 pode ser mais comum do que foi antecipado e há possivelmente dois grupos de inibidores ABCG2.

A, expressão ABCG2. células HEK293 /ABCG2 foram tratados com 10 uM de cada um dos inibidores conhecidos ABCG2 NSC-168201, NSC-120668, ou FTC para várias vezes, seguido por análise por Western blot da expressão ABCG2 sondadas com anticorpo monoclonal BXP-21. B, a acumulação de mitoxantrona. células HEK293 /ABCG2 foram incubadas com mitoxantrona durante 30 min na presença de DMSO (linha fina) ou 10 pM NSC-168201, NSC-120668, ou FTC (linha grossa), seguido de análise de FACS de mitoxantrona nível intracelular.

efeito específico da PZ-34 e PZ-38 na mediada por ABCG2 mitoxantrona efluxo

para investigar mais, se estes novos inibidores de suprimir a expressão ABCG2 induzindo a degradação ABCG2 no lisossoma, optamos por focar PZ -34 e PZ-38 e primeira realizada uma análise detalhada de seus efeitos sobre a acumulação do fármaco. Como mostrado na Fig. 4A, as duas PZ-34 e ZP-38 em ~ 4 uM aumentar a acumulação de mitoxantrona a um grau similar como o inibidor ABCG2 bem estabelecida FTC em células /ABCG2 HEK293. Estes compostos, no entanto, não têm qualquer efeito significativo sobre a acumulação de mitoxantrona na células transfectadas com o vector de controlo (HEK293 /Vec), indicando que o efeito de PZ-34 e ZP-38 sobre a acumulação de mitoxantrona é provavelmente através da inibição ABCG2. Em seguida, testou a resposta à dose de PZ-34 e ZP-38 na inibição mediada por ABCG2 efluxo mitoxantrona em células /ABCG2 HEK293 utilizando citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. 4B, o nível intracelular mitoxantrona é muito menos em HEK293 /ABCG2 células em comparação com as células HEK293 /Vec devido ao efluxo mediado por ABCG2. A adição de PZ-34 e ZP-38 aumenta a acumulação intracelular de mitoxantrona de uma forma dependente da dose semelhante como FTC.

A, a acumulação de mitoxantrona. células HEK293 /Vec ou HEK293 /ABCG2 foram incubadas com mitoxantrona durante 30 minuto na presença do controlo de DMSO, ou 3 uM de PZ-34, PZ-38 ou controlo de FTC. Os dados são médias ± DP de três experiências independentes. B, a resposta dose de PZ-34, PZ-38, e o controlo da FTC na restauração da acumulação mitoxantrona em células /ABCG2 HEK293. A linha grossa mostra o nível de acumulação mitoxantrona em células HEK293 /Vec, servindo como um controle de acúmulo máximo. C, efeito sobre ABCB1 e ABCC1 mediada por efluxo de adriamicina. células HEK293 com ABCC1 sobre-expressão (HEK293 /ABCC1) e bc19 células com ABCB1 sobre-expressão foram incubadas com adriamicina na ausência (área cinzenta) ou na presença (linha a ponteado) de 3,8? M PZ-34 ou PZ-38 seguido por FACS análise. A linha grossa indica o nível máximo de acumulação nas células transfectadas com controle de vetores. D, efeito sobre ABCB1 e ABCC1 expressão. HEK293 /ABCC1 e bc19 células com sobre-expressão ABCB1 foram tratadas com 10? M PZ-34 ou PZ-38 durante 3 dias, seguido por análise de transferência de Western de ABCB1 com o anticorpo monoclonal C219 e ABCC1 utilizando anticorpo monoclonal MRPr1. GAPDH foi usada como um controlo de carga.

Para determinar a especificidade de PZ-34 e ZP-38, testou-se o seu efeito sobre o efluxo de fármacos mediado por dois outros transportadores ABC que são conhecidos por causar MDR, ABCB1 e ABCC1, utilizando células-transfectadas MCF7 com ABCB1 (bc19) [13] e células transfectadas HEK293 com ABCC1 (HEK293 /ABCC1) [14], [15]. No entanto, encontramos nenhum efeito destes compostos sobre a actividade da ABCB1 e ABCC1 na diminuição da acumulação Adriamicina (Fig. 4C). Ambos PZ-34 e ZP-38 também não afecta a expressão de ABCB1 e ABCC1 (Fig. 4D). Assim, PZ-34 e PZ-38 pode ser específico para ABCG2 e não afetam de efluxo de fármacos mediado por duas outras grandes transportadores ABC.

Efeito da PZ-34 e PZ-38 na resistência a múltiplas drogas mediada por ABCG2

para determinar se ambos PZ-34 e ZP-38 tem a capacidade de sensibilizar resistência a drogas mediada por ABCG2, foi realizada a análise dos efeitos destes compostos sobre a sobrevivência de células /ABCG2 HEK293, na ausência ou presença de mitoxantrona . Como mostrado na Fig. 5A, tanto PZ-34 e ZP-38 sozinho não têm efeito sobre a sobrevivência de células /ABCG2 HEK293 em concentrações menores do que 10 ug /ml. A sua IC

50 foram estimados como sendo ~12.9 e 20 pM, respectivamente (Tabela 1). Assim, tanto PZ-34 e ZP-38 tem pouco citotoxicidade para células /ABCG2 HEK293 a concentrações inferiores a 10 uM, o que sugere que eles não podem actuar em outras moléculas essenciais com elevada afinidade para a sobrevivência da célula.

, potência de PZ-34 e ZP-38 na inversão da resistência à mitoxantrona. células HEK293 /ABCG2 foram tratados com ou sem 0,1 fiM (IC

10) mitoxantrona na ausência ou na presença de diferentes concentrações de PZ-34 ou PZ-38, seguido pelo ensaio de SRB. B, índice de sensibilização de PZ-34 e ZP-38 em células HEK293 /ABCG2. células HEK293 /ABCG2 foram tratados com várias concentrações de mitoxantrona na ausência ou na presença de diferentes concentrações de PZ-34 ou PZ-38, seguido pelo ensaio de SRB. C e D, índice de sensibilização das PZ-34 e PZ-38 em células MCF7 /AdVp3000 selecionada com a droga. As células MCF7 /AdVp3000 foram tratados com várias concentrações de mitoxantrona (C) ou adriamicina (D) na presença de DMSO (veículo) ou 500 nM de PZ-34 e ZP-38 seguido por ensaio MTT. Sensibilização índice foi calculado usando IC

50 das drogas anti-cancro, na ausência ou presença de PZ-34, PZ-38, ou FTC. Os dados apresentados são SD ± média de três experimentos independentes.

A seguir, determinou o efeito de PZ-34 e PZ-38 na sensibilização resposta celular a 0,1 mM mitoxantrona que por si só produz menos de 10% de inibição de crescimento de células /ABCG2 HEK293. Como mostrado na Fig. 5A, tanto PZ-34 e PZ-38 a uma concentração de gama baixa sensibilizar estas células a mitoxantrona. A cerca de 1,2 uM, tanto PZ-34 e ZP-38 auxiliar de 0,1 uM mitoxantrona para inibir completamente o crescimento celular. A IC

50 de PZ-34 e ZP-38 na sensibilização da resistência a mitoxantrona foram calculadas para ser de 71 e 45 nM, respectivamente (Tabela 1). Também testámos PZ-8 e ZP-16 e verificou que a IC

50 destes compostos por si só é ~ 20 pM e seu IC

50 na sensibilização da resistência a mitoxantrona de células MCF7 /AdVp3000 são ~ 80 e ~ 70 nM , respectivamente. A IC

50 da FTC na sensibilização da resistência a mitoxantrona, por outro lado, é muito mais elevado a 326 nM (Tabela 1).

Em seguida, foi examinada a resposta à dose de PZ-34 e ZP-38 mitoxantrona na sensibilização da resistência mediada por ABCG2 usando células /ABCG2 HEK293. Como mostrado na Fig. 5B, o IC

50 de mitoxantrona diminui drasticamente na presença de PZ-34 e ZP-38. Aos 50 nM, PZ-34 e ZP-38 reduzem significativamente o IC

50 de mitoxantrona com um índice de sensibilização de 1,6 e 2,2, respectivamente (Tabela 2). A 500 nm, o índice de sensibilização de PZ-34 e ZP-38 são de 8,7 e 14,3, respectivamente (Tabela 2). Por outro lado, o índice de sensibilização de FTC a 500 nm é de apenas 3,9 (Tabela 2). Estes resultados mostram que PZ-34 e PZ-38 são inibidores ABCG2 novos muito potentes.

Para investigar mais se PZ-34 e PZ-38 pode reverter MDR mediada por ABCG2 em uma célula de câncer resistente a medicamentos linha, foi utilizada a linha de células de cancro da mama seleccionado de drogas MCF7 /AdVp3000 que super-expressa ABCG2 e testado um substrato droga anticâncer adicional de ABCG2, adriamicina. Como mostrado na Fig. 5C, tanto PZ-34 e PZ-38 a 500 nm reduzir drasticamente a resistência dos MCF7 /AdVp3000 tanto Adriamicina e mitoxantrona.

PZ-34 e PZ-38 não afetam oligomerização ABCG2

Anteriormente, demonstrou-se que podem existir ABCG2 e funcionar como um homo-oligómero [4], [6]. Para examinar se PZ-34 e ZP-38 possivelmente inibir a oligomerização ABCG2, co-imunoprecipitação de dois ABCG2 diferencialmente etiquetadas foi realizada como previamente descrito [4], após um tratamento de 6 horas com PZ-34 e ZP-38 a 3,3? M. No entanto, não houve efeito da PZ-34 e PZ-38 na co-imunoprecipitação ABCG2 (veja suplementar Fig. S1), sugerindo que PZ-34 e PZ-38, semelhante ao PZ-39 [7], não pode afetar ABCG2 oligomerização. No entanto, devido à limitação de co-imunoprecipitação, estes inibidores podem afectar a dimerização que não pode ser revelado por co-imunoprecipitação, devido à existência de, pelo menos, 3 sítios de interacção diferentes do ABCG2 oligomérico [4], [6].

Efeito de PZ-34 e ZP-38 sobre a meia-vida de ABCG2

Como discutido acima, tanto PZ-34 e ZP-38 suprimida ABCG2 expressão (Fig. 2). Para excluir a possibilidade de que esta supressão é devido à inibição da expressão do gene, foi realizada a análise em tempo real de RT-PCR. Como mostrado na Fig. S2, os níveis de estado estacionário de ARNm ABCG2 são iguais entre os grupos de controlo e de tratamento com o composto e, portanto, eliminar a possibilidade de que estes compostos afectam a transcrição ou a estabilidade do ARNm ABCG2.

Para determinar se a expressão reprimida de ABCG2 é devido à degradação do inibidor induzido como observamos anteriormente com PZ-39 [7], examinámos o efeito de PZ-34 e ZP-38 sobre a meia-vida de ABCG2 em células /ABCG2 HEK293 por células pré-tratamento com ciclo-heximida, que inibe a síntese de proteínas durante o alongamento, seguido por tratamento com PZ-34 e ZP-38 durante vários tempos. Como mostrado na Fig. 6A, a perda de ABCG2 em células tratadas com uma combinação de ciclo-heximida e PZ-34 ou PZ-38 é muito mais rápido do que o do tratamento de controlo com veículo de DMSO ou de controlo FTC. A meia-vida de ABCG2 na presença de PZ-34 e ZP-38 é estimado para ser ~ 8 horas que é estável com uma semi-vida estimada de mais de 60 horas para o tratamento de controlo com FTC ou DMSO (Fig. 6B ). Assim, PZ-34 e ZP-38 provavelmente acelera a degradação da proteína ABCG2 semelhante como PZ-39 [7].

a, análise de transferência de Western. células HEK293 /ABCG2 foram primeiro tratados com 5 ug /ml de ciclo-heximida (CHX), seguido pela adição de 3 uM de PZ-34, PZ-38, controlo FTC, ou DMSO por várias vezes. As células foram então colhidas para análise de Western blot de ABCG2 sondadas com anticorpo monoclonal BXP-21. Actina foi utilizado como um controlo de carga. B, meia-vida de ABCG2. ABCG2 níveis de Western blot, conforme mostrado no painel A foram determinados utilizando Scion imagem e representados graficamente contra o tempo de tratamento. Os dados apresentados são SD ± média de três experimentos.

degradação ABCG2 PZ-34 e PZ-38 induzem no lisossoma

Foi relatado anteriormente que a do tipo selvagem e correctamente dobrado ABCG2 proteínas são degradados no lisossoma enquanto que as proteínas mutantes e mal dobradas estão envolvidas na degradação mediada por ubiquitina proteassoma em [16]. Além disso, verificou-se anteriormente que o PZ-39 provoca a degradação ABCG2 via mediada por lisossoma degradação [7]. Para determinar se PZ-34 e ZP-38 causa degradação ABCG2 através de lisossoma ou de proteassoma, utilizou-se bafilomicina

1, um inibidor da degradação de proteínas em lisossoma, e MG-132, um inibidor de proteassoma tal como previamente descrito [7]. Como mostrado na Fig. 7A, pré-tratamento das células com bafilomicina

1 inibe PZ-34 e induziu-PZ-38 ao passo que a degradação ABCG2 pré-tratamento com MG-132 não faz. Assim, provavelmente PZ-34 e PZ-38 também induzem a degradação ABCG2 no lisossoma, mesmo que PZ-39 [7].

A, degradação ABCG2 nos lisossomos. HEK293 /ABCG2 células foram tratadas com 3 uM de PZ-34 ou PZ-38 na ausência ou na presença de 10 nM de A bafilomicina

1 (BMA1) ou 2? M MG-132 por várias vezes. As células foram então colhidas para análise por Western blot da expressão ABCG2 sondadas com anticorpo monoclonal BXP-21. Actina foi utilizado como um controlo de carga. B, ABCG2 alterações conformacionais. células HEK293 /ABCG2 e MCF7 /AdVp3000 foram tratadas com 10? M de PZ-34, PZ-38, ou de controlo de veículo de DMSO seguido por coloração com o anticorpo monoclonal 5D3 e análise por FACS. Arrowhead indicam grupos tratados o PZ-34 e PZ-38.

PZ-34 e PZ-38 se ligam a ABCG2

Foi relatado anteriormente que o anticorpo monoclonal 5D3 se liga a ABCG2 na superfície de células mais facilmente após a ligação de inibidores de ABCG2 possivelmente devido ao inibidor induzidas alterações conformacionais de ABCG2 [7], [12], [17]. Para determinar se PZ-34 e ZP-38 potencialmente se ligam a ABCG2, foi realizada análise de coloração ABCG2 usando 5D3 na presença ou ausência de PZ-34 e ZP-38. Como mostrado na Fig. 7B, tanto PZ-34 e ZP-38 causa um aumento na coloração de 5D3 em ambas /células AdVp3000 e HEK293 /ABCG2 MCF7, indicando que ambos PZ-34 e ZP-38 pode ligar-se a ABCG2 e os fios de ligação para a alteração conformacional da ABCG2.

Discussão

no presente estudo, mostramos que existem, possivelmente, dois grupos de inibidores ABCG2 ea degradação ABCG2 induzida por inibidor no lisossoma pode ser mais comum do que anteriormente previsto. Mostramos também que PZ-34 e PZ-38 são inibidores potentes ABCG2. Embora PZ-34 e PZ-38 são estruturalmente diferente do inibidor ABCG2 previamente identificado, PZ-39, eles parecem ter mecanismo de acção semelhante ao inibir a função ABCG2 e acelerando a degradação ABCG2 no lisossoma.

Entre muitos inibidores ABCG2 previamente identificados, alguns são conhecidos por ser específico para ABCG2 e nenhum tem sido investigada para mostrar se eles poderiam acelerar a degradação ABCG2 no lisossoma. Neste e em nossos estudos anteriores [7], descobrimos que FTC não afetou a expressão ABCG2 Considerando que tanto NSC-168201 e NSC-120668 fiz. Nos quatro inibidores ABCG2 novos (PZ-8, 16, 34, e 38), testados neste estudo, três suprimida expressão ABCG2 enquanto o outro não. Tomados em conjunto, acreditamos que existem dois grupos de inibidores ABCG2 com uma inibição única atividade ABCG2 e o outro também suprimir a degradação ABCG2 além de inibir a função ABCG2. Chamamos estes inibidores como inibidores estáticas e dinâmicas, respectivamente.

Não se sabe quais as diferenças fundamentais entre esses dois grupos de inibidores de fazer com que a diferença no seu mecanismo de acção. É, no entanto, tentador especular que se ligam a dois locais diferentes em ABCG2. A ligação a um ou outro local vai causar alterações conformacionais de ABCG2 que levam à inibição da actividade ABCG2. No entanto, a ligação a um dos sítios também vai facilitar a endocitose e a degradação ABCG2 no lisossoma. A mudança de conformação ABCG2 por PZ-34 e ZP-38 detectado utilizando o anticorpo monoclonal 5D3 sugere que PZ-34 e ZP-38 ligam-se directamente ao ABCG2 embora os seus locais de ligação são actualmente desconhecidas. Desde FTC também provoca alteração conformacional mas não acelera a degradação ABCG2, PZ-34 e ZP-38 provavelmente não se ligam ao local semelhante como FTC. Anteriormente, foi demonstrado que a ligação de endocitose e degradação do receptor β

2-adrenérgicos acelerado no lisossoma [18] agonista, suportando a hipótese acima. Embora seja improvável, é também possível que os inibidores de ABCG2 dinâmicos podem ter efeito fora do alvo que activa as vias de montante envolvidas na degradação ABCG2. Independentemente disso, estas possibilidades precisam ser testados em futuros estudos aprofundados.

Anteriormente, foi demonstrado que a degradação ocorre principalmente ABCG2 através de dois mecanismos diferentes. Enquanto correctamente dobrado tipo selvagem ABCG2 são degradados principalmente através lisossoma [16], as proteínas mutantes são degradados pela proteassoma através de um mecanismo de controlo de qualidade de [16], [19], [20]. Afigura-se que o mecanismo de controlo de qualidade ocorre no ER direito após a síntese e degradação de ABCG2 normal das proteínas de tipo selvagem pode ocorrer por meio de endocitose de membranas de plasma a partir de ABCG2. Atualmente, não se sabe ainda se a degradação induzida inibidor da dinâmica de ABCG2 ocorre por tráfico de lisossoma das membranas plasmáticas através de endocitose e /ou a partir de membranas ER imediatamente após a sua síntese.

Embora se sabe se PZ -34 e PZ-38 são específicos para ABCG2, os nossos resultados mostram que elas não afectam ABCB1 e função ABCC1 e expressão. Assim, PZ-34 e ZP-38 são mais específicos para ABCG2 do que alguns dos inibidores ABCG2 previamente identificados, tais como o GF120918 ABCG2 conhecido inibidor que parece inibir ABCB1 e /ou ABCC1 igualmente bem [2], [21]. Descobrimos também que tanto PZ-34 e ZP-38 não são citotóxicos com uma concentração até 10 ng /ml, sugerindo que esses inibidores ABCG2 provavelmente não se ligam a e inibem outras proteínas celulares com elevada afinidade, que são essenciais para a sobrevivência celular. No entanto, mais estudos são necessários para investigar a especificidade da PZ-34 e PZ-38 e para determinar se eles se ligar e inibir outros membros da família transportador ABC humano.

O facto de PZ-34 e PZ -38 tem nenhuma citotoxicidade em células HEK293 em concentrações menores que 10 um e pode efectivamente reverter MDR sugere que a janela de índice terapêutico destes compostos são grandes. Uma quimio-sensibilizador ideal é que ele não deve ser tóxico em si. Claramente, PZ-34 e PZ-38 satisfazer este requisito nos estudos in vitro em. No entanto, não se sabe se estes compostos são tóxicos e eficaz em reverter MDR in vivo, que precisa ser avaliada em estudos futuros utilizando modelos animais.

Materiais e Métodos

Materiais

anticorpos

O anticorpo monoclonal BXP-21 contra ABCG2, anti-Myc e anti-HA foram de ID Labs, sinalização celular, e Roche, respectivamente. O anticorpo monoclonal C219 e MRPr1 foram adquiridos a Kamiya biomédica Companhia. anticorpo 5D3 conjugado-biotina e conjugados de ficoeritrina-estreptavidina de eBiosciences. Todos os reagentes de electroforese, kit de ensaio de concentração de proteína, e membranas de difluoreto de polivinilideno foram adquiridos de Bio-Rad. FTC, adriamicina, mitoxantrona, camptotecina, ditiotreitol, Sulforrodamina B (SRB), e Triton X-100 foram de Sigma. Os compostos PZ-8, PZ-16, PZ-34, PZ-38 e ZP-39 foram adquiridos a partir de especificações. NSC-168201 e NSC-120668 foram presentes de National Cancer Institute. Proteína-G PLUS-Agarose e de SYBR Verde PCR Master Mix eram de Santa Cruz Biotechnology and Applied Biosystems, respectivamente. LipofectAMINE Plus e G418 foram de Invitrogen. cultura de células IMEM médio e DMEM eram de Biosource International and Media Tech, respectivamente. Todos os outros produtos químicos eram de notas de biologia molecular da Sigma ou Fisher Scientific.

cultura de células, tratamentos e preparações de lisados ​​

linha de células de cancro da mama humano MCF7 e as suas linhas de derivativos bc19 (um presente de Julie Horton no Instituto Nacional de Ciências de Saúde ambiental) e MCF7 /AdVp3000 (um presente de Susan Bates no Instituto Nacional do Câncer), HEK293 /ABCC1 [14], HEK293 /vetor [14], HEK293 /ABCG2 [4] foram cultivadas como descrito anteriormente [ ,,,0],4], [13], [14], [22]. Para a análise de degradação ABCG2, células HEK293 /ABCG2 foram primeiro tratadas com 10 nM de bafilomicina

1 ou 2 ^ M MG132 durante 24 horas seguido de tratamento com 3 ^ M PZ-34 ou PZ-38 durante vários tempos e recolha de lisados ​​celulares . Para a determinação da semi-vida ABCG2, células HEK293 /ABCG2 foram tratados com 5 ug /ml de ciclo-heximida, 3? M ou 34 PZ-PZ-38 por várias vezes, seguido de recolha de células. Lisado preparação foi realizada como descrito anteriormente [22].

Western blot, imunoprecipitação e análise de FACS

Western blot, imunoprecipitação e análise de FACS de acumulação de droga foram realizados exactamente como descrito anteriormente [ ,,,0],4], [6]. Para determinar a alteração conformacional da ABCG2 a seguir ao tratamento com inibidores ABCG2, células HEK293 /ABCG2 foram incubados com 10 ^ M PZ-34 ou PZ-38 a 37 ° C durante 30 minutos antes da incubação com o anticorpo 5D3 conjugado com biotina (1:100 diluição) durante 2 horas. As células foram então lavadas 3 vezes e incubadas com ficoeritrina-estreptavidina durante 30 min seguido de lavagem e de análise de FACS utilizando.

Ensaio de Citotoxicidade

A citotoxicidade foi determinada utilizando ensaios SRB e MTT como anteriormente descrito [ ,,,0],6], [22], [23]. O efeito de inibidores ABCG2 na resistência aos medicamentos foi determinada por exposição das células a uma gama de concentrações de fármacos anti-cancerígenos, na ausência ou na presença de diferentes concentrações de inibidores ABCG2. A potência e sensibilização índice de inibidores ABCG2 foram calculados como se segue:

em tempo real de RT-PCR

extracção de ARN e em tempo real de RT-PCR foram realizados como descrito anteriormente [22]. As sequências dos iniciadores são ABCG2 5′-GGCTTTCTACCTGCACGAAAACCAGTTGAG-3 ‘(directo) e 5′-ATGGCGTTGAGACCAG-3′ (inverso). As sequências dos iniciadores GAPDH são 5’-AAGGACTCATGACCACAGTCCAT-3 ‘(directo) e 5′-CCATCACGCCACAGTTTCC-3’ (inverso). O nível de ARN ABCG2 relativo (2

ΔCT) tratados com inibidores foi expressa como percentagem do controlo (na presença de DMSO a 0,1%) onde ΔCT (ciclo limite) = (CT

ABCG2-CT

GAPDH ).

Informações de Apoio

Figura S1.

Efeito de PZ-34 e ZP-38 em ABCG2 dimerização /oligomerização. células HEK293 co-transfectadas com Myc- e ABCG2 marcada com HA foram expostos a 3,3 uM PZ-34, PZ-38, ou controlo de DMSO, durante 6 horas e os lisados ​​celulares foram sujeitos a imunoprecipitação com anti-myc ou anticorpo monoclonal anti-HA seguido por análise de western blot sondado utilizando anticorpos anti-HA e anti-Myc

doi:. 10.1371 /journal.pone.0015276.s001

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Figura S2.

Efeito da PZ-34 e PZ-38 no nível de mRNA ABCG2. células HEK293 /ABCG2 foram tratadas com veículo DMSO, PZ-34, ou PZ-38 durante vários tempos e colhidas para preparação de ARN e análise em tempo real de RT-PCR. Os dados apresentados são SD ± média de três experiências independentes

doi:. 10.1371 /journal.pone.0015276.s002

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Reconhecimentos

Agradecemos ao Programa de Desenvolvimento Therapeutics no NCI NSC para os compostos utilizados neste estudo.