Abstract

glicosilação aberrante é uma característica comum de muitas doenças malignas, incluindo cancro colorectal (CRCs). Cerca de 15% do CRC mostrar o fenótipo instabilidade de microssatélites (MSI) que está associado com uma elevada frequência de mutações frameshift bialélicos na A10 codificação microssatélites mononucleótido do

transforming growth factor receptor beta 2

(

) gene. Se e como prejudicada TGFBR2 sinalização em células MSI CRC afeta superfície celular padrão de glicano é largamente inexplorado. Aqui, utilizou-se a linha celular deficiente MSI TGFBR2-carcinoma do cólon HCT116 como um sistema modelo. clones estáveis ​​que conferem doxiciclina (DOX) expressão -inducible de um único tipo selvagem copy

TGFBR2

transgene foram gerados por troca de cassete mediada por recombinase (RMCE). Em dois clones independentes, foi mostrado expressão DOX-indutível da proteína de tipo selvagem e TGFBR2 reconstituição da sua função de sinalização. experiências de marcação metabólica, utilizando o precursor de ácido siálico tritiada

N

-acetil-D-manosamina (ManNAc) revelou uma diminuição significativa (-30%) da sua incorporação em Sialoglicoproteínas recém-sintetizado de uma maneira TGFBR2-dependente. Em particular, nós detectamos uma diminuição significativa da sialilada SS1-integrina sobre reconstituído sinalização TGFBR2 que não influenciou retorno da proteína SS1-integrina. Notavelmente, TGFBR2 reconstituição não afectou os níveis de transcrição de qualquer das sialiltransferases humanos conhecidos, quando examinado por análise em tempo real de RT-PCR. Estes resultados sugerem que a sinalização TGFBR2 reconstituída num sistema de linha celular isogénica modelo MSI pode modular a sialilação de proteínas da superfície celular, como SS1-integrina. Além disso, nosso sistema modelo será adequado para desvendar os mecanismos moleculares subjacentes à glycobiology tumor MSI alterado

Citation:. Lee J, Ballikaya S, Schönig K, Bola CR, Glimm H, Kopitz J, et al. (2013) Fator Transformador de Crescimento Beta Receptor 2 (TGFBR2) Alterações sialilação na instável Linha celular (MSI) Câncer Colorretal microssatélites HCT116. PLoS ONE 8 (2): e57074. doi: 10.1371 /journal.pone.0057074

editor: Chih-Hsin Tang, China Medical University, Taiwan

Recebido: 17 de novembro de 2012; Aceito: 17 de janeiro de 2013; Publicação: 27 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O apoio financeiro foi fornecida por DFG (GE592 /6-1) para JK e J. G. e DFG (KFO 227) para C.R.B. e HG Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cerca de 15% dos tumores colorretais hereditárias e esporádicas exibir a instabilidade de microssatélites de alta frequência (aqui denominado MSI) fenótipo. MSI manifesta como variações de comprimento de inúmeras sequências repetitivas curtas (microssatélites) causada por perda de função normal reparação de emparelhamentos incorrectos do ADN (MMR) nestas células de tumor. Se MSI afecta microssatélites de codificação de genes expressos as mutações frameshift resultantes levam a terminação da tradução prematura e a função da proteína prejudicada [1] – [3]. Um grande número de genes que albergam microssatélites em suas regiões de codificação foram identificados e verificou-se ser frequentemente afectadas por mutações frameshift no MSI tumores colorrectais [4] – [7]. As mutações em um número limitado desses genes são acreditados para conduzir MSI tumorigénese.

TGFBR2

é um dos genes alvo mais interessantes MSI, pois faz parte de uma via de sinalização chave em células epiteliais do cólon e verificou-se ser inactivado a alta frequência de mutações por desvio de enquadramento bialélicos em MSI tumores colorrectais [8]. TGFBR2 transmembranar é uma serina-treonina-quinase que é capaz de reprimir a proliferação e induz a apoptose também desencadeada por diferenciação e factor de crescimento transformante beta (TGF-beta) de activação [9] – [11]. Após a ligação do ligando a TGF-SS1 a formação de um complexo receptor hetero-tetramérica composta de tipo 1 (TGFBR1) e tipo 2 (TGFBR2) receptores é iniciada e proteínas a jusante, tais como Smad2 e Smad3 tornar fosforilada [10], [12] . Estas proteínas SMAD fosforilados, em seguida, associar SMAD4 e sobre a translocação para a transcrição directa núcleo de diferentes genes-alvo, como

SMAD7

[13] ou

SERPINE

[14].

Muitos proteínas, especialmente proteínas de superfície celular, são glicosiladas e requerem modificações de glicano, a fim de conferir a função normal de comunicação celular, o reconhecimento e adesão. Além disso, a glicosilação alterada de superfície celular tem sido implicada na tumorigénese e metástase [15] – [17]. No cancro do cólon, a expressão do mRNA de várias glicosiltransferases foi encontrado para ser aumentado quando comparado com a mucosa de cólon normal [18], [19] correspondente. Além disso, fucosilação de proteínas de superfície celular também tem sido implicado no cancro [20]. Fucosiltransferases estão associados com a formação de antigénios tumorais como sialil-Le

X -Le e

a [21]. O ácido siálico é um componente-chave de glicoproteínas e tem sido correlacionada com a metástase [22]. posicionamento diferente de ácido siálico na ligação da superfície da célula para mascarar ou desmascaramento de sacáridos específicas que são importantes para a metástase [23]. Demonstrou-se, que o ácido siálico está correlacionada com

In vivo

tumorigenicidade na linha de células de CRC HCT116 [24].

SS1-integrina é um membro de uma grande família de proteínas de proteínas de adesão conhecido para ser altamente sialilada. As integrinas são glicoproteínas que formam complexos hetero-dimérica de a- e ß-subunidades que conferem diferentes afinidades ligando. Uma vez que a sinalização por integrinas está envolvido em vários processos celulares essenciais, como adesão focal e motilidade, a sinalização de integrina prejudicada tem sido implicada na metástase de câncer [25], [26]. Tem sido relatado que a ligação da lectina SNA para sialilada SS1-integrina está aumentada em tecido de tumor de cólon em comparação com epitélio de cólon normais [27]. Além disso, foi mostrado de-sialilação de SS1-integrina para estimular a sua ligação a glicoproteínas da matriz extracelular [28], [29].

Embora sinalização TGFBR2 está envolvida na comunicação célula-célula, a adesão de células e de células migração a função desta via no padrão de glicosilação das proteínas da superfície celular é largamente inexplorado. A evidência experimental sugere uma ligação possível entre genes alvo mutantes MSI e o padrão de glicosilação na superfície da célula [30]. No presente estudo, foi utilizado o TGFBR2 reconstituído MSI linha de células de cancro colo-rectal HCT116 como um sistema modelo para analisar alterações TGFBR2-dependentes na glicosilação de proteínas. Foi detectada uma diminuição na sialilação mundial de proteínas recentemente sintetizadas, assim, que reflectem o aumento da sialilação inversamente observada em tumores colorectais primários. Em particular, nós identificamos sinalização TGFBR2 como um modulador dos níveis de sialilação de SS1-integrina.

Materiais e Métodos

Os plasmídeos

S2F-cLM2CG-FRT3 [31] contém uma unidade de transcrição bidirecional controlado-tet de regulação simultânea dos dois genes repórter pirilampo

luciferase

e proteína fluorescente vermelha

mCherry.

Esta cassete de expressão é flanqueado por dois locais FLP de reconhecimento específico do hetero, um mutante F3 e um local de tipo selvagem M [32]. Para a montagem retroviral, foram utilizados os vetores pVPack-GP e pVPack-VSV-G (Stratagene). Recombinação mediada pelo enzima Flpo-recombinase que é codificada pelo plasmídeo pCAGGS-Flpo-IRES-puro obtido a partir de Michael Hahn (DKFZ, Heidelberg). O plasmídeo pE11.F3.HygTK.F [31] codifica para uma proteína de fusão de higromicina B-fosfotransferase-timidina quinase (HygTK) translacional foi utilizado para a selecção antibiótica e geração da linha de células HCT116-mestre HygTK. O vector retroviral S2F-cLM2CG-FRT3-TGFBR2 foi gerado através de amplificação por PCR do tipo selvagem

TGFBR2

ADNc a partir do plasmídeo pcDNA3.1 expressão /His-TGFBR2 [30], utilizando iniciadores que transportam

EcoRI

ou

NotI

(NEB) de restrição (Tabela S1) e substituição do

EcoRI

/

NotI mCherry

fragmento do S2F-cLM2CG-FRT3. Verificação do local de inserção correcta e a sequência do tipo selvagem

gene TGFBR2

foi confirmada por análise de sequência de ADN.

Linhas Celulares

Todas as linhas celulares foram cultivadas em DMEM (PAA) suplementado com-inactivado pelo calor 10% de FBS ouro (PAA) e 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (PAA), utilizando condições padrão. A linha de células parental HCT116 CRC foi comprado de European Collection of Cell Cultures (ECACC). Esta linha de células MMR deficiente exibe o fenótipo MSI e refratária a sinalização TGF-ß mediada devido a mutações frameshift bialélicos na A10 microssatélites de codificação da endógena

gene TGFBR2

. A linha de células HCT116 AWE17 (HCT116-Tet-On) é um derivado transfectadas de forma estável da linha de células HCT116 parental que confere expressão constitutiva do transactivador da transcrição reversa (rtTA) e a proteína EGFP [33]. A linha celular HepG2 foi usada como um controlo positivo para a sinalização Smad2. As células 293T foram obtidas a partir de ATCC. Para a sinalização de experiências, as células foram privadas durante 17 h, na presença e na ausência de 1 ug /ml de DOX (Sigma) e subsequentemente incubadas com 10 ng /ml de TGF-SS1 recombinante (Cell Signaling) durante 1 h. As experiências de transfecção foram realizadas utilizando Fugene HD Transfection Reagent de acordo com as instruções do fabricante (Roche). selecção de antibiótico foi realizada utilizando higromicina B (Hyg, 100 ug /ml, o PAA), puromicina (1,5 ug /ml, Sigma) e o ganciclovir (Gan, 40