Abstract

O tratamento sistêmico de pacientes com câncer em estágio inicial tentativas para erradicar a doença metastática oculta para evitar a recorrência e aumento da morbidade. No entanto, a previsão de recorrência de uma análise do tumor primário é limitado porque as células cancerosas disseminadas representam apenas um pequeno subconjunto da lesão primária. Aqui analisamos a expressão de microRNAs (Mirs) no soro obtidos pré-cirurgicamente de pacientes com câncer colorretal em fase inicial de circulação. Grupos de cinco pacientes com e sem recorrência da doença foram utilizados para identificar um painel informativo de miRs circulante utilizando PCR quantitativa da expressão de miR de todo o genoma, bem como um conjunto de candidatos miRs publicados. Um painel de seis miRs informativas (miR-15a, mir-103, miR-148a, miR-320a, miR-451, miR-596) foi obtido a partir desta análise e avaliada em um conjunto de validação separada de trinta pacientes. agrupamento hierárquico dos níveis destes seis miRs circulantes e análise de Kaplan-Meier de expressão mostraram que o risco de recorrência da doença de cancro fase cólon precoce pode ser prevista por este painel de miRs que são mensuráveis ​​na circulação na altura do diagnóstico (P = . 0,0026; Taxa de Risco 5,4; IC 95% de 1,9 a 15)

Citation: Shivapurkar N, Weiner LM, Marshall JL, Madhavan S, Deslattes Mays A, Juhl H, et al. (2014) A recorrência de cancro do cólon precoce Stage previsto por padrão de expressão de microRNAs de circulação. PLoS ONE 9 (1): e84686. doi: 10.1371 /journal.pone.0084686

editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 19 Agosto, 2013; Aceito: 18 de novembro de 2013; Publicação: 06 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Shivapurkar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado em parte pelo NIH concede CA108440 (AW), P30 CA051008 (LW), HHSN2612200800001E (SM), o Cancer Center Lombardi (NS) e do Centro Ruesch (NS, JLM, SM, e AW). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Um dos autores (Dr. Juhl) é affiliatiated Indivumed, GmbH. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de partilha e não fornece um conflito de interesses.

Introdução

O câncer colorretal (CCR) é a terceira principal causa de mortalidade por câncer que afeta igualmente homens e mulheres. Worldwide é responsável por cerca de um milhão de novos cancros e de meio milhão de mortes, representando 10 por cento das mortes por câncer [1]. Resultados para os pacientes com câncer colorretal em estágio inicial são heterogêneos, com taxas de sobrevida em 5 anos de doenças específicas para pacientes com estágio II de 72-88% e 40-71% para a fase III [2]. A maioria dos pacientes com doença em estágio II são curados apenas por cirurgia, enquanto a quimioterapia adicional pode fornecer benefícios de sobrevivência para pacientes com doença fase posterior. Ainda assim, cerca de 1 em cada 4 pacientes com doença em estágio inicial vai sofrer de recorrência e biomarcadores que identificam pacientes de alto risco no momento do diagnóstico inicial e cirurgia permitiria selecionar os pacientes para um acompanhamento mais próximo e tratamentos possivelmente sistêmicas ([3], [ ,,,0],4], [5];. revisto recentemente em [6])

microRNAs (miRNAs ou miRs) são pequenos RNAs não-codificantes, que desempenham um papel significativo no controle das atividades das vias celulares, tanto em fisiologia e patologia (ver, por exemplo [7]). A função distinta de miRs em diferentes cancros tornou-se mais evidentes ao longo dos últimos anos [8], [9], e muitos estudos mostram que as assinaturas miR pode ser utilizado para distinguir diferentes tipos de cancro [10], [11], [12], [13], prognósticos [14], [15], revelam alvos potenciais [16], as vias de sinalização alterados [17], ou progressão maligna de carcinoma in situ a doença invasiva [18]. Mais surpreendentemente, a comparação de perfis de Mir e ARNm de lesões de cancro primário e metastático mostrou que miRs fornecer uma assinatura mais fiável e distinto do que mRNAs e descobriram que as assinaturas miR foram superiores aos mRNAs na identificação da fonte de órgãos de metástases de origem desconhecida [19] , [20]. Um estudo anterior [21], utilizando perfis de 315 miRs em tecidos expressão do estágio II cancros do cólon mostrou diferenças nos padrões de doença recorrente. Os níveis de expressão de miRs específicas nos tecidos correlacionada com a probabilidade de sobrevida livre de recorrência por meio de análise multivariada. Estes resultados sugerem que a expressão de miRs perturbadas no cancro do cólon podem ter um potencial de prognóstico.

Para além destas análises de tecidos normais e doentes, relatórios mais recentes têm mostrado que as espécies miR pode ser detectado na circulação [22] e até mesmo sugeriram que a análise de amostras de soro para miRs definidos pode ser utilizada para identificar pacientes com cancros [23], [24], [25], [26]. Estudos da miRome transmitidas pelo sangue e também mostrou aplicabilidade a outras doenças de cancro ([27]; revisto em [28], [29]). miRs na circulação parecem ser notavelmente estável [30], [31] e foi sugerido que a estabilidade é atribuível a miRs ser incluídos em vesículas de lipoproteínas, conhecidos como exossomas [32]. Aqui, nós estudamos miRs em amostras de sangue obtidas pré-cirurgicamente de pacientes com câncer de cólon estágio inicial que permaneceram livre de recidiva ou tiveram recorrência da doença. Trabalhamos com a hipótese de que os padrões alterados de miRs circulam pode indicar um risco aumentado de recorrência da doença devido às sementes metastáticas ocultas no momento do diagnóstico inicial. Nós relatamos que um conjunto de seis miRs pode ser útil em predizer a recorrência da doença risco de câncer de cólon estágio precoce.

Resultados

Circulação microRNA expressão de comparação usando uma abordagem Gene Candidato

para medir miRs na circulação, estabelecemos quantitativa por RT-PCR [33] como um método de detecção com uma gama dinâmica até 10

6 vezes por miRs em amostras de soro [18]. Como uma abordagem inicial, nós escolhemos um painel de dezasseis miRs que haviam sido mostrados para ser diferencialmente expressos entre o câncer de cólon e tecidos de cólon normais [21], [34], [35]. Inicialmente correu um estudo piloto e analisado um conjunto de amostras de soro de pacientes com câncer fase cólon primeiros que permaneceram livre de doença (n = 5) ou tiveram recorrência da doença (n = 5) dentro de uma média de 26 meses ( 0,05 vs. sem recorrência; A Fig. 1A, B). FIG. 2A mostra o intervalo de concentração de cerca de 100.000 vezes das dezasseis miRs analisados ​​no estudo piloto em circulação. Observamos as tendências esperadas do respectivo regulamento baixo-cima ou em algumas das miRs selecionados (ou seja, o miR-20, miR-135b, miR-195, miR-320, miR-615). No entanto, as diferenças não foram estatisticamente significativas (Fig. 2B). É digno de nota que o miR-320 foi uma das duas miRs que mostraram uma regulação negativa em tecidos que foi correlacionada com a sobrevivência livre de recorrência pobre [21]. Aqui, miR-320 na circulação era aproximadamente duas vezes menor em pacientes com recorrência da doença, no entanto, que a regulação negativa não foi estatisticamente significativa (Fig. 2B). A expressão de miR-498, o outro miR a partir do estudo no Exemplo de Ref. [21], foi detectada apenas em níveis muito baixos na circulação e, portanto, não adequado para a análise.

A, A partir de um estudo piloto com 10 pacientes candidato miRs preditivo de recorrência da doença foram identificados e testados quanto à sua previsão de recorrência da doença em um estudo de validação. B, de Kaplan-Meier de recorrência da doença em pacientes no estudo piloto. Os pacientes com recorrência da doença (n = 5) vs sem recorrência (n = 5): Chi quadrado 5,47, p = 0,0193; mediano time-to-recorrência = 26 meses. Foram utilizados os algoritmos Gehan-Breslow-Wilcoxon.

Candidato abordagem miR. Os níveis circulantes de 16 miRs indicado no eixo-x, que tinha sido publicado como expresso diferencialmente entre o cancro de cólon e de cólon tecidos não malignos foram analisadas [21], [34], [35]. As amostras de soro pré-cirurgia eram de pacientes no estudo piloto. Os pacientes foram acompanhados por recorrência da doença e os respectivos dados estão na Fig. 1B. A, Concentração de miRs circulantes (em relação ao U6). Observe o log-escala que cobre uma gama de 100.000 vezes. B, o rácio de expressão entre os grupos de pacientes. Alhough miR-20, o miR-195 e miR-320 mostraram uma regulação negativa ≥2 vezes, e miR-135b e miR-615 uma sobre-regulação ≥2 vezes no soro de pacientes com recidiva da doença, nem das comparações atingiu significância estatística pela ANOVA (p 0,05).

circulação microRNA expressão de comparação usando uma imparciais, Genome-wide Análise

a partir do estudo piloto acima foram selecionadas duas amostras de pacientes do livre de recidiva ( NREC) e recorrência (Rec) de grupo para uma análise imparcial miR de todo o genoma. Nós escolhemos os pacientes do estudo piloto acima, que tinha mostrado a expressão mais diferencial da miRs candidatos. Nós fundamentado que a comparação dentro de um tal par de amostra pode oferecer uma maior chance de pegar miRs específicos de recorrência. Analisamos este par de amostras de pacientes, utilizando SYBR Green qPCR arrays de expressão baseados genome-wide MIR para 760 miRs estabelecidos em nosso laboratório, utilizando reagentes comercialmente disponíveis (SBI, Mountain View CA). O resultado respectiva para os melhores 70 miRs é mostrado na Fig. 3 como um mapa de calor. Para um estudo de validação independente foram selecionados a partir deste painel seis miRs que conheceu dois critérios: (1) níveis suficientes de expressão em amostras de soro, ou seja, RT-PCR Ct valoriza ≤32 e (2) a expressão diferencial ( 3 vezes para cima ou para baixo-regulação) de uma dada amostras miR comparando REC e NREC.

mapa de calor de análise de expressão microRNA do genoma usando RT-PCR quantitativo. Dois pacientes foram selecionados a partir do estudo piloto (ver Fig. 1 e 2). A análise da expressão de miARN foi realizada durante 760 miARNs usando análise de expressão com base no qPCR. filtração e análise de dados foram realizados e os 70 miRs que mostram a maior expressão diferencial são representados no mapa de calor.

Validação de circulação Patterns microRNA expressão como um preditor de doença recorrência

para avaliar se os miRs circulantes identificados no estudo piloto acima pode prever a recorrência da doença em pacientes de baixo risco, foi utilizado um grupo separado, independente de trinta pacientes com câncer de cólon estágio inicial com resultados conhecidos. Quinze destes pacientes tiveram recorrência da doença dentro de uma média de 25 meses, enquanto que a outra quinze permaneceram livres de recorrência. As características clínicas dos pacientes neste validação definido no momento do diagnóstico inicial é apresentado na Tabela 1. No momento do diagnóstico os dois grupos de pacientes com e sem recorrência da doença não apresentaram diferenças significativas em relação à idade, sexo, tamanho do tumor , fase do tumor, localização de sua lesão primária ou histopatologia (Tabela 1). Todos os pacientes tinham doença do nó-negativo e mais de doze linfonodos examinados. Apenas um paciente (no grupo de não-retorno) era um T4, todos os outros foram T1 a T3 tumores e, portanto, com um baixo risco de recorrência conhecido.

Expressão dos seis miRs derivada identificado no estudo piloto foi medida por qRT-PCR e os dados resultantes são mostradas como valores de matérias-Ct, bem como uma gama de concentração na fig. 4A (eixos esquerdo e direito, respectivamente). A concentração dos seis miRs seleccionados na circulação abrange uma gama de cerca de 1.000 vezes, e, assim, uma gama de 100 vezes mais estreita do que as miRs monitorizados no estudo piloto (comparar as Figs. 4A e 2A). A análise de correlação dos dados mostrou uma forte correlação entre os níveis de miR-15a, miR-148a, miR-320a e miR-451 de expressão (r = 0,746-0,897; p 0,0001), enquanto que os níveis de miR-103 e miR- 596 não se correlacionaram com os níveis dos outros miRs. A Análise de Componentes Principais (PCA) do conjunto de dados mostrou um agrupamento distinto de pacientes com e sem recorrência (Fig. 4B), sugerindo que o painel de miRs pode distinguir os diferentes riscos de recorrência de pacientes.

Estudo de validação para seis miRs identificados no estudo piloto. As características dos pacientes são fornecidos na Tabela 1. Seis miRs foram derivados a partir do estudo piloto. A, os níveis de expressão com base no limiar de ciclo (Ct) valores de qRT-PCR (eixo esquerda), e a concentração calculada de miR (eixo direita). B, Análise de Componentes Principais dos dados com os dois grupos através de símbolos preto e vermelho, respectivamente.

Um cego análise de agrupamento hierárquico [18] (Fig. 5A) mostrou uma subsetting significativa em dois grupos distintos . Treze dos quinze pacientes com recorrência da doença e onze dos quinze pacientes que estavam recorrência-livre foram corretamente classificados pelos miRs nas amostras de sangue coletadas antes da cirurgia inicial (p = 0,0025; odds ratio = 17,9;. Rel risco = 5,5, 95% CI = 1,5-20,7). A análise de Kaplan-Meier das vezes a recorrência da doença nos pacientes designados para alto ou baixo risco pelo agrupamento hierarchival mostrou um resultado significativamente diferente entre os dois grupos (P = 0,0026, Fig. 5B). Assim, as seis miRs seleccionados aqui pode ser utilizada para prever o risco de recorrência da doença de fase precoce, o cancro do cólon de baixo risco, por meio da análise de uma amostra de sangue colhida no momento do diagnóstico inicial.

, agrupamento hierárquico dos pacientes do estudo de validação em grupos de baixo e alto risco com base nos níveis séricos de miR. A análise resultou na separação em dois grupos. B, Kaplan-Meier dos pacientes previsto para ter alto e baixo risco de recorrência da doença. A comparação resultou em P = 0,0026, (CI 1,9-15,0 95%) Risco Relativo 5.4. No painel A pacientes com recorrência da doença são # 1 a # 15 e sem recorrência:. # 16 a # 30

Discussão

O presente estudo avalia o possível uso de microRNAs em circulação ( miRs) para identificar pacientes com câncer de cólon, com um alto risco de doença apesar recorrência de um diagnóstico da fase inicial, a doença de baixo risco indicado por estadiamento do tumor estabelecido. Isso pode ajudar a identificar aqueles indivíduos que se beneficiariam de maior vigilância e /ou terapêutica sistémica adicional e evitaria sobre o tratamento de pacientes que não irá beneficiar devido ao seu baixo risco (revisto recentemente em [6]). A análise pode ser feito com uma pequena quantidade ( 1 ml). De soro

A origem do miRs circulação tem sido um assunto de debate. miRs associados a tumores detectados na circulação pode obviamente resultar da morte de células tumorais, bem como a partir de libertação activa por células tumorais. Além disso, miRs embalados em transportadores de protecção, tais como os exossomas podem ser entregues a células recipientes onde exercem o silenciamento do gene através do mesmo mecanismo como miRs celulares [36] ou pode ser derramado para a circulação. Além disso, miRs segregadas têm sido propostos para ser envolvido na mediação da comunicação célula-célula. Além disso, selecione conjuntos de miRs são liberados por células cancerosas e a composição desses conjuntos de miRs foi relacionado à doença maligna [37]. Embora miRs circulantes associados ao cancro são pode ser derivada a partir de células cancerosas, células estromais próprios imunes ou outras no microambiente do tumor, bem como outros órgãos que respondem a sinais de tumor são possíveis fontes [38]. Assim, as células do sistema imunológico podem secretar miRs associados ao cancro, promovendo ou inibindo a proliferação, invasão e apoptose [38], [39] e desregulação destas miRs pode ser um importante elo entre a imunidade e câncer. Embora, alguns estudos encontraram tendências paralelas entre circulam miRs e miRs de tecido (por exemplo, [18], [24]), outros sugerem que nem todos os miRs divulgados refletem a abundância miR nas células tumorais (por exemplo [37], [40]). Em geral, miRs detectadas na circulação são fornecidos por diferentes órgãos e regulação fisiológica ou alterações patológicas irá alterar os padrões de expressão de miRs circulantes (para exemplos recentes e avaliações ver Refs. [29], [41], [42], [43 ]).

ao analisar os miRs no presente estudo, um por um, em vez de em uma análise multivariada, dois miRs foram encontrados diferencialmente expressos em circulação, ou seja, miR-103 (reprimidos) e miR-596 (upregulated). miR-103 foi significativamente regulada para baixo (p = 0,038) em amostras de sangue de pacientes com recorrência da doença em comparação com pacientes livre de recidiva (Fig. 4a). Em células da cripta intestinal miR-103 é parte da rede de transição G1 /S de regulação durante o IGF-1 estimulou a proliferação e este aponta para um papel significativo no crescimento e sobrevivência celular [44]. Em contraste, o miR-596 foi significativamente regulada para cima (p = 0,0012) em amostras de sangue de pacientes com recorrência da doença. Expressão de miR-596 foi correlacionada com pior sobrevida de pacientes com ependimoma [45], mas foi inactivado em HCC [46] e reprimidos no adenocarcinoma do pâncreas [47]. Assim, não há nenhuma evidência clara ainda ligar expressão tecidual do presente miR a uma funcionalidade distinta que seria ligá-lo a progressão da doença. miRs com apenas pequenas alterações globais entre os grupos de pacientes foram miR-148a que faz parte de um grupo de reguladores negativos de genes pró-inflamatórios em células mielóides [48], mas é reduzida em tecidos de cancro pancreático [18], expressa em níveis elevados no fígado tecidos [49] e associada a lesão hepática [50]. miR-320a foi relatada anteriormente como um promissor indicador da progressão maligna no câncer de cólon [25], embora nós não ver uma indicação clara do impacto do miR-320 mudanças por conta própria neste estudo. miR-15a pode causar Apotosis [51], e tem sido relatada a participar no controlo da diafonia tumor estromal no cancro da próstata [52], bem como mediar vias pró-angiogénico na patologia associada a isquemia [53]. Curiosamente, o miR-451 foi caracterizado como um indicador de circulação da presença de cancro da mama [54] e foi mostrada para ser libertado selectivamente a partir de epitélio mamário transformado e para contribuir para a sensibilidade alterada a fármacos quimioterapêuticos ou endócrinos alvo no cancro da mama (revisto em [ ,,,0],55]). É tentador especular que as miRs circulam aqui identificados como indicadores do risco de recorrência da doença pode contribuir para o processo, impactando a sobrevivência do tumor de células, as interações do estroma tumoral, na angiogénese ou respostas de células inflamatórias para as metástases ocultas.

em Conclusão

o risco de recorrência de câncer de cólon estágio inicial podem ser previstos pelo monitoramento miRs em amostras de sangue de pacientes coletadas no momento do diagnóstico inicial.

Materiais e Métodos

Detecção de miR e quantificação em amostras de sangue

a recolha e utilização de biospecimen foi aprovado pelo Institutional Review Board (IRB), da Universidade de Georgetown sob o protocolo nº 2007-345, mais recentemente, em 2012/10/24. Todos os pacientes assinar um formulário de consentimento que permite a utilização de amostras de tecidos fluidos corporais e doados. Os formulários de consentimento e seu conteúdo foi revisto e aprovado pelo IRB. As amostras de soro ( 1 ml) foram processadas após a remoção de elementos de identificação pessoal. miR isolamento foi descrita previamente [18]. Em resumo, as amostras de soro foram misturados numa proporção de 1:10 com Qiazol reagente de lise e vortex. O lisado foi extraída com CHCI3 e a fase aquosa foi ainda processado para o ARN total usando o miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) e enriquecido para miR utilizando o kit de isolamento de RT2 qPCR-Grau Mir, MA-01 (SABiosciences).

Análise de dados

PCA e agrupamento hierárquico foram realizadas com base na média centrado e escalado níveis de expressão de miR. Os métodos de agrupamento utilizadas XLSTAT (Addinsoft Inc.) dentro do Excel (Microsoft Inc.) no OSX 10.7.5. Estes métodos permitem o cálculo de significância entre os clusters hierárquicos e p-valores da deriva, utilizando o teste exato de Fisher. 5.0 software (Graphpad) Prism foi usado para outros testes e visualização dos dados.

Reconhecimentos

Gostaríamos de agradecer Daksnapriya Balasubbramanian, Anju Preet e Ryan Navarro (todos na Universidade de Georgetown) para técnico assistência. Drs. Daniel F. Hayes (U Michigan, Ann Arbor), John M. Jessup (National Cancer Institute, Bethesda) Michael B. Atkins, Stephen Byers e Beppe Giaccone (todos na Universidade de Georgetown) leu a minuta do manuscrito e forneceram comentários e sugestões para a análise dos dados e interpretação.