Sumário

Numerosas modificações nos mecanismos epigenética têm sido descritos em vários tipos de tumores. Em busca de novos biomarcadores, investigamos a expressão de Polycomb-group (PCG) proteínas EZH2, BMI1 e SUZ12 e modificação da histona associado H3K27me3 no cancro colorectal. expressão nuclear de proteínas PCG e modificação da histona H3K27me3 foram imunohistoquímica (IHC) manchado em um tissue microarray (TMA), incluindo 247 tecidos tumorais e 47 tecidos normais, e registados com o sistema semi-automatizado Ariol. Os tecidos tumorais apresentaram maior expressão de EZH2 (p = 0,05) e H3K27me3 (p 0,001), em comparação com as suas contrapartidas normais. As análises tendência marcador combinados indicaram que um aumento do número de marcadores que mostram expressão elevada foi associada a um melhor prognóstico. Alta expressão de todos os quatro marcadores no marcador combinado análises foi correlacionada com a melhor sobrevida do paciente ea maior sobrevida livre de recidiva, com sobrevida global (p = 0,01, HR 0,42 (0,21-0,84)), sobrevida livre de doença (p = 0.007, HR 0,23 (,08-0,67) e local sobrevida livre de recidiva (p = 0,02, HR 0,30 (0,11-0,84)). em conclusão, verificou-se que a expressão de proteínas PCG e H3K27me3 mostrou valor prognóstico em nosso estudo de coorte. melhor estratificação de pacientes foi obtida combinando os dados dos biomarcadores investigados de expressão, em comparação com os marcadores individuais, o que sublinha a importância de se investigar vários marcadores simultaneamente

citação:. Benard a, Goossens-Beumer IJ, van Hoesel AQ, .. Horati H, Putter H, Zeestraten ECM, et al (2014) Valor prognóstico de Polycomb Proteínas EZH2, BMI1 e SUZ12 e histona Modificação H3K27me3 em colorectal Cancer PLoS ONE 9 (9):. e108265 doi: 10.1371 /journal.pone. 0108265

editor: Richard L. Eckert, da Universidade de Maryland School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 25 Abril de 2014; Aceito: 20 de agosto de 2014; Publicação: 22 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Benard et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

Novos biomarcadores de prognóstico são garantidos no cancro colorectal que poderiam melhorar as decisões para o tratamento de pacientes individuais, além do atual TNM (Comité Misto americana do Cancro, AJCC [1]) sistema de estadiamento , como até mesmo os pacientes com a mesma classificação TNM presentes com grandes diferenças no paciente sobrevivência e recorrência tumoral [2], [3]. mecanismos epigenéticos foram identificados como fatores com freqüência desregulada em tumores e são alvos atraentes para pesquisa com biomarcadores, por causa de seus papéis na regulação da expressão gênica e sua natureza potencialmente reversível. Inúmeras mudanças na metilação do DNA, histonas modificações e seus enzimas modificadoras têm sido descritos em vários tipos de tumor, incluindo cancro colo-rectal [4] – [6]. Neste estudo, nós nos concentramos em expressão de enzimas modificadoras de histonas do Polycomb-group (PCG) e sua modificação da histona associadas, trimethylation de lisina 27 na histona H3 (H3K27me3), em tecidos de cancro colorrectal.

A proteínas PCG agir em grandes complexos de multi-proteínas, os chamados Polycomb complexos repressores (PRC) 1 e 2 [7]. PCG proteínas desempenham um papel importante no desenvolvimento embrionário e proliferação celular [8], [9], e também estão envolvidos na indução da transição epitelial-mesenquimal (EMT) [10]. expressão aberrante de várias proteínas e correlações com o desfecho do paciente PCG têm sido relatados em vários cancros. Por exemplo, a expressão de BMI1 oncogene dedo anelar Polycomb (BMI1), um componente de PRC1 e um factor importante em células estaminais [11], [12], foi encontrada para ser correlacionado com o resultado do paciente em vários tipos de cancro [13] – [16]. Enhancer de homólogo de zeste 2 (EZH2), uma proteína-chave no complexo PRC2, também foi encontrada para ter valor prognóstico em vários tipos de cancro [17] – [20]. SUZ12 Polycomb repressivo subunidade complexa 2 (SUZ12), outro componente-chave do complexo PRC2, foi encontrado para ter funções indutor de tumores em vários tipos de câncer, incluindo câncer de cólon [21] – [23]. A modificação da histona associado H3K27me3 foi encontrado para ser expressa mais elevado em tecidos tumorais, e para ser associado com melhor prognóstico no câncer de pulmão de não pequenas células [24] e cancro da mama [19].

Usando coloração imuno-histoquímica (IHQ ) e de pontuação semi-automatizado, estudamos a expressão de proteínas PCG EZH2, BMI1 e SUZ12 e seus associados modificação da histona H3K27me3 em uma coorte de 247 TNM estágio I-III doentes com cancro colo-rectal, em correlação com a evolução clínica. Como as proteínas PCG actuar em conjunto na mesma modificação de histona, a hipótese de a combinação de todos os quatro marcadores seria mais informativa no que diz respeito ao resultado clínico em comparação com cada um dos marcadores individuais.

Materiais e Métodos

a seleção dos pacientes

os tecidos tumorais foram coletados a partir de uma série consecutiva de 408 pacientes com câncer colorretal submetidos à ressecção cirúrgica do tumor primário no Centro Médico da Universidade de Leiden (LUMC) entre 1991 e 2001. os pacientes que foram submetidos a pré-operatória tratamento, que tinham tumores bilaterais, ou um histórico de câncer que não carcinoma basocelular ou

tumores in situ

, foram excluídos da análise do estudo. Além disso, foram incluídos apenas os pacientes com um histologicamente comprovada estágio TNM I-III carcinoma colorectal, conforme determinado por um patologista experiente. Isto resultou em uma coorte de 259 pacientes, com uma média de acompanhamento de 8,6 anos. dados clinicopatológicos estavam disponíveis para todos os pacientes do estudo de coorte. Os dados foram direita censurado quando os pacientes estavam vivos ou livre de recorrência em sua última data de acompanhamento. As características dos pacientes são apresentados na Tabela 1. Informações registros paciente foi anónimos e de-identificados antes da análise de acordo com diretrizes éticas nacionais ( “Código de Uso secundário adequada do tecido humano”, Federação Holandesa de Médicos Sociedades Científicas), e aprovado pelo médico Comissão de ética da Leiden University Medical Center (LUMC). Este estudo foi realizado de acordo com as diretrizes OBSERVA (NCI-EORTC) [25].

construção de microsséries de tecido e imuno-histoquímica

(FFPE) tecidos tumorais embebidos em parafina fixadas em formalina de cada um dos pacientes na série consecutiva de pacientes com cancro colorectal (n = 408) foram recolhidas a partir dos arquivos de patologia LUMC e utilizado para construir uma micromatriz de tecido (TMA), como descrito anteriormente [26]. Secções de 4 mm foram cortadas de cada bloco TMA e utilizado para a coloração IHC. tecidos colorrectais histologicamente normais, conforme determinado por um patologista experimentado, a partir de 47 pacientes com tecidos tumorais correspondentes incluídos neste estudo foram também recolhidos e preparados para a IHQ. Os anticorpos seguintes foram utilizados para a IHQ: anti-EZH2 (612667, BD Biosciences, San Jose, CA, EUA), anti-BMI1 (ab14389, Abcam, Cambridge, UK), anti-SUZ12 (ab12073, Abcam) e anti-H3K27me3 (ab6002, Abcam). Todos os anticorpos foram validados para uso em imuno-histoquímica por Western blot [27] – [30]. Todos os anticorpos primários foram utilizados a diluições óptimas predeterminados e IHC foi realizada utilizando um protocolo padrão de IHC [31]. Resumidamente, a peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação das secções numa solução de 0,3% de peróxido de hidrogénio (em PBS) durante 20 min. A recuperação de antígenos foi realizada por aquecimento das secções durante 10 minutos a 95 ° C num tampão de citrato (pH 6, pH Baixo alvo Retrieval Solution, Dako, Glostrup, Dinamarca) para EZH2, IMC-1 e H3K27me3 e por aquecimento das secções durante 10 min a 95 ° C num tampão de Tris-EDTA (pH 9; pH elevado alvo Retrieval Solution, Dako) para SUZ12. TMA secções foram incubadas com os respectivos anticorpos primários durante a noite (16 horas). A coloração foi visualizada usando o Sistema de Detecção de Dako REAIS EnVision, Peroxidase /DAB +, Coelho /Mouse (Dako). As secções coradas foram TMA digitalizada utilizando uma ampliação de 20x no sistema Ariol semi-automatizado (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha). áreas de células de tumor (tecidos tumorais) e epitélio do cólon (em tecidos normais) foram marcados no ecrã do computador mediante inspecção visual, seguido pela formação adequada do sistema de Ariol para identificar correctamente núcleos positivamente corados e negativos dentro das áreas de tecido marcados, para cada um dos os marcadores separadamente. expressão nuclear, definida como a percentagem de núcleos corados positivamente na área marcada de cada núcleo de tecido, foi, em seguida, analisados ​​pelo programa Ariol. Vários núcleos aleatórios foram avaliados para cada seção TMA por inspeção visual após a análise automática, a fim de verificar a correta identificação de núcleos corados positivamente.

Análise estatística

Os dados foram analisados ​​em consulta com um estatístico (HP ) usando SPSS 20.0 para Windows (SPSS Inc, Chicago, EUA). 12 pacientes foram excluídos das análises estatísticas, como nem todos os dados de todos os quatro marcadores estava disponível para esses pacientes, resultando em uma coorte última paciente consistiu em 247 pacientes. Como os dados de marcadores individuais não eram normalmente distribuídas (Shapiro-Wilk-ensaio), não paramétrico de Wilcoxon signed rank-testes foram realizados para avaliar as diferenças na expressão nuclear entre tecidos tumorais e normais, emparelhados (n = 47) para cada um dos marcadores. assinado de correlação de Spearman foram realizadas análises para investigar a correlação entre a expressão nuclear das proteínas PCG individuais e modificação da histona H3K27me3. análises de tendências de risco proporcional de Cox foram realizadas para a sobrevivência univariada e multivariada de marcadores individuais. Co-variáveis ​​incluídas em todas as análises multivariadas foram a idade no momento da operação, sexo, estágio TNM do tumor (estágios tumorais I-III), localização do tumor, tamanho do tumor, estado de instabilidade de microssatélites (MSS). Co-variáveis ​​”tumor no acompanhamento” e “terapia adjuvante” foram inseridos como co-variáveis ​​dependentes do tempo. A sobrevivência global (OS) foi definido como o tempo de uma cirurgia até à morte (por qualquer causa). sobrevida livre de doença (DFS) foi definido como o tempo desde a cirurgia até a ocorrência de um segundo tumor primário colorretal, recidiva loco-regional ou recorrência distante ou morte por câncer colorretal. Locorregional sobrevida livre de recorrência (LRRFS) foi definido como o tempo de uma cirurgia até a ocorrência de uma recidiva loco-regional ou morte por cancro. sobrevida livre de recorrência distante (DRFS) foi definido como o tempo de uma cirurgia até a ocorrência de uma recidiva distante ou de morte por cancro.

Com base na distribuição enviesada dos dados de cada um dos marcadores individuais de expressão, a expressão mediana foi usado para dividir os pacientes em grupos de alto expressão (acima da mediana) e baixa expressão (abaixo da média). Os quatro marcadores foram então combinadas em uma nova variável, com base no número de marcadores que mostram expressão nuclear alta, resultando no seguinte grupo: mais baixo (grupo 1), uma alta (grupo 2), 2 alta (grupo 3), três elevado (grupo 4) e todos alta (grupo 5). análises de risco proporcional uni e multivariada de Cox foram realizadas utilizando os números de grupo como uma variável categórica, usando grupo 1 (mais baixo) como grupo de referência. Com base nestes resultados, decidimos combinar grupos de pacientes 2, 3 e 4 em um grupo de pacientes; todas as outras análises estatísticas foram realizadas utilizando-se três grupos de pacientes. Além das análises de risco proporcional de Cox, tendência análises foram realizadas utilizando os números de grupo como variáveis ​​contínuas para avaliar a influência dos marcadores combinados sobre a sobrevida do paciente ea recorrência do tumor. Resultantes taxas de risco (HR) representam o HR para cada unidade de aumento (aumento do número de grupo). curvas de incidência cumulativa foram feitas para DFS, LRRFS e DRFS, representando riscos concorrentes [32]. As curvas de Kaplan-Meier foram utilizadas para visualizar as diferenças entre os três grupos de pacientes para OS. Para todas as análises estatísticas, frente e verso valores de p ≤ 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos, e os valores de p 0,05 p≤0.1 foram consideradas uma tendência

Resultados

Expressão em tumor. contra tecidos colorretais normais emparelhados

expressão nuclear de todos os marcadores individuais (EZH2, BMI1, SUZ12 e H3K27me3) em tecidos tumorais foi comparada com a expressão nuclear em tecidos colorretais normais emparelhados. Ao analisar as diferenças de expressão na coorte de estudo como um todo, apenas a expressão H3K27me3 mediana e EZH2 foram significativamente diferentes entre tumor e tecidos normais (p 0,001 e p = 0,05, respectivamente; Figura 1A). Nos tumores individuais, no entanto, todos os marcadores mostrou diferenças marcantes na expressão em comparação com os seus homólogos normais (Figura 1B). As análises de sobrevivência baseado em abaixo- ou acima da média expressão nos tecidos normais não apresentaram diferenças na sobrevida do paciente ou de reincidência do tumor (dados não mostrados).

(A) indicadas são diferenças na expressão nuclear, medido como a percentagem de núcleos corados positivamente, entre tecidos normais e de tumor (n = 47). Boxplots mostram a mediana e o intervalo de expressão de cada um dos marcadores individuais em condições normais (N) e amostras de tumor (T). As percentagens de núcleos positivos medianos são dados para cada um dos marcadores. P-valores representam diferenças estatísticas entre amostras normais e tumorais, calculados usando o teste de Wilcoxon. (B) Os histogramas mostram a diferença na expressão entre tumor e tecidos normais emparelhadas (eixo dos y) para cada um dos pacientes individuais (eixo-X). As diferenças de expressão foram calculados como se segue: = diferença expressão expressão em tecido de tumor – expressão em tecido normal. Os valores negativos indicam maior expressão em tecidos normais, os valores positivos indicam uma maior expressão em tecidos tumorais.

analisa marcador individual em tecidos tumorais

Exemplos de identificação de núcleos de células de tumor positivas e negativas para cada um dos marcadores individuais por o sistema Ariol são mostrados na Figura 2. em primeiro lugar, se analisou a expressão de modificação da histona H3K27me3 foi correlacionada com a expressão das proteínas individuais PCG. A expressão nuclear (percentagem de núcleos positivos) de H3K27me3 foi de facto positivamente correlacionada com a expressão de EZH2 (p 0,001), BMI1 (p 0,001) e SUZ12 (p = 0,05). Não houve correlação entre a expressão dos marcadores individuais e estágio do tumor TNM. Para as análises de sobrevivência, os pacientes foram divididos em grupos de baixa e elevada expressão com base na expressão mediana de cada um dos marcadores individuais, como dada na Figura 1A. Na análise de sobrevivência de marcadores individuais, BMI1 mostraram correlações fortes para a sobrevida do paciente (OS e DFS) e recorrência tumoral (LRRFS e DRFS) em ambas as análises univariada e multivariada (Tabela 2). EZH2 e H3K27me3 mostrou correlações significativas apenas para DFS. Para todos os três marcadores (BMI1, EZH2 e H3K27me3), alta expressão foi associada com uma melhor sobrevida do paciente em comparação com os pacientes que apresentam baixa expressão, com valores de p para DFS de p = 0,07 (BMI1), p = 0,04 (EZH2) e p = 0,06 (H3K27me3). SUZ12 não mostraram diferenças na sobrevida do paciente ou recorrência do tumor com base em baixa ou alta expressão do marcador em tecidos tumorais.

A sobreposição trainer sistema Ariol mostra correta identificação do positivo (indicado por pontos amarelos) e negativo ( pontos azuis) núcleos em núcleos tumorais. lâminas TMA foram escaneados usando uma ampliação de 20x. Mostrado para todos os marcadores são núcleos de tumor coradas positivamente (

linha superior

) e núcleos tumorais negativas (

linha de fundo

). O sistema Ariol foi treinado para identificar as células positivas e negativas para cada marcador individualmente.

marcadores Combinadas

A hipótese que combina múltiplos marcadores resultaria em melhor estratificação dos pacientes. Portanto, foi realizada análise estatística sobre as combinações de enzimas de modificação de histonas. Estas análises mostraram que, de fato combinam múltiplos marcadores resultou em diferenças estatisticamente significativas entre os grupos de pacientes e taxas de risco mais pronunciadas, indicando um efeito mais pronunciado na sobrevida dos pacientes. A combinação de enzimas modificadoras de histonas EZH2 e BMI1 apresentaram diferenças significativas tanto para a sobrevida dos pacientes e sobrevida livre de recidiva, com p = 0,02 (HR = 0,72; IC 95% 0,54-0,94) para DFS e p = 0,012 (HR = 0,71; 95% CI 0,54-0,92) para LRRFS em análises multivariadas. Combinando EZH2 e SUZ12 mostrou uma tendência para o DFS em análise multivariada, com p = 0,08 (HR = 0,77; IC 95% 0,57-1,04). A combinação de BMI1 e SUZ12 mostrou diferenças significativas para a sobrevivência do paciente, com p = 0,02 (HR = 0,76; IC 95% 0,61-0,96) para a sobrevida global e p = 0,05 (HR = 0,73; IC 95% 0,54-1,00).

uma vez que as três proteínas PCG agir em conjunto em complexos multi-protéicos para regular a expressão H3K27me3, temos a hipótese de que a combinação de todos os marcadores (BMI1, EZH2, SUZ12 e H3K27me3) em uma variável resultaria em ainda melhor estratificação dos pacientes. Os pacientes foram divididos em cinco grupos com base no número de marcadores que mostram elevada expressão nuclear. Isto resultou nos seguintes grupos de doentes: mais baixo (grupo 1), uma alta (grupo 2), duas elevada (grupo 3), três elevado (grupo 4) e todos alta (grupo 5). As características dos pacientes dos 5 grupos de pacientes foram comparáveis ​​aos do estudo de coorte (Tabela S1). tendência análises multivariadas dos marcadores combinados, utilizando os números de grupos de pacientes como variáveis ​​contínuas, mostrou relações globais de perigo de 0,79-0,88 para cada marcador adicional que mostra a expressão nuclear alta tanto em análise univariada e multivariada, indicando melhor sobrevida do paciente e menores chances de recorrência do tumor para cada marcador adicional que mostra a expressão elevada (Figura 3A). Quando os números do grupo de pacientes foram inseridos como variáveis ​​categóricas, foi observada uma tendência semelhante (Figuras 3B e 3C). Geralmente, as taxas de risco para OS diminuiu com o aumento do número de grupo, indicando uma melhor sobrevida do paciente quando mais marcadores foram altamente expresso em comparação com o “mais baixo” grupo de expressão (grupo 1). Os pacientes com elevada expressão de todos os marcadores, o “mais alto” grupo (grupo 5), mostrou a melhor sobrevivência global (p = 0,01, HR = 0,42, IC de 95% 0,21-0,84) em comparação com o grupo de referência 1, o qual mostrou sobrevivência mais curto. Grupos 2, 3 e 4 apresentaram índices semelhantes de risco (Figuras 3B e 3C), que também se reflectiu nas curvas de sobrevida de Kaplan-Meier que funcionam próximas umas das outras, em comparação com as curvas de sobrevivência dos grupos 1 e 5. Portanto, decidimos combinar os três grupos de pacientes 2,3 e 4 em um grupo, resultando em três grupos de pacientes (grupo 1, grupos 2-4 e do grupo 5). As curvas de Kaplan-Meier e parcelas de incidência cumulativa mostrou diferenças significativas entre os três grupos de pacientes resultantes para OS, DFS, LRRFS e uma tendência para DRFS, que também se refletiram nas taxas de sobrevida em 5 anos (Figura 4). A melhor sobrevida do paciente e mais longos períodos livres de recorrência foram observados para os pacientes com elevada expressão de todos os quatro marcadores ( “mais alto”, grupo 5) nas amostras de tumor, com taxas de sobrevida em 5 anos de 77% para o sistema operacional, 83% para DFS e DRFS, e 86% para SLRL. Os pacientes em grupos combinados 2-4 mostrou um menor OS, DFS e SLRL, com taxas de 5 anos de sobrevivência de 67% para OS e DFS, 69% para SLRL e 72% para DRFS. Os pacientes do “mais baixo” (grupo 1) mostrou significativamente menor OS, DFS e SLRL em comparação com qualquer um dos outros grupos de pacientes, com taxas de sobrevida em 5 anos de 43% para OS e SLRL, 49% para DFS e 55% para DRFS. Tomados em conjunto, as taxas de sobrevida em 5 anos foram menores quando mais marcadores apresentaram baixa expressão. As taxas de risco, tanto multivariada uni e também refletiram estes resultados (Tabela 3): Grupo 5 apresenta a menor taxa de risco em relação ao grupo de referência 1 (por exemplo, multivariada HR = 0,23 (0,08-0,67) para DFS). Isto indica um menor risco de um evento (morte do paciente ou de reincidência do tumor loco-regional) para os pacientes do “mais alto” do grupo para OS, DFS e SLRL. Para DRFS, resultados estatisticamente significativos foram observadas nas análises uni

Os grupos de pacientes foram feitas com base no número de marcadores que mostram elevada expressão:. Mais baixo (grupo 1), uma alta (grupo 2), dois alto ( grupo 3), três elevado (grupo 4) e todos alta (grupo 5). (A) uni e multivariada tendência de regressão de Cox análises foram realizadas com os grupos marcadores combinados como variáveis ​​contínuas. taxas de risco por aumento unitário de cada um dos grupos de pacientes foram plotados (B) e listados (C) tanto para a tendência de regressão de Cox univariada e multivariada usando os grupos marcadores combinados como variáveis ​​categóricas. O número de pacientes nos grupos de pacientes individuais foram os seguintes: Grupo 1 (n = 28), grupo 2 (n = 59), grupo 3 (n = 55), grupo 4 (n = 74) e Grupo 5 (n = 31) .

marcador Combinado (EZH2, BMI1, SUZ12 e H3K27me3) grupos de expressões foram divididos em três grupos de pacientes: grupo 1, grupos 2-4 e grupo 5. os números de pacientes nos grupos de pacientes individuais foram: grupo 1 (n = 28), grupo 2 (n = 59), grupo 3 (n = 55), grupo 4 (n = 74) e grupo 5 (n = 31). As curvas de Kaplan-Meier foram feitas para a sobrevida global (A) e as curvas de incidência cumulativa são mostrados para a sobrevivência livre de doença (B), a sobrevida livre de recidiva loco-regional (C) e sobrevida livre de recorrência à distância (D). as taxas de sobrevivência de 5 anos são dadas para cada grupo de doentes. Tabelas abaixo as curvas indicam os números em risco (#) por grupo para os diferentes pontos de tempo.

Discussão

Além de mutações genéticas, padrões de expressão aberrante de epigenética reguladores têm sido reconhecidos como eventos cruciais no processo tumorigénico, resultando em alterações marcantes na expressão gênica. Alterações na expressão destes reguladores epigenéticos incluem metiltransferases de DNA e consequentes mudanças nos perfis de metilação do DNA e enzimas modificadoras de histonas e alterações resultantes em suas modificações de histonas correspondentes. Neste estudo, foi investigada a expressão de três proteínas PCG (EZH2, BMI1 e SUZ12) e modificação da histona associado H3K27me3 em tecidos de cancro colorrectal. expressão aberrante de cada uma destas enzimas modificadoras de histonas, e de modificação da histona H3K27me3, foi indicado para contribuir para a tumorigénese em vários tipos de cancro e tem sido correlacionada com o resultado dos pacientes [11] – [24]. Estudos na literatura mostram resultados conflitantes sobre o valor prognóstico das proteínas do grupo Polycomb no cancro colorectal. Por exemplo, a alta expressão de EZH2 tem sido associada com mau prognóstico em uma série de pacientes com câncer colorretal por Wang

et al

. [33], ao passo que a alta expressão de EZH2 foi encontrado para ser associado com uma melhor sobrevida livre de recidiva em pacientes com cancro do cólon (mas não em pacientes com câncer retal) por Fluge

et al

. [34]. Além disso, a alta expressão de BMI1 correlacionou-se com bom prognóstico no câncer de mama em um estudo realizado por Pietersen

et al

. [35], enquanto que alta BMI1 foi associada com mau prognóstico no câncer de cólon em um estudo realizado por Du

et al

. [36]. Em nossa coorte de estudo, dados de sobrevivência para os marcadores individuais mostraram que a alta expressão de todos os marcadores foi correlacionada com melhor sobrevida do paciente e períodos livres de recorrência mais longos em comparação com pacientes que apresentam baixa expressão. Os resultados encontrados neste estudo correspondem às nossas descobertas anteriores de que alta expressão de H3K27me3 foi associado a melhor sobrevida do paciente em tumores do reto [4]. Neste estudo, mostramos que a alta expressão de H3K27me3 estava realmente associado a uma melhor sobrevida dos pacientes e períodos livres de recorrência mais longos. Como mostramos que a expressão das proteínas PCG estava diretamente relacionado com a expressão de H3K27me3, esperávamos uma correlação similar de expressão das proteínas PCG com resultados clínicos, que foi, de facto confirmado pelos resultados apresentados neste manuscrito. Altos níveis de H3K27me3, por causa da expressão aberrante de proteínas PCG, pode prevenir a expressão aberrante de oncogenes, activação de sequências de retrotransposão (tal como a linha-1; [4]), e resultar em outros (epi) acontecimentos genómicos que promovem a agressividade do tumor.

Além dos marcadores individuais, combinações de proteínas PCG em correlação com o resultado do paciente têm sido estudados por diversos grupos de pesquisa. Por exemplo, a co-expressão de EZH2 e BMI1 foi relatado para ser associado com prognóstico pobre em vários cancros [37] – [39]. Em contraste, a sobre-expressão de EZH2 e BMI1 foram relatados para ter diferentes influências sobre o prognóstico do paciente no cancro da mama [35], e verificou-se não ter valor prognóstico no carcinoma urotelial da bexiga [40]. Em nossa coorte de estudo de câncer colorretal, todas as combinações de enzimas modificadoras de histonas mostrou valor prognóstico. A fim de obter mais informações sobre as vias epigenéticas com potencial valor prognóstico no câncer colorretal, foi realizada a sobrevivência multivariada usando dados de expressão combinados de várias proteínas PCG (EZH2, BMI1 e SUZ12) e seu associado modificação da histona H3K27me3. Combinando as três proteínas e sua modificação PCG histona associadas resultou em significativamente melhor estratificação dos grupos de pacientes em relação aos marcadores individuais. Nas análises marcador combinado, a melhor sobrevida do paciente e mais longos períodos livres de recorrência foram observados para os pacientes com elevada expressão de todos os quatro marcadores ( “mais alto”) nas amostras de tumor. Os pacientes do “mais baixo” grupo SO mostrou significativamente mais curtos, o DFS e SLRL em comparação com qualquer um dos outros grupos de pacientes. Os resultados do marcador análises combinadas sublinhar a cooperação destas três enzimas em complexos PCG, e, assim, proporcionar uma melhor estratificação de risco dos pacientes.

Além dos papéis de EZH2, BMI1 e SUZ12 em regulação epigenética da estrutura da cromatina e a expressão do gene, a regulação directa da função da proteína tem sido descrito para EZH2 e BMI1, incluindo a fosforilação da proteína e ubiquitinação. Um EZH2 citosólica e SUZ12-metiltransferase contendo o complexo tem sido associada a polimerização da actina, um processo importante na proliferação de células [41]. Lançadeira do EZH2 e SUZ12 contendo complexa entre os diferentes compartimentos celulares podem explicar a coloração citosólica fraca observada para EZH2 e SUZ12 além da coloração nuclear forte para estes marcadores, em comparação com a coloração nuclear estrita observada para BMI1. Outra proteína não histona metilado por EZH2 é cardíaca factor de transcrição GATA4. A metilação reduz a sua actividade de transcrição, resultando na inibição do desenvolvimento cardíaca adequada [42]. Estes exemplos indicam que a expressão anormal dessas proteínas PCG influências processos fundamentais, tais como a transcrição do gene e a proliferação de células, promovendo a transformação de células normais em células tumorais.

Em conclusão, mostrámos que a expressão combinada de proteínas PCG EZH2, BMI1 e SUZ12 e sua modificação da histona associado H3K27me3 tem valor prognóstico em nossa coorte estudo de câncer colorretal. expressão do marcador combinada resultou em melhor estratificação dos pacientes em comparação com os marcadores individuais e, portanto, fornece mais detalhes sobre as funções destas proteínas epigenéticas e -modifications no cancro colorectal. Outras combinações de mecanismos epigenéticos devem ser investigadas em câncer colorretal para desvendar ainda mais a biologia subjacente em tumores individuais. Isto irá avançar na busca de novos biomarcadores para ser usado em um ambiente clínico, a fim de classificar melhor os pacientes para tratamento.

Informações de Apoio

Tabela S1.

características dos pacientes de todos os grupos de pacientes utilizados em análises combinadas do marcador. As características dos pacientes são mostradas para todos os grupos de pacientes como os usados ​​no marcador de análises combinadas. Os grupos de pacientes apresentam características comparáveis ​​de pacientes para o estudo de coorte completa de 247 pacientes (Tabela 1). Os valores de p representa o teste de Jonckheere-Terpstra utilizado para testar se as amostras vieram da mesma distribuição. Para a variável “tamanho do tumor”, um one-way ANOVA foi realizada para testar as diferenças estatísticas entre os grupos de pacientes

doi:. 10.1371 /journal.pone.0108265.s001

(DOC)

Reconhecimentos

Nós gostaríamos de agradecer a CM Janssen por nos fornecer as seções tissue microarray usado para imuno-histoquímica.