Abstract

Apenas um pequeno número de medicamentos promissores como alvo o câncer de pâncreas, que é a quarta principal causa de mortes por câncer com uma sobrevida de menos de 5% em 5 anos. O nosso objectivo é o de desenvolver um novo agente bioterapêutico em que uma proteína lisossómica (saposina C, SAPC) e um fosfolípido (dioleoylphosphatidylserine, DOPS) são montados em nanovesulas (SAPC-DOPS) para o tratamento do cancro pancreático. Uma característica distintiva de nanovesulas SAPC-DOPS é a sua elevada afinidade para a fosfatidilserina (PS) microdomínios ricas, que são anormalmente expostas na superfície da membrana de células de tumor pancreático humano. Para avaliar o papel do PS célula externa,

in vitro

ensaios foram usadas para correlacionar exposição PS eo efeito citotóxico do SAPC-DOPS em tumores humanos e células pancreáticas não tumorigénica. Em seguida, xenotransplantes de tumor pancreático (modelos ortotópicos e subcutâneas) foram utilizados para a segmentação do tumor e os estudos de eficácia terapêutica com tratamento SAPC-DOPS sistêmica. Observamos que os nanovesículas seletivamente matou as células cancerosas pancreáticas humanas

in vitro

por induzir a morte por apoptose, enquanto que as células não transformadas permaneceram inalterados. Este

In vitro

efeito citotóxico correlacionado com o nível de exposição de superfície de PS sobre as células tumorais. Usando xenotransplantes, animais tratados com SAPC-DOPS mostrou benefícios de sobrevivência claras e seus tumores diminuíram ou desapareceram. Além disso, usando um método de rastreamento duplo em ratos vivos, mostramos que os nanovesículas foram especificamente orientadas para ortotopicamente-implantado, tumores pancreáticos bioluminescentes. Estes dados sugerem que o PS fosfolípido ácida é um biomarcador para o cancro do pâncreas, que pode ser eficazmente alvo para a terapia utilizando nanovesulas SAPC-DOPS cancerosas-selectiva. Este estudo fornece evidências convincentes em apoio do desenvolvimento de uma nova abordagem terapêutica para o cancro do pâncreas

Citation:. Chu Z, Abu-Baker S, Palascak MB, Ahmad SA, Franco RS, Qi X (2013) Segmentação e citotoxicidade de SAPC-DOPS nanovesículas no cancro do pâncreas. PLoS ONE 8 (10): e75507. doi: 10.1371 /journal.pone.0075507

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de maio de 2013; Aceito: 14 de agosto de 2013; Publicação: 04 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo NIH /NCI Grants Número 1R01CA158372-01 (Qi), 1R43CA117283-01 (de Qi e Xu), e do Projeto New Drug Estado Key Grant Número 009ZX09102-205 (Qi). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores declararam as seguintes participações: Xiaoyang Qi no listado como um inventor sobre a patente para a tecnologia (SAPC-DOPS), que é o tema desta pesquisa. Coerentes com as políticas Hospital Medical Center atuais Infantil de Cincinnati, o desenvolvimento e comercialização desta tecnologia foi licenciada para Bexion Pharmaceuticals, LLC, em que o Dr. Qi detém um menor ( 5%) participação acionária. Dr. Qi é um inventor de investigação científica que se encontra em fase pré-clínica para Bexion Pharmaceuticals. Neste momento, Bexion Pharmaceuticals não oferece quaisquer tratamentos negociáveis ​​ou drogas. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de pâncreas é a quarta principal causa de mortes por câncer, com uma sobrevida em 5 anos de menos do que 5% [1], [2], [3]. Ele é geralmente assintomática nas fases iniciais, enquanto que frequentemente invadindo linfonodos regionais e fígado, e menos frequentemente os pulmões e órgãos viscerais. estratégias multi-modais atuais, incluindo cirurgia, quimioterapia e radioterapia, não conseguiram melhorar a sobrevivência a longo prazo. O padrão actual de tratamento, o análogo de nucleósido gemcitabina [4], prolonga a sobrevivência de apenas vários meses. Apesar dos esforços exaustivos para mapear as alterações genéticas associadas com o crescimento do câncer de pâncreas, alguns alvos de medicamentos promissores têm sido relatados, e novas, tratamentos eficazes são urgentemente necessários. estratégias terapêuticas experimentais incluem inibidores de moléculas pequenas e grandes vias de oncogénicos, agentes anti-angiogénicos, a vacinação /imunoterapia, terapia de genes, e muitos outros, mas não há terapias claramente superiores têm surgido.

Nas últimas duas décadas, celular membranas tornaram-se alvos para drogas anti-câncer. Várias linhas de evidência sugeriram uma ligação entre anomalias da membrana celular e a indução mediada por ceramida de apoptose em tumores [5], [6], [7], [8], [9]. Com base nestas observações, os agentes que interferem com as membranas celulares têm sido desenvolvidos para modular a organização da membrana, fluidez, metabolismo, e a transdução de sinal [10], [11], [12]. Pouco se sabe, no entanto, das vias de sinalização subjacentes impactados por agentes anti-neoplásicos direcionados à membrana.

Temos vindo a trabalhar para desenvolver uma nova droga biotherapeutic que podem alvejar seletivamente a membrana celular dos tumores pancreáticos e efetivamente destruir células pancreáticas malignas sem prejudicar os tecidos e as células normais. Este agente é composto por dois componentes purificados naturais celulares – uma pequena proteína natural (saposina C, SAPC) e um lípido natural (dioleoylphosphatidylserine, DOPS) – que se montam em nanovesulas cancerosas-selectivo (SAPC-DOPS). SAPC é uma pequena glicoproteína não enzimática presente em todos os tecidos normais que actua como um activador biológico de enzimas lisossomais [13]. A organização funcional de SAPC inclui um domínio fusogénico membrana e uma região para a activação de enzimas lisossomais [14], [15]. O

N

glicosilação -Conectado não é essencial para a atividade SAPC [16], [17]. SAPC aumenta a degradação da glucosilceramida, esfingomielina, ceramida e galactosilceramida para através do ácido β-glucosidase, esfingomielinase ácida e ácido β-galacotsylceramidase, respectivamente [13], [18], [19]. Em pacientes com doença de depósito lisossômico, SAPC acumula junto com glicoesfingolipídios em macrófagos [20] e parece que SAPC excessiva e lipídios pode ser tóxico para estas células.

A propriedade geral da saposinas é a sua actividade de ligação membrana lipídica [ ,,,0],21], uma vez que desempenham um papel importante no transporte de lípidos [22], a montagem microdomínio lípido [23], e reorganização das membranas biológicas [24], [25], [26]. SAPC preferencialmente, interage com os fosfolípidos carregados negativamente, tais como insaturados (DOPS), a pH ácido [15], [21]. Esta interacção é necessária para a activação de enzimas lisossomais SAPC.

a hipótese de que por causa de fosfatidilserina (PS) é relativamente abundante na superfície das células cancerosas e dos tecidos [27], [28], que iria proporcionar um tumor- meta específica para SAPC. Em comparação com células não transformadas, as células neoplásicas são hipermetabólico e, assim, produzir quantidades significativas de dióxido de ácido e de carbono (CO

2) como subprodutos da glicólise anaeróbia e a respiração aeróbica, respectivamente. Os iões hidrogénio se acumular em tecidos tumorais e, como resultado, o pH extracelular significativo nos tumores sólidos é inferior (pH ~ 6) do que em tecidos normais (pH ~ 7) [29], [30]. As células cancerosas também exibir outras propriedades únicas, tais como alterações generalizadas membrana [31], [32], [33] e “leakiness” de enzimas lisossomais [31]. Curiosamente, várias hidrolases lisossómicas são elevados em tecidos tumorais [34], [35]. Portanto, um microambiente ácido único com vazamento extracelular de enzimas lisossomais faz tecido tumoral um alvo ideal para SAPC [9].

Em um estudo anterior, descobrimos que SAPC-DOPS induzida apoptose em vários tipos de células de câncer, incluindo neuroblastoma, tumor da bainha do nervo periférico maligno, e de cancro da mama células, enquanto poupadores células e tecidos normais [36]. O mecanismo de indução SAPC-DOPS de apoptose foi determinada como sendo, em parte, através de elevação de ceramidas intracelulares, seguida por activação da caspase. Também foi investigada a eficácia antitumoral e biodistribuição sistémica de nanovesículas SAPC-DOPS em modelos pré-clínicos de cancro [9], [36], [37]. Descobrimos que SAPC-DOPS nanovesículas significativamente alvejado e inibiu o crescimento de xenoenxertos pré-clínicos de neuroblastoma, tumor da bainha do nervo periférico maligno, e cancro da pele e não mostrou efeitos tóxicos nos tecidos não tumorais [9], [36], [37].

no presente estudo, avaliou-se o utilitário anti-câncer do SAPC-DOPS, e seu

in vitro

e

in vivo

câncer segmentação e actividade anti-neoplásica contra humana células de câncer pancreático e xenoenxertos de tumor pancreático.

Materiais e Métodos

culturas de células

linhas de células pancreáticas Humanos (MiaPaCa-2, PANC-1, BxPC-3, Capan- 1, AsPC-1, HPAF-II, Hs766T) a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA) foram cultivadas com Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades de penicilina /ml, e 10 mg de estreptomicina /ml. epitélio ductal pancreático humano (HPDE) foi gentilmente cedido por A. Lowy (Moores UCSD Câncer Center, La Jolla, CA) e cultivadas como descrito na literatura [38]. linha pancreático humano célula cfPac1-Luc3 foi gentilmente cedido por O. Wildner (Ruhr-University Bochum, Bochum, Alemanha) [39]. Todas as células foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO

2. Sem a contaminação cruzada foi encontrada nestas células.

A preparação de proteínas e nanovesulas

SAPC foi produzido como descrito anteriormente [17], com modificações. Resumidamente, saposinas recombinantes foram expressas utilizando o sistema de pet em

E. Coli

células. As proteínas expressas foram purificadas sobre uma coluna de níquel e completamente dessalinizada com cromatografia líquida de alta eficiência C4 de fase inversa (HPLC). Após liofilização, saposina pó foi usado e a sua concentração foi determinada pelo seu peso. Todos os fosfolípidos foram adquiridos a Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Banho de ultra-sons foi utilizado para formar nanovesulas SAPC-DOPS como previamente descrito com modificações de menor importância [40]. Após a remoção do solvente sob gás de azoto, foram misturados com fosfolipidos proteínas saposina puros em 20 ul de tampão de ácido (pH 5) e rapidamente diluída 50X em volume de solução aquosa fisiológica. A mistura de proteína-lípido foi então suavemente sonicada e os dois componentes facilmente montados em nanovesulas. Os nanovesulas sonicadas pode ser utilizado depois de armazenar a 4 ° C durante pelo menos uma semana. Para armazenamento a longo prazo, as amostras liofilizadas estáveis ​​SAPC-DOPS foram preparados com um sistema de co-solvente orgânico-água. Após eliminação do solvente, secou-se DOPS foi dissolvido em álcool terc-butilo 80%. (/Ml 10 mg) e solução de sacarose SAPC foram feitas em água. DOPS e SAPC /sacarose (vol: vol = 1:0.6) mistura foi liofilizada a um bolo de pó num secador por congelação (VirTis UNITOP, O VIRTIS Co., Gardiner, Nova Iorque). Para a injecção de animais, o bolo foi re-hidratadas em salino tamponado com fosfato (PBS) para formar nanovesulas SAPC-DOPS. Esses nanovesículas mostrou o mesmo tumor-segmentação e citotoxicidade

in vitro

e

in vivo

.

Nanovesículas

SAPC-DOPS foram caracterizados e monitorado por um analisador N4 além de tamanho de partícula como anterior descrito [9], [36]. Estável nanovesulas SAPC-DOPS têm um diâmetro médio de aproximadamente 200 nm com um significativo potencial zeta a -42. SAPC liga as moléculas de lípidos e espontaneamente incorpora na bicamada lipídica dos lipossomas em cima sonicação. Após sonicação e ultracentrifugação para sedimentar SAPC-DOPS acoplado lipossomas, sem SAPC foi detectada na fracção de sobrenadante, implicando uma eficiência muito alta carga /acoplamento [9]. SAPC seco foi dissolvido em solução de PBS para o tratamento SAPC sem DOPS. DOPS sem SAPC foi preparado usando o mesmo procedimento de preparação para nanovesículas SAPC-DOPS.

Imagens ao vivo

rotulagem fluorescente de nanovesículas SAPC-DOPS.

Em algumas partes do experimento , os nanovesulas SAPC-DOPS foram fluorescentemente marcado com um corante estável e alta intensidade, CellVue® Vinho (CVM, Molecular Targeting Technology Inc., Exton, PA – Excitação max = 647 nm; emissão = 677 nm, max [9], [36 ]). CVM demonstrou utilidade em tumores subcutâneos de imagem, bem como oculto, ortotopicamente implantado, e tumores metastáticos. O destino do corante pode ser seguido nos ratos vivos usando um dispositivo de imagem de todo o animal [IVIS-200X (filtro Cy5.5), Xenogen]. Para todas as imagens, os ratinhos foram anestesiados com isoflurano suavemente e colocada sobre uma plataforma quente no dispositivo de imagem

.

Uma alíquota de CVM em etanol foi misturada com solvente de fosfolípido para a preparação do banho de ultra-sons através do procedimento descrito acima. CVM marcado nanovesulas SAPC-DOPS foram separados do fluoróforo CVM livre utilizando uma coluna de Sephadex ™ G25 (PD-10, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

bioluminescência de células tumorais pancreáticas.

para rastrear as células tumorais, foram usadas células de tumor que expressam luciferase pancreáticos humanos cfPac1-Luc3. Após a injeção de luciferina, o mesmo dispositivo de imagem ao vivo (IVIS-200X, Xenogen) foi utilizado para a visualização e localização da bioluminescência.

In vitro

Estudos

Efeito da nanovesulas sobre células tumorais SAPC-DOPS.

Três linhas de células de adenocarcinoma pancreático amplamente utilizados (MiaPaCa-2, PANC-1 e BxPC-3) e células não transformadas (HPDE) foram semeadas (10

4 /100 ul /poço) em placas de 96 poços de fundo plano de cultura de tecidos (Falcon, Becton Dickson Labware, Franklin Lakes, NJ) e cultivadas nos seus respectivos meios de crescimento durante 24 horas, após o que SAPC-DOPS (0,14 mg) ou de veículo PBS foram adicionados ao meio de cultura. Para avaliar a viabilidade celular, um padrão de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) -dye ensaio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi realizado como anteriormente descrito [9], [36] três dias após o início do tratamento. Foi realizada a avaliação microscópica das células tumorais e células HPDE.

A fim de avaliar a apoptose, MiaPaCa-2 pancreáticas células cancerosas foram tratados com SAPC-DOPS, PBS, ou DNAAS (controle positivo) e, posteriormente, avaliados com desoxinucleotidil-transferase terminal de dUTP mediada por Nick marcação terminal (TÚNEL) ensaio utilizando In Situ Cell Death Detection Kit, POD (Roche Applied Science, Alemanha), como descrito no protocolo do fabricante.

de modo a confirmar que era o montados nanovesículas SAPC-DOPS que causou a morte celular, MiaPaCa-2 pancreáticas células cancerosas e HPDE foram tratados com SAPC-DOPS, SAPC sozinho, ou DOPS sozinho. A viabilidade celular foi avaliada com um ensaio de MTT-corante.

Para determinar se a apoptose induzida por SAPC-DOPS foi mediada através da activação de caspase, proteínas a partir de células de MiaPaCa-2 nanovesulas-tratadas foram analisadas por Western blots. As células foram tratadas durante 48 horas com SAPC-DOPS, DOPS, PBS, ou estaurosporina (controlo positivo) e depois lisadas para análise de proteínas por imunotransferência utilizando NuPAGE Novex Bis-Tris Gels (4-12%), e o procedimento de electroforese por fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). A proteína foi transferida utilizando um aparelho de transferência semi-seco (FB-SDB-2020, Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) para uma membrana Hybond-ECL nitrocelulose (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Caspase-9 anti-humano e anti-actina anticorpos (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) foram utilizados para a detecção de caspases activas e actina (controlo), respectivamente.

Estas experiências foram realizadas em quadruplicado e foram dados analisados ​​por análise de variância (ANOVA). análise T-teste ou Two-way ANOVA de Tukey foram utilizados para determinar a significância estatística para experimentos com dois ou maior que dois grupos, respectivamente. As análises foram realizadas com SPSS 12.0.

Correlação entre matar efeito da exposição SAPC-DOPS e PS na superfície da célula pancreática.

A análise por citometria de fluxo com FITC A anexina V foi realizada em 8 linhas celulares (Hs766T, AsPC-1, cfPac1-Luc3, Capan-1, BxPC-3, MiaPaCa-2, HPAF-II e PANC-1) para determinar o nível de exposição de PS sobre a superfície da célula. As linhas de células foram então separadas em dois grupos: o grupo “High-PS” continha aqueles que tinham uma fluorescência média (MF) mais de 50 (unidades arbitrárias) e o grupo de “Baixa-PS” continha aqueles com um MF inferior a 50. as células foram tratadas com nanovesulas SAPC-DOPS e a percentagem de morte celular foi determinada pelo ensaio de MTT. MTT experiências foram realizadas em quadruplicado e os dados foram analisados ​​por ANOVA. Os dados apresentados são a média aritmética ± SEM.

In vivo

Estudos

declaração de ética do uso de animais.

Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Cuidado institucional animal e Uso Comitê da Universidade de Cincinnati (IACUC número de protocolo: 11-05-05-02) e do Cincinnati Children Hospital Medical Center (IACUC número de protocolo: 1E03031). Os animais foram anestesiados com isoflurano ou pentobarbital de contenção antes de injeções de células tumorais para minimizar a dor e angústia. A profundidade da anestesia foi controlada através da resposta à dor (dedo do pé ou da cauda pitada), músculo e da mandíbula flacidez, ea presença de respirações regulares. Os animais foram sacrificados quando os tumores atingiram 20% da massa corporal (ou seja, tamanho da cabeça), ulceradas ou necrosada. animais portadores de tumor foram sacrificados com dióxido de carbono quando as funções fisiológicas normais, como comer e beber, urinar e defecar foram prejudicadas. Os critérios de remoção precoce devido a complicações da cirurgia incluiu alta do local da cirurgia, perda de apetite, perda de peso e falta de noivo. critérios de remoção precoce como resultado do crescimento do tumor incluídos hemiplegia, nenhuma resposta a estímulos como ruído ou toque por um período superior a 12 horas após a administração de analgésicos, perda de peso superior a 20% com semanal pesagem, desidratação, falta de noivo, ou letargia durante mais do que 24 horas. Estes critérios foram abordadas por uma consulta com o veterinário responsável.

In vivo

modelos foram utilizados para investigar a, actividade anti-tumoral especificidade e sensibilidade melhorada citotoxicidade de nanovesículas SAPC-DOPS na segmentação do pâncreas células tumorais. Por tudo

in vivo

estudos, ratos fêmeas nu /nu atímicos (Taconic Farms, Germantown, NY, o total de 98) pesando aproximadamente 20-25 gramas foram usados. As células de tumor foram quer injectados por via subcutânea ou ortotopicamente (Figura S1, S1 Materiais). Todas as injecções foram realizadas IV na veia da cauda. Para confirmar a presença de tumores humanos pancreáticos, hematoxilina e eosina (H E) Coloração de tumores xenoenxertados foi realizada; Exemplos são mostrados na Figura S2.

avaliação da dose para a inibição do crescimento do tumor do pâncreas por SAPC-DOPS.

Os ratinhos (total de 24) foram inoculados subcutaneamente no flanco direito com uma suspensão de PANC- 1 células tumorais (10

7cells /mouse). Vinte e quatro dias após a inoculação, o tamanho do tumor foi medido utilizando paquímetros e a fórmula V = (π /6) LW

2 (V = volume, L = comprimento, W = largura) [36]. O dia seguinte (dia 1), os grupos de murganhos portadores de tumores (n = 6 /grupo) foram cada um injectados intravenosamente com SAPC-DOPS (1, 4 ou 8 mg /kg num volume de 0,2 mL de dose) ou controlo de veículo ( 0,2 ml de PBS). as medições do tamanho do tumor foram realizadas diariamente e as injecções foram continuou todos os outros dias até que os maiores tumores atingiram 2,000 milímetros

3 o tamanho (18 dias). Os ratinhos foram então sacrificados e um peso do tumor foi medido real. As análises estatísticas nesta porção do estudo foram realizadas com o software GraphPad Prism® v4. Diferenças nos pesos de tumor finais foram confirmadas por análise de variância com Dunnett múltipla Comparação Teste Post.

Avaliação da capacidade do SAPC-DOPS para direcionar PS superfície em células tumorais pancreáticas.

Para determinar se SapC- DOPS nanovesulas especificamente como alvo células tumorais pancreáticas

in vivo

, MiaPaCa-2 células (5 × 10

6 células) foram injectados por via subcutânea nos flancos dos ratos. Após 5 semanas, quando os tumores eram palpáveis, uma das seguintes era IV injectado em cada rato: marcadas fluorescentemente nanovesulas SAPC-DOPS (6 mg /kg), SAPC não-complexado e DOPS marcadas fluorescentemente, DOPS marcados fluorescentemente sozinho, ou PBS controle (5 ratinhos /grupo, o total de 20). Avaliação do

in vivo

distribuição de fluorescência foi realizada com o dispositivo de imagem live-animal. As imagens foram tiradas em intervalos de tempo múltiplos desde 5 minutos até 100 horas pós-injecção.

Para determinar o efeito de bloqueio da ligação de PS, foram usadas células de tumor pancreático cfPac1-Luc3 luciferase expressa. As células foram pré-tratadas com proteínas de ligação a PS lactadherin-C2 [41] e β2-glicoproteína [42] (0,1 mg /ml), ou deixado em meio sem tratamento como um controlo durante uma hora e, em seguida injectada subcutaneamente na parte superior do chefe de ratos pelados (total 8). imagem de bioluminescência foi realizada para visualizar as células tumorais. Com uma hora de pós-implantação, com marcação fluorescente nanovesículas SAPC-DOPS foram IV injetado, e sinal de fluorescência foi documentado usando o sistema de imagens ao vivo.

Para investigar apuramento SAPC-DOPS a partir de tecido de rato normal, marcado por fluorescência SAPC-DOPS IV foi injectada em 5 ratinhos. Os ratinhos foram então sacrificados e o fígado, baço, pulmão, coração e rins foram removidos e fotografada em 1, 12 e 24 horas após a injecção para avaliar a presença de marcado de forma fluorescente SAPC-DOPS.

Efeito do nanovesículas no crescimento do tumor pancreático SAPC-DOPS.

MiaPaCa-2 células tumorais pancreáticas (5 × 10

6 células), que nós documentados nos

in vitro

estudos eram suscetíveis a SAPC tratamento -DOPS ( 80% de morte celular), foram injectados subcutaneamente na parte superior das costas de ratinhos. O tamanho do tumor foi medido com compassos de calibre de cada 3 dias e o volume foi calculado. Quando o volume médio do tumor cresceu até -500 mm

3, os ratinhos foram injectados IV com qualquer SAPC-DOPS (6 mg /kg) ou PBS sozinho (5 ratinhos /grupo, 10 no total). As injecções foram repetidas no dia 3, 6, 12, 15, 18, 21, e 24, e as medições do tumor foram continuada até ao dia 30. o t-teste de análise ou de duas vias teste ANOVA de Tukey foram utilizados para determinar a significância estatística para as experiências com dois ou maior do que dois grupos, respectivamente. As análises foram realizadas com SPSS 12.0.

Acompanhamento da bioluminescência do tumor e SAPC-DOPS fluorescência em camundongos com tumores pancreáticos ortotópicos.

Para demonstrar como SAPC-DOPS seletivamente metas tumores pancreáticos ortotópicos, cfPac1- humana células Luc3 foram injectados no pâncreas do ratinho nu. Depois de um tumor pancreático ortotópico foi detectada usando imagens ao vivo no dia 6, marcado por fluorescência nanovesículas SAPC-DOPS, marcado por fluorescência SAPC, DOPS fluorescente etiquetado, ou PBS (controlo) foram injetados IV (6 ratos /grupo, o total de 24).

camundongos

Survival of SAPC-DOPS-tratados com tumores pancreáticos ortotopicamente implantados.

Os grupos de ratinhos (n = 6 cada, total de 12) com células de tumor pancreático ortotopicamente injetados (-luciferase expressando linha cfPac1-Luc3) confirmado por bioluminescência de imagens ao vivo foram IV injectados com várias doses (dias 6, 9, 12, 15, 19, 23, 27, 30, 34, 41) de SAPC-DOPS (6 mg /kg em 30 ul de PBS) ou de veículo controlo (PBS 30 ul). Os nanovesículas SAPC-DOPS marcados com fluorescência foram então detectados utilizando o sistema de imagem ao vivo. Os animais sobreviventes foram monitorizados até que todos os ratinhos do grupo de controlo expirou. As curvas de sobrevida foram criadas pelo método de Kaplan e Meier com o software GraphPad Prism. Os tumores bioluminescentes foram monitorados com o dispositivo de imagem ao vivo durante 23 semanas.

acompanhamento a longo prazo da bioluminescência do tumor e SAPC-DOPS fluorescência em camundongos com tumores pancreáticos ortotópicos.

-luciferase expressando cfPac1- células tumorais pancreáticas Luc3 foram ortotopicamente injetados no pâncreas mouse. Após 110 dias, a distribuição de tumores bioluminescentes foi monitorizada utilizando o dispositivo de imagiologia de animais vivos. Após a bioluminescência dissipada, marcados com fluorescência nanovesulas SAPC-DOPS foram injectados (6 mg /kg) e os ratinhos foram novamente representada por imagem.

Segmentação de tumores implantados-escondida ortotopicamente e metastáticos por nanovesulas SAPC-DOPS fluorescentemente marcado.

tumores pancreáticos ortotópicos foram gerados através da implantação de uma linha expressando a luciferase do tumor pancreático (cfPac1-Luc-3) em ratinhos. Após 6 semanas, os ratinhos foram fotografadas para identificar todos os locais de tumor. Uma vez que a bioluminescência havia se dissipado, marcado por fluorescência SAPC-DOPS foi IV injetado.

Resultados

In vitro

Estudos

Efeito do SAPC-DOPS nanovesículas em células tumorais.

Em estudos anteriores, verificou-se que a razão molar óptima de SAPC e DOPS foi 1:03-1:10 para o efeito citotóxico máximo contra células de cancro da pele e de neuroblastoma humano [36], [37 ]. Determinou-se que esta gama molar de SAPC: rácio DOPS também teve efeito significativo na morte de células de cancro pancreático humano (MiaPaCa-2) (Figura 1A). Quando as três linhas de células de adenocarcinoma pancreático e as células foram tratadas com HPDE SAPC-DOPS, a maior parte das células tumorais morreram, enquanto que as células permaneceram viáveis ​​HPDE (Figura 1B). inspecção microscópica de células tratadas com SAPC-DOPS indicaram que as células tumorais apresentaram características morfológicas consistentes com a morte apoptótica, enquanto que as células não transformadas HPDE parecia normal (Figura 2). A análise revelou que TUNEL SAPC-DOPS efectivamente induzir a apoptose (Figura 1C). Ao contrário SAPC-DOPS ea DNAAS controlo positivo, o controle PBS negativo não teve efeito apoptótica. Ambos os componentes do SAPC-DOPS foram essenciais para matar células tumorais ideal. Se apenas a proteína (SAPC) ou os componentes de fosfolípidos (DOPS) foram adicionados individualmente, às células, não houve indução de apoptose e a percentagem de células apoptóticas foi comparável ao controlo de PBS (Figuras 1B e 1D). A análise Western blot revelaram que a clivagem da pré-pró-enzima caspase-9 para a forma activa ocorreu apenas nas células tratadas com SAPC-DOPS e as células tratadas com estaurosporina (Figura 1E).

(A) papel de SAPC e DOPS razão molar para a citotoxicidade nas células pancreáticas (MiaPaCa-2) câncer. (B) A morte celular (%) em células humanas do cancro do pâncreas (MiaPaCa-2, PANC-1 e BxPC-3) e controlos normais (HPDE) após exposição a SAPC-DOPS. (Dados em 1B-1D são relatados como média aritmética ± DP.) (C) Apoptose (%) em MiaPaCa-2 células de cancro do pâncreas após tratamento com qualquer SAPC-DOPS, PBS (controlo negativo), ou ADNase (controlo positivo). (D) morte celular (%) em células de cancro pancreático humano e de HPDE após exposição a SAPC-DOPS, SAPC por si só, ou DOPS sozinho. (E) Análise de mancha de Western demonstra que o tratamento de MiaPaCa-2 células de cancro do pâncreas com ambos o SAPC-DOPS e controlo positivo estaurosporina (P) resultou na clivagem da pré-caspase-9 para a caspase-9 activa, enquanto que o tratamento com DOPS, PBS , e controlo negativo (N) não causar a activação da enzima.

As células tumorais (PANC-1, Capan-1 e MiaPaCa-2 em (B), (C) e (D) , respectivamente) apresentaram características morfológicas consistentes com a morte por apoptose após o tratamento com SAPC-DOPS, enquanto as células não transformadas HPDE (a) apareceu normal.

Correlação entre o efeito de matar de SAPC-DOPS ea exposição PS no pâncreas superfície celular.

o histograma de fluorescência na Figura 3A demonstra que a nível externo PS sobre as células PANC-1 foi mais elevado do que para as células AsPC-1. A expressão de PS relativa na superfície celular de linhas celulares de tumor pancreático humano é demonstrada na Figura 3B. Entre estas linhas de células, MiaPaCa-2, HPAF-II e PANC-1 tinham mais de 50 MF e, por conseguinte, que compuseram o grupo “High-PS”. Como mostrado na Figura 3C, as células no grupo de alta PS demonstraram significativamente maior citotoxicidade em resposta a SAPC-DOPS do que as células no grupo de baixa-PS (p 0,05).

(A) do histograma de fluorescência dos níveis de PS no PANC-1 e AsPC-1 superfícies celulares medidos por anexina V-FITC. (B) A expressão diferencial PS na superfície de células de pâncreas humano de 9 linhas de células. (C) porcentagem combinada de sobrevivência celular nos dois grupos de linhas de células tratadas com SAPC-DOPS, conforme determinado pelo ensaio de MTT (p = 0,0032)

In vivo

Studies.: subcutânea pâncreas tumor Modelo

avaliação dose para a inibição do crescimento do tumor pancreático por SAPC-DOPS.

Os tamanhos dos tumores após a administração de SAPC-DOPS em doses de 4 mg /kg e 8 mg /kg a cada outro dia foram significativamente menores do que a do grupo de controlo e 1 mg /kg, grupo de tratamento (P = 0,003 e * 0,00015 **) depois de 18 dias de tratamento (Figura 4). Com base nestes dados, nós escolhemos uma dose de tratamento de 6 mg /kg para os estudos de eficácia.

PANC-1 tumores de xenoenxerto em ratinhos nus foram tratados com todos os outros dias 1, 4, ou 8 mg /kg de SAPC -DOPS, ou com controlo de PBS. Os tamanhos dos tumores com doses elevadas (4 mg /kg e 8 mg /kg) foram significativamente menores do que 1 mg /kg grupos de controlo e (p = 0,003 e * 0,00015 **, respectivamente).

Avaliação da capacidade de SAPC-DOPS para segmentar PS superfície em células de tumor pancreático.

imagens ao vivo demonstraram que marcadas fluorescentemente nanovesulas SAPC-DOPS foram rapidamente orientada para o tumor palpável no prazo de 5 minutos (dados não apresentados) e a fluorescência persistiu por mais de 4 dias (Figura 5). A fluorescência a partir da montado SAPC-DOPS nanovesulas alvo para os locais do tumor, ao passo que nenhuma fluorescência do tumor foi observada após a co-injecção de SAPC não-complexado e marcado por fluorescência DOPS, ou após a injecção de marcado de forma fluorescente DOPS sozinho ou controlo de PBS (Figuras 6A e 6B). Enquanto marcado fluorescentemente SAPC-DOPS foi notado que se acumulam no fígado cedo (2 horas após a injecção), não havia sinal de fluorescência do fígado em imagens ao vivo após 24 horas (Figura 6A). Da mesma forma, o SAPC não-complexado e DOPS marcadas fluorescentemente, e os DOPS marcados fluorescentemente sozinho, foram identificados no fígado em 0,5 hora de imagens ao vivo, mas rapidamente dissipada (Figura 6B).

Os nanovesulas foram rapidamente alvo ao tumor palpável no prazo de 5 minutos (dados não apresentados). A fluorescência persistiu durante mais de 1 (A) e 4 (B) dias. SAPC = 3,2 mg /kg, DOPS = 1,8 mg /kg, a CVM = 6 M.

heterotópico MiaPaCa-2 tumores (circulado) foram gerados por injecção subcutânea no flanco superior de ratos nus. (A) Ratinhos 1 2 foram ratinhos portadores de tumor, injectados com marcado fluorescentemente nanovesulas SAPC-DOPS; Rato 3 foi não portadores de tumor, injectados com PBS. Os murganhos 1 e 2 demonstram tanto a localização do marcador fluorescente no local do tumor. Fluorescência também localiza para o fígado por 2 horas, mas é ido por 24 horas. (B) os ratos portadores de tumor 4, 5 e 6 foram injectados com SAPC não-complexado e DOPS marcadas fluorescentemente, apenas DOPS marcadas fluorescentemente, e PBS, respectivamente. Não há nenhuma fluorescência localizada ao tumor em qualquer um destes ratinhos.