Abstract

Fundo

proteína Sim-associado (YAP) é um co-ativador de transcrição e regula a proliferação celular e apoptose. Nós investigamos o significado clínico e biológico do YAP no câncer de endométrio (EMCA).

Métodos

expressão YAP em 150 tecidos de tumor primário de pacientes com EMCA foi avaliada por imuno-histoquímica e sua associação com os dados clínico-patológico foi avaliada. As funções biológicas de YAP foram determinados em linhas celulares EMCA através knockdown /superexpressão do Yap. O papel do YAP na modulação da sensibilidade à radiação também foi investigado em células EMCA.

Resultados

Aumento YAP nuclear expressão foi significativamente associada com o grau superior, palco, invasão do espaço linfo-vascular, recorrência pós-operatória /metástase e sobrevida global nos níveis de estrogênio mediada EMCA, chamado tipo 1 câncer (p = 0,019, = 0,028, = 0,0008, = 0,046 e 0,015, respectivamente). Na análise multivariada, expressão YAP nuclear foi confirmado como um fator prognóstico independente para a sobrevida global em tipo 1 EMCA. YAP knockdown por siRNA resultou numa diminuição significativa na proliferação celular (p 0,05), o crescimento dependente de ancoragem (p = 0,015) e a migração /invasão (p 0,05), e um aumento significativo no número de células em G0 /G1 fase (p = 0,002). Por outro lado, YAP superexpressão promoveu a proliferação de células. ensaio clonogênica demonstrado radiossensibilidade melhorada em cerca de 36% em YAP células inibida.

Conclusões

Desde funções YAP como um co-ativador de transcrição, a sua localização diferencial no núcleo das células cancerosas e subsequente impacto na proliferação de células poderá ter consequências importantes no que diz respeito ao seu papel como um oncogene em EMCA. expressão YAP nuclear poderia ser útil como um indicador de prognóstico ou alvo terapêutico e prever sensibilidade à radiação em pacientes com EMCA

Citation:. tsujiura M, Mazack V, Sudol M, Kaspar HG, Nash J, Carey DJ, et al . (2014) Protein Sim-associado (YAP) Modula Características oncogênicos e radiação sensibilidade no câncer de endométrio. PLoS ONE 9 (6): e100974. doi: 10.1371 /journal.pone.0100974

editor: Hong Wanjin, Instituto de Biologia Molecular e Celular, Biopolis, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de fevereiro de 2014; Aceito: 01 de junho de 2014; Publicação: 27 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 tsujiura et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento para trabalho feito nesta publicação foi de Grant SRC-075 Fundo de Investigação Clínica, Geisinger Medical Center e da Fundação do Câncer Rice. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer endometrial (EMCA) é o quarto tipo de câncer mais comum eo câncer ginecológico mais comum em mulheres americanas, com cerca de 8200 mortes e 49500 novos casos nos Estados Unidos em 2013 [1]. Enquanto as mulheres com EMCA geralmente têm um bom prognóstico, com 81,5% de sobrevida de 5 anos (2003-2009), a taxa de incidência e morte de EMCA continuaram a aumentar, em média, 1,1% e 0,4%, respectivamente, em cada ano nos últimos 10 anos [2 ]. Os recentes aumentos na incidência de taxas de cancro do endométrio têm sido considerados em grande parte atribuída à epidemia de obesidade [3]. Apesar de melhorias nas técnicas de diagnóstico e gerenciamento peri-operatória resultaram em um aumento na detecção precoce da EMCA e prognóstico favorável, mulheres diagnosticadas com doença avançada ou recorrente têm taxas de sobrevivência muito pior e opções de tratamento adjuvante limitados. estudos de expressão gênica identificaram alguns genes que são diferencialmente expressos em EMCA, tais como

PTEN

,

KRAS

,

CTNNB1

,

PIK3CA Comprar e

FGFR2

[4], [5], [6], [7]. Na prática clínica, no entanto, algumas moléculas têm sido ensaiados como agentes terapêuticos e /ou biomarcadores de diagnóstico. Portanto, a identificação de marcadores biológicos e seus alvos a jusante é essencial para personalizar terapias e melhorar o resultado e qualidade de vida em pacientes com EMCA.

EMCA passou a ser classificados em dois tipos. Tipo 1 cancro representa aproximadamente 80% da EMCA e é caracterizado como estrogênio dependente, receptor de estrogénio (ER) e receptor de progesterona (PR) positiva com morfologia endometrioid e geralmente um prognóstico favorável [8]. Por outro lado, o câncer de tipo 2 é independente de estrogénio, ER /PR negativo, pouco diferenciado e associado com um prognóstico muito mais pobre [9]. terapia padrão para ambos os tipos inclui a remoção cirúrgica do útero, colo do útero, trompas e ovários bilaterais. Os pacientes cujos tumores demonstram alto risco características podem ainda sofrer linfadenectomia. EMCA na fase inicial com características de alto risco, tais como invasão miometrial profunda, invasão linfo-vascular espaço (Lvsi) e elevado grau está associada com um risco de recidiva de 15-25% [10]. A radioterapia adjuvante, a forma mais comum de terapia para pacientes de alto risco em estágio precoce, tem sido encontrada em vários estudos para diminuir a recorrência pélvica e vaginal 12-14%, sem terapia de 3-4% com a terapia, mas ainda sem o correspondente aumento na sobrevivência global [11], [12]. Em outras palavras, a radioterapia expõe um grande número de mulheres a toxicidade sem qualquer benefício claro da mortalidade total, especialmente a maioria dos pacientes que serão livres da doença na ausência de terapia adicional. A radioterapia também é usado para pacientes não tratados previamente com recorrência local /regional. No entanto, apesar de radioterapia, 50% dos pacientes com recidiva local acabará por morrer de sua doença [13], o que implica que estes pacientes têm tumores resistentes a radiação e pode ter beneficiado de um tratamento alternativo, como a quimioterapia. A identificação de marcadores de sensibilidade à radiação /resistência permitiria para a terapia adaptada para o regime mais eficaz e reduzir a toxicidade induzida por radiação desnecessária

.

Sim proteína-associado (YAP) foi primeiro identificada em virtude da sua capacidade de se associar com Sim e Src quinases de proteína-tirosina [14]. O

gene YAP

está localizado no cromossoma humano 11q22, codifica um co-activador transcricional e é uma das duas principais efectores a jusante da via de supressão tumoral Hipopótamo [15]. A inibição da via Hipopótamo conduz à activação YAP, localização nuclear e o aumento da actividade de genes alvo de transcrição, tal como o

CTGF

e

AREG

[16], [17]. Por outro lado, a activação da via Hippo leva a fosforilação YAP, o sequestro citoplasmático e inativação. A serina-127 para alanina YAP (S127A) mutante é uma forma constitutivamente activa que permanece no núcleo e é transcricionalmente activo. YAP regula o equilíbrio entre a proliferação celular e a apoptose [18], [19], [20], e é amplificado num certo número de doenças malignas humanas incluindo cancro da mama, do esófago, hepatocelular, ependimoma, mesotelioma maligno e meduloblastoma [21], [22] , [23], [24], [25], [26]. Além disso, a expressão YAP correlaciona-se com um mau prognóstico em vários cancros, tais como o colo-rectal, esofágico, gástrico, hepatocelular, do pulmão e do ovário [22], [27], [28], [29], [30], [31], [32],

Há também crosstalk entre YAP e hormônios esteróides. Dhananjayan et ai. demonstraram que YAP e o domínio de ligação da proteína WW-2 (LSP-2) são co-activadores de ER e PR [33], que desempenham um papel chave no ciclo menstrual normal e na etiologia de tipo 1 EMCA. Apesar de vários relatos apontam para funções oncogênicos para YAP em vários cancros humanos, a sua relevância biológica e clínica em EMCA permanece obscuro. Além disso, a sobre-expressão YAP promove radiorresistência em células de meduloblastoma através do IGF2 /via YAP /Akt [34], sugerindo YAP pode funcionar na modulação da sensibilidade à radiação /resistência. Esses achados nos pediu para investigar se YAP poderia desempenhar um papel na oncogênese e desenvolvimento de EMCA e modulação da sensibilidade à radiação.

No presente estudo, investigamos a utilidade potencial de YAP como um indicador de prognóstico e terapêutica em EMCA e a função biológica do Yap em EMCA. Além disso, avaliamos efeito YAP sobre sensibilidade à radiação. Consequentemente, nossos dados fornecem evidências de que a expressão YAP nuclear é um marcador de mau prognóstico e pode ter implicações terapêuticas para o tratamento de pacientes com EMCA.

Materiais e Métodos

Pacientes e amostras de tecido

o estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional no Geisinger Medical Center (Geisinger Medical Center IRB Protocolo # 2011-0163) e uma renúncia de consentimento foi obtido a partir do Centro IRB para realizar o estudo. Um total de 150 tecidos EMCA primários foram obtidos de pacientes que se submeteram a uma histerectomia no Geisinger Medical Center entre 2008 e 2011, incluindo 120 casos de tipo 1 EMCA e 30 casos de tipo 2 EMCA. informações demográficas e de prognóstico, incluindo a idade, índice de massa corporal (IMC), grau, palco, Lvsi e sobrevivência dados foram obtidos a partir de todas as disciplinas. classificações macroscópicas e microscópicas de tumores foram baseadas na Federação Internacional de ginecologista e obstetras do sistema (FIGO) estadiamento [35], [36].

Imunohistoquímica

embebidos em parafina amostras de tecido foram cortadas a um espessura de 5 mícrons e submetidos a coloração imuno-histoquímica da proteína YAP com o método de avidina-biotina-peroxidase. A recuperação de antígenos foi realizada por aquecimento das amostras em tampão de citrato (pH 6,0) durante 5 minutos a alta potência, em seguida, 10 minutos de potência média, usando um forno de microondas. As lâminas foram arrefecida e lavada em água destilada, e coradas utilizando o DAKO Autostainer como se segue: As lâminas foram incubadas em 3% de peróxido de hidrogénio a 5 minutos, com enxaguamento subsequente em tampão TBST. As amostras foram em seguida incubadas em anticorpo YAP (1:200, NB110-58358) de Novus Biologicals (Littleton, CO) durante 30 minutos com uma lavagem subsequente TBST e incubadas em solução de coelho Dako Envision + HRP (Dako, Carpinteria, CA) (diluído de acordo com as instruções do fabricante) durante 30 minutos. Após uma lavagem com TBST, as lâminas foram depois incubadas em solução de DAB Dako durante 10 minutos e enxaguadas de novo com tampão de TBST. As lâminas foram então contrastadas como se segue: 20 em segunda incubação de manchas de hematoxilina guelras, seguido por uma lavagem com água da torneira. Os slides foram desidratados e depois seco ao ar, e as amostras foram montadas em meio de montagem. lâminas imunocoradas foram avaliados tanto para coloração glandular nuclear e citoplasmática de YAP por um patologista ginecológica, (HK), marcando para a intensidade usando um ponto 5 (0-4) escala.

linhas celulares EMCA

Três linhas de células de tipo 1 EMCA humanos, HEC-1-a, HEC-1-b e Ishikawa, foram utilizados neste estudo. HEC-1-A (ATCC HTB112) e HEC-1-B (ATCC HTB113) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). As células Ishikawa foram fornecidos pelo Dr. Jennifer Richer (Universidade do Colorado) [37], [38], [39]. HEC-1-A foram cultivadas em meio 5A de McCoy (ATCC, Manassas, VA) suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de bovino (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), HEC-1-B em Eagle meio essencial mínimo (EMEM) (ATCC, Manassas, VA) suplementado com 10% (v /v) de FBS e Ishikawa em meio essencial mínimo (MEM) (Life Technologies, Carlsbad, CA) suplementado com aminoácidos não essenciais a 1% ( NEAA), 6 ng /ml de insulina e 5% (v /v) de FBS. Antibióticos (10 unidades /ml de penicilina e 10 ug /ml de estreptomicina), foram adicionados a todos os meios de cultura. Todas as linhas celulares foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de dióxido de carbono.

análise Western blot

As células foram lisadas em tampão Tris (10 mmol /L, pH 7,4) contendo 5 mmol /l de EDTA, 300 mmol /l de NaCl, 10% glicerol, 1% de Triton X-100, 1% desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS e um cocktail de inibidor de protease (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) e sujeitos a SDS-PAGE . Anti-YAP anticorpo (NB110-58358) foi adquirido a partir de Novus Biologicals (Littleton, CO); anti-fosfo-YAP (ser127) (# 4911) a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA); anti-NF2 (SC-331) a partir de Santa Cruz; anti-LATS2 (ab70565) e anti-GAPDH (ab9485) de Abcam (Cambridge, Reino Unido). anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano Apropriada (Anti-coelho /Mouse, GE Healthcare, Little Chalfont, UK) foram utilizados. As bandas proteicas foram visualizadas com um substrato de quimioluminescência aumentada (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) e detectado utilizando LAS-3000 (Fujifilm, Tóquio, Japão).

imunofluorescência e imagiologia

Células cultivadas foram lavadas com PBS e fixadas em 4% (w /v) de paraf ormaldeído. Depois de permeabilização com 0,2% de Triton X-100 em PBS, as células foram bloqueadas em 5% (w /v) de soro de cabra em PBS e incubadas com o anticorpo primário (Yap, 1:500) à temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de Alexa Fluor 488 cabra anti-coelho (1:500) como anticorpo secundário por 30 minutos à temperatura ambiente. Depois de ter sido montada com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) para a coloração de núcleos, as células foram examinadas utilizando um microscópio de fluorescência (Olympus IX81, Olympus, Tóquio, Japão).

Curto ARN interferente (siRNA ) de tratamento

o siRNA visando o

YAP

gene (SC-38637; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) foi utilizado para experiências de perda de função. O ARNsi de controlo (SC-37007; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), foi utilizado como um controlo negativo. Cada siRNA (37,5 nM) foi transfectado em células EMCA RNAiMAX utilizando Lipofectamina (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O knockdown de um gene alvo foi verificada por transferência de western.

proliferação celular ensaio

O número de células viáveis ​​em vários pontos de tempo após transfecção de siRNAs foram avaliados por um sal de tetrazólio solúvel em água colorimétrico ensaio (Cell contagem kit-8; Dojindo, Kumamoto, Japão). como descrito em outros lugares [40]

macio agar ensaio

Para os testes in vitro do desenvolvimento colónia independente de ancoragem, 5000 células transfectadas com siRNAs de 48 horas foram plaqueadas em 1 ml de 0,4% de agar derretido em EMEM com 10% (v /v) de FBS em placas de 6 poços coberto com 1,5 ml de 0,9% de agar derretido no mesmo meio. As placas foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de dióxido de carbono. Galvanização foi realizada em sextuplicado e uma pequena quantidade de EMEM meio completo foi cuidadosamente adicionada a cada poucos dias no topo de cada cavidade para assegurar o abastecimento nutritivas e para evitar a secagem. Após incubação durante cerca de quatro semanas, as células foram fixadas e coradas com uma solução contendo 2% de etanol e 0,03% de violeta de cristal e o número de colónias foi avaliada por dois investigadores independentes, cegos.

invasão e Ensaios de Migração

Transwell migração e ensaios de invasão foram realizados usando 24 inserções de cultura de células bem BioCoat (BD, Franklin Lakes, NJ). A superfície superior de filtros de diâmetro 6,4 mm, com poros de 8 ^ m-poros foram pré-revestidas com (ensaio de invasão) ou sem (ensaio de migração) revestimento de matriz extracelular (Matrigel). 50.000 células siARN transfectadas em meio isento de soro foram semeadas em que a câmara superior de cada molde de inserção, com meio completo adicionada à câmara inferior. Após 24 h de incubação, migraram ou células invasivas sobre a superfície inferior dos filtros foram fixadas e coradas com o kit Diferencial Quik Mancha (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), e os números de células coradas, que tinham migrado /invadiram a parte inferior do filtro foram contadas directamente por dois investigadores independentes cegos.

análise do ciclo celular

Para a análise de citometria de fluxo, as células foram tripsinizadas 72 ou 96 horas após a transfecção de siRNAs, seguido por incubação num coloração tampão (0,1% de Triton X-100, 0,2 mg /ml de RNase a, e 40 ug /ml de iodeto de propidio em PBS). As células foram analisadas quanto ao conteúdo de ADN, utilizando Beckman Coulter, Cytomics FC 500 (Brea, CA).

construções de expressão e ensaio de formação de colónias

Os plasmídeos que expressam o tipo selvagem YAP (pEGFP-C3-WT YAP) foram obtidos por clonagem da sequência codificante completa do Yap com 504 aminoácidos [41] no vector pEGFP-C3 (uma oferta de Gregory Matera e Channing Der, University of North Carolina, Chapel Hill, NC). S127A forma mutante do Yap (pEGFP-C3-S127A-YAP) foi gerado através de mutagénese dirigida ao local mediada por PCR de pEGFP-C3-WT-YAP. pEGFP-C3-WT-YAP, pEGFP-C3-S127A-YAP ou o vector vazio (pEGFP-C3-EV) como um controlo foi introduzido em células EMCA utilizando Lipofectamina LTX e Plus Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com a as instruções do fabricante. A expressão da proteína em células transfectadas YAP foi confirmada por transferência Western. Após incubação durante cerca de quatro semanas com concentrações adequadas de G418, as células foram fixadas e coradas com uma solução contendo 10% de formaldeído e 1% de violeta de cristal. A área manchada foi calculada por densitometria utilizando o software ImageJ. Condições

ensaio clonogénico e irradiação

exposição Sobrevivência após radiação foi definida como a capacidade das células para manter a sua capacidade clonogénico. Resumidamente, os números de células transfectadas com o ARNsi de controlo ou ARNsi YAP-específico durante 48 horas aumentando foram plaqueadas em placas de 6 poços. As células foram irradiadas com 0-6 Gy utilizando um acelerador linear e devolvidos para a incubadora durante várias semanas até que as células nos poços de controlo tinha formado suficientemente grandes colónias. As colónias formadas foram fixadas e coradas com uma solução contendo 10% de formaldeído e 1% de violeta de cristal e aqueles com, pelo menos, 50 células foram contadas por dois investigadores independentes cegos. O número de colónias obtidas a partir de três repetições foi calculada a média para cada condição. Estes valores médios foram corrigidos de acordo com chapeamento eficiência dos respectivos controles para calcular a sobrevivência da célula para cada dose. A equação linear quadrático foi montado para conjuntos de dados para gerar curvas de sobrevivência, e factor de intensificação de dose foi calculada em 10% fracção sobrevivente (DEF 0,1).

A análise estatística

As correlações entre nuclear /coloração citoplasmática níveis e fatores clínico-patológicos foram avaliados pelo teste t de Student, o teste do qui-quadrado ou teste de Fisher em conformidade. O Mann-Whitney

U

-teste e teste t de Student foram utilizados para comparar a diferença de comportamento biológico entre as células transfectadas e células de controlo. Para a análise de sobrevivência, as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier foram construídas para grupos baseados em preditores univariados e diferenças entre os grupos foram testadas com o teste log-rank. Para essas variáveis ​​estatisticamente significativa na análise univariada, foi utilizado o modelo de riscos proporcionais de Cox com o teste da razão de verossimilhança para posterior avaliação de análise de sobrevivência multivariada. Valor P 0,05 foi considerado significativo. As análises estatísticas foram realizadas utilizando JMP 10 (SAS Institute Inc., Cary, NC).

Resultados

expressão da proteína YAP em tecidos EMCA primários

Para determinar se YAP é expressa EMCA em humanos, a expressão de proteínas em tecidos YAP EMCA primários foi avaliada por imuno-histoquímica. micrografias representativos demonstrando a expressão YAP nuclear e citoplasmática são mostrados na Figura S1. Uma vez que a localização intracelular do Yap é geralmente considerada como importante para a sua função oncogénica [42], ambos os níveis de coloração nuclear e citoplasmática foram analisadas e pontuadas para a intensidade usando uma escala de 5 pontos (0 a 4). Os dados demográficos e níveis de coloração YAP comparando tipo 1 e 2 EMCA estão resumidos na Tabela 1. Tipo 2 EMCA tiveram maior palco, maior frequência de Lvsi e pós-operatório de metástases /recorrência e maior expressão YAP nuclear em comparação com o tipo 1 EMCA. A seguir, avaliou a correlação entre fatores clínico-patológicos e coloração YAP em tipo 1 e tipo 2 EMCA, individualmente. Como mostrado na Tabela 2, maior expressão YAP nuclear foi significativamente associada com grau superior, estágio patológico, Lvsi e pós-operatório recorrência /metástase em tipo 1 EMCA (p = 0,019, = 0,028, = 0,0008, = 0,046, respectivamente). Nenhuma associação significativa entre a expressão YAP nuclear e estas variáveis ​​foi observada no tipo 2 EMCA (Tabela S1). expressão citoplasmática de YAP não foi associada com factores clínico-patológicos em tipo 1 ou tipo 2 cancros (dados não mostrados). estimativas de sobrevivência de Kaplan-Meier mostrou que o aumento da imunorreatividade nuclear de YAP foi significativamente associada à sobrevida global pior tipo 1 câncer. (P = 0,015,-rank log de teste, a Figura 1). A análise univariada indicou estágio avançado e presença de Lvsi também se correlacionou com a sobrevivência pobre em geral (p = 0,0005 e 0,003, teste de log-rank, respectivamente, a figura S2). Não houve correlação entre a sobrevivência global ea coloração citoplasmática YAP no tipo 1 EMCA ou YAP nuclear /mancha citoplasmática no tipo 2 EMCA (Figura S3). Através de análise de riscos proporcionais de Cox de regressão multivariada que considerou palco, Lvsi e nível de YAP nuclear, apenas o nível YAP nuclear (pontuação 2/3/4 contra marcar 0/1) foi independentemente associada com a sobrevida global (p 0,021). Nossos dados demonstram que YAP nuclear está associado com pobres características de prognóstico e diminuição da sobrevida global em Tipo 1 EMCA.

imunorreatividade nuclear Aumento de YAP foi significativamente associada com pior sobrevida geral (P = 0,015, teste log-rank).

expressão da proteína YAP em linhas celulares EMCA

para obter mais conhecimentos sobre as funções biológicas do YAP em EMCA, optamos por utilizar três tipos de células 1 EMCA linhas; HEC-1-A, HEC-1-B e Ishikawa. Em primeiro lugar, avaliou os níveis de proteína de YAP e fosfo-YAP (inativo YAP) (Figura 2A). HEC-1-B demonstraram os mais altos níveis de YAP totais e níveis muito baixos de inactiva fosfo-YAP por Western blotting. Em contraste, a HEC-1-A expressa os níveis mais baixos do total YAP e os mais altos níveis de inativos fosfo-YAP. Imunofluorescência confirmada elevados níveis de YAP nuclear e citoplasmática em HEC-1-células B e baixos níveis de YAP nuclear e citoplasmática em células HEC-1-a, consistente com os resultados de western blot (Figura 2B). Portanto, foram usadas células de HEC-1-B por um ensaio de perda de função, e por outro lado as células HEC-1-A foram utilizados para um ensaio de ganho de função.

(A) Expressão do Yap e fosfo-YAP (Ser127) em três linhas de células EMCA por western blotting. (B) imunofluorescência coloração citoquímica de YAP endógena utilizando anticorpo anti-YAP (YAP: verde, DAPI: azul).

knockdown YAP em células EMCA

Para estender nossos resultados de imuno-histoquímica demonstrando uma correlação entre YAP nuclear e pobres características de prognóstico em pacientes EMCA, determinou-se os efeitos do Yap knockdown sobre a proliferação celular usando específicos YAP-siARN (siYAP) e ARNsi de controlo (siCont) em células EMCA HEC-1-B. expressão endógena da proteína YAP foi eficientemente inibidos em 72 e 96 horas após a transfecção transiente de siARN (Figura 3A). A proliferação celular foi significativamente diminuída nas células inibidas YAP em comparação com as células de controlo de 26,2% (72 horas) e 42,9% (96 horas), respectivamente (Figura 3A). Este efeito inibidor do crescimento semelhante na proliferação de células foi confirmada utilizando uma sequência alternativa YAP siRNA (dados não mostrados).

(A), a expressão da proteína inibido de YAP por YAP-específica siRNA (siYAP) foi confirmada por Western blotting tanto 72 e 96 horas após a transfecção (esquerda). O número de células viáveis ​​entre 24-96 horas após a transfecção de siYAP ou ARNsi de controlo (siCont) foi avaliada em células de HEC-1-B, utilizando o ensaio de sal de tetrazólio solúvel em água (contagem celular Kit-8) (direita). 26,2% e 42,9% de inibição da proliferação celular foram confirmados por knockdown de expressão YAP às 72 e 96 horas, respectivamente. (* P 0,05 (teste U de Mann-Whitney)). Os resultados são apresentados em médias ± desvios padrão (barras) em experiências em quadruplicado. tendências similares foram obtidos em duas outras experiências independentes. (B) O número de colónias em agar mole foi comparado entre o YAP células e as células de controlo inibido para avaliar o crescimento celular independente de ancoragem em células de HEC-1-B. Imagem representativa de colônias formadas em agar mole (esquerda). A análise quantitativa do número de colónias formadas (direita), mostrando uma redução significativa em células transfectadas siYAP. (* P 0,05 (teste U de Mann-Whitney)). Colunas e barras representam média e desvio padrão em experiências sextuplicado. tendências semelhantes foram obtidos numa outra experiência independente. (C) Transwell migração e invasão ensaio. Imagem representativa de migraram /invadiram células HEC-1-B (esquerda). A análise quantitativa do número de células que migraram /invadidos (à direita), que mostrou uma diminuição significativa em células transfectadas siYAP. (* P 0,05 (teste U de Mann-Whitney)). Colunas e barras representam média e desvio padrão em experiências em quadruplicado. tendências semelhantes foram obtidos numa outra experiência independente. (D) Fluxo de análise de citometria. Os resultados representativos da população em cada fase do ciclo celular em células EMCA HEC-1-B 72 e 96 horas após a transfecção com siCont /siYAP (esquerda). A análise quantitativa da população em cada fase (à direita). siYAP células transfectadas mostraram uma acumulação significativa de células na fase G0 /G1 e diminuições significativas em S e G2 /fases M às 72 e 96 horas (* P 0,05, ** P 0,001, teste t de Student). Colunas e barras representam média e desvio padrão em ensaios em triplicado. Tendências semelhantes foram obtidos em outro experimento independente.

Nós também determinou o papel de YAP no crescimento independente de ancoragem celular, migração e capacidade de invasão, características comumente considerados de células transformadas malignas. Em ensaios de formação de colónias em agar mole, de knockdown YAP em células HEC-1-B diminuiu a capacidade de formação de colónias em comparação com células de controlo (p = 0,015, Figura 3B). Na migração de células /ensaios de invasão, uma diminuição significativa no número de células que migraram através de membranas /invadidas não revestidos /Matrigel-revestido foi observado em células transfectadas siYAP em comparação com células transfectadas siCont (p 0,05, Figura 3C). Estas experiências demonstram que a expressão YAP está associado com a proliferação celular, crescimento independente de ancoragem e a migração /potencial invasivo nessa linha celular EMCA.

análise do ciclo celular em células EMCA

Para determinar se a inibição de crescimento induzida por YAP knockdown provocou alterações no ciclo celular, análise de citometria de fluxo foi realizada em células EMCA HEC-1-B transfectadas com ARNsi específicos-YAP e de controlo. Consistente com os resultados dos ensaios de proliferação celular, siYAP células tratadas com HEC-1-B exibiram uma significativa acumulação de células na fase G0 /G1 e diminuições significativas em S e G2 /fases M a 72 e 96 horas, em comparação com siCont células tratadas (Figura 3D). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que YAP knockdown produz parada do ciclo celular G0-G1 nesta linha celular EMCA.

superexpressão YAP em células EMCA

Com base em nossos resultados da função perda de- ensaios, a hipótese de que a sobre-expressão de YAP em células EMCA com baixos níveis de YAP endógenos iria aumentar a proliferação celular. Foi investigada a capacidade de colónias que formam após a transfecção transiente de construções que expressam YAP em células HEC-1-A, que exibiram níveis relativamente baixos de YAP e níveis elevados de fosfo-YAP (Figura 2). A sobre-expressão da GFP do tipo selvagem e YAP GFP mutante constitutivamente activo S127A YAP em células HEC-1-a foi verificada por Western blotting (Figura 4A). As células que sobre-expressam WT-YAP ou S127A-YAP produziram significativamente mais colónias em comparação com células transfectadas com o vector vazio de controlo (EV). Enquanto S127A-YAP células produzidas a maioria das colónias transfectadas, uma diferença significativa não foi observada em comparação com WT-YAP células (Figura 4B) transfectadas. Estes resultados suportam ainda um papel para YAP na proliferação de células de EMCA.

(A), a expressão endógena de YAP (aproximadamente 65 kDa) e de expressão exógena da proteína YAP marcado com GFP (cerca de 92 kDa no total) em HEC células -1-a transfectadas com o tipo selvagem YAP (WT-YAP) e S127A mutante YAP (S127A-YAP). (B) Imagem representativa de ensaio de formação de colónias (esquerda). As células foram transitoriamente transfectadas com vector vazio (EV) /WT-YAP /S127A-YAP e seleccionado com concentrações adequadas de G418 durante quatro semanas. As colónias resistentes a drogas formadas pelas células YAP-transfectadas foram significativamente numerosos comparadas com o controlo (teste U de Mann-Whitney). Colunas e barras representam média e desvio padrão em experiências em quadruplicado. Tendências semelhantes foram obtidos em outro experimento independente.

Papel do YAP na modulação da sensibilidade à radiação

Dada a importância da radioterapia no tratamento EMCA e os dados que implicam YAP na modulação da radiação recentemente publicado sensibilidade de células de meduloblastoma, nós próxima determinado o efeito do Yap em sensibilidade à radiação em células EMCA usando um ensaio de sobrevivência clonogénica. Knockdown de expressão YAP por siARN redução da sobrevivência clonogénica em células HEC-1-B, o que resulta em um aumento na sensibilidade à radiação com um DEF 0,1 de 1,36 (Figura 5). Especificamente, a morte celular de 90% por exposição à radiação em células transfectadas siYAP necessária 3,48 Gy, enquanto que o mesmo nível de morte celular em células transfectadas siCont necessária 4,72 Gy. Por conseguinte, os nossos resultados demonstram um aumento da sensibilidade à radiação com a perda de expressão em células YAP EMCA HEC-1-B.

knockdown de expressão YAP por siARN redução da sobrevivência clonogénica em células HEC-1-B, resultando numa aumento na sensibilidade à radiação com um factor de intensificação de dose em 10% de sobrevivência (DEF 0,1) de 1,36. Os resultados são apresentados em médias ± desvios padrão (barras) em experiências em triplicado. Tendências semelhantes foram obtidos em outros três experimentos independentes.

Discussão

Nossos dados identificar as funções oncogênicos de YAP em EMCA. A via de Hippo, especialmente o regulador a montante direta, LATS1 /2, modula negativamente a atividade YAP por fosforilação de seu sítio S127. Fosforilada-YAP é segregado no citoplasma e orientada para a proteólise mediada por ubiquitina [43], [44]. Portanto, a localização subcelular de YAP foi considerada crucial na determinação das suas funções biológicas em vários tipos de cancro [42]. YAP expressão nuclear como um marcador de prognóstico pobre tem sido demonstrado em outros tipos de cancro, tais como do esófago, estômago e do ovário [22], [28], [31], [32]. Nossos estudos de imuno-histoquímica mostrou que níveis mais elevados de YAP nuclear foram associados com fatores de mau prognóstico, como o estádio avançado, grau, Lvsi, a recorrência pós-operatória /metástase e sobrevida global.