Abstract

Fundo

O câncer de próstata é uma doença comum e heterogêneo, onde receptor de sinalização (AR) andrógeno desempenha um papel fundamental no desenvolvimento e progressão. O tratamento inicial para o cancro da próstata avançado, é a supressão da sinalização de androgénio. Mais tarde, essencialmente, todos os pacientes desenvolvem numa fase independente de androgénio, que não responde ao tratamento anti hormonal. Assim, estratégias alternativas de segmentação novos mecanismos moleculares são necessárias. β-TRCP é uma ligase E3 que tem como alvo vários substratos essencial para muitos aspectos da tumorigénese.

Metodologia /Principais Achados

Aqui nós mostramos que a depleção de β-TRCP suprime o câncer de próstata e identificar um crescimento relevante mecanismo de controlo. shRNA alvo contra β-TRCP reduziu o crescimento de células de câncer de próstata e cooperou com a ablação do andrógeno

in vitro

e

in vivo

. Descobrimos que a inibição β-TRCP leva à sobre-regulação do receptor de hidrocarboneto de arilo (AHR) mediando o efeito terapêutico. Este fenómeno poderia ser independente do ligando, como o ligando AhR 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD) não alterou o crescimento de células de cancro da próstata. Detectamos expressão AhR alta e ativação em células basais e células epiteliais atróficas de câncer de rolamento próstatas humanas. Ahr expressão e activação, é também significativamente mais elevada em células tumorais em relação ao epitélio glandular benigno.

Conclusões /Significado

Juntamente estas observações sugerem que a activação AhR pode ser um mecanismo de cancro na próstata neutralizar. Mantemos que a combinação de inibição β-TRCP com ablação de androgénios poderia beneficiar pacientes com câncer avançado de próstata

Citation:. Gluschnaider U, Hidas G, Cojocaru G, Yutkin V, Ben-Nerias Y, Pikarsky E (2010) β- TRCP Inibição Reduz próstata crescimento das células cancerosas através de regulação positiva do Hidrocarboneto de Aril Receptor. PLoS ONE 5 (2): e9060. doi: 10.1371 /journal.pone.0009060

editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de outubro de 2009; Aceito: 16 de janeiro de 2010; Publicação: 05 de fevereiro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Gluschnaider et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson Fundação de Pesquisa médica, Fundação contra o Cancro da próstata – Israel ea fundação de pesquisa do cancro da próstata. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o sexto tipo de câncer mais comum no mundo e a terceira principal causa de câncer em homens. Nos países desenvolvidos, o câncer de próstata se desenvolve em um de cada nove homens com mais de 65 anos. Esta é uma doença heterogênea em termos de sua evolução clínica, mas a sinalização de andrógeno parece ser uma característica comum em seu desenvolvimento e progressão [1]. sinalização AR é conhecida para regular as células de próstata normais, benignos e cancerosos em diversos processos (por exemplo, diferenciação e proliferação). Além disso, há observações indicam que a expressão de AR é oncogénica no epitélio da próstata e promove a progressão para a independência de andrógeno [2] – [8]. O tratamento inicial de estágio avançado e cancro da próstata metastático é a supressão da produção de andrógenos pelas drogas específicas ou castração cirúrgica. Mais tarde, essencialmente, todos os pacientes desenvolvem numa fase independente de androgénio, que não responde ao tratamento anti hormonal. A última fase é sempre letal; Assim, estratégias alternativas de segmentação mecanismos moleculares novos são necessários.

O sistema ubiquitina-proteassoma é um determinante crucial de praticamente todos os processos biológicos em eucariotas. Nesta via, as proteínas são alvo para degradação por ligação covalente a ubiquitina, uma proteína pequena altamente conservada. ubiquitinação proteína envolve a acção concertada da enzima E1 de activação da ubiquitina, uma enzima de conjugação de ubiquitina E2 e uma ligase de ubiquitina-proteína E3, o último dos quais proporciona moléculas múltiplas de ubiquitina à proteína alvo [9] – [11]. Inibindo toda a proteassoma ubiquitina tem valor terapêutico no cancro (por exemplo, bortezomib, [12]). No entanto, uma vez que os inibidores de proteassoma tem efeitos pleiotrópicos, a inibição de uma única tecla E3 pode oferecer uma opção de tratamento mais específico com menos efeitos colaterais.

Beta-transducina-repetições contendo proteínas (β-TRCP) servir como o reconhecimento do substrato subunidades para o SCF

β-TRCP ligases de ubiquitina E3. Estes ligases ubiquitinar substratos fosforilados especificamente e desempenham um papel crucial na regulação da divisão celular e diversas vias de transdução de sinal, que por sua vez, é essencial para muitos aspectos de tumorigénese [13]. Existem dois genes β-TRCP em genomas de mamíferos que codificam para as duas proteínas altamente redundantes p-TrCP1 e β-TrCP2. Nos últimos anos, diversos substratos de p-TRCP envolvidos em várias vias normais e malignas foram descobertos [14] – [23]. Dois bem caracterizada

bona fide

substratos são beta-catenina e IkB. A degradação deste último liberta de NF-kB para entrar no núcleo e induzir a transcrição [11], [24] – [27]. Por outro lado, β-catenina fosforilada é, directamente reconhecido por β-TRCP e degradado pelo proteassoma [24]. Assim, β-TRCP tem efeitos sobre duas vias principais opostas oncogénicos. Enquanto o papel de β-catenina no cancro da próstata é controverso [28], [29], há evidências sugerindo que o NF-kB desempenha um papel pro-tumorigénico no cancro da próstata [30] – [32]. O efeito oposto sobre estas duas proteínas oncogénicas exemplifica a versatilidade desta ligase E3 particular. Além disso, β-TRCP está diretamente implicado em vários tipos de câncer [33] – [36], portanto, é plausível perguntar mais o seu papel no câncer de próstata

Neste trabalho, mostramos que a inibição β-TRCP. inibe o crescimento do câncer de próstata mostrando efeito aditivo com a ablação do andrógeno,

in vitro

e

in vivo

. Este efeito é largamente mediada através da ativação do receptor de hidrocarboneto aromático (AhR) como derrubar essa proteína suprime o efeito de inibição da β-TRCP.

Resultados

NF-kB Correlatos ativação com câncer de próstata Resultado dos pacientes

β-TRCP é uma ligase E3 importante conhecida por regular muitos substratos diferentes. NF-kB é um factor de transcrição bem caracterizado regulada negativamente por IkB, assim, indiretamente modulada positivamente pela β-TRCP. O envolvimento de NF-kB em cancro da próstata está bem investigada e estudos anteriores demonstraram o seu papel tumorogénicos na próstata. Há também recente indicação para o envolvimento de NF-kB na progressão do cancro da próstata independente de androgénio para a fase [37]. Para corroborar a relevância deste factor a progressão do câncer de próstata, testamos seu estado de ativação em amostras primárias de câncer de próstata humanas utilizando coloração imuno-histoquímica com anticorpos contra p65 (Figura 1A). 131 espécimes de cancro da próstata, manchado com uma única corrediça microarrays de tecido de pacientes com diferentes graus de Gleason foram analisados. 39% das amostras mostraram pelo menos alguns núcleos positivos p65 (Figura 1B). Também foram analisadas 14 metástases do cancro da próstata, dos quais 64% eram positivas (Figura 1A, B). Nós definido para avaliar a correlação entre o câncer de próstata Gleason e ativação de NF-kB. De fato, encontramos uma associação entre os dois (p = 0,014, teste exato de Fisher). Depreende-se que a coloração nuclear NF-kB foi mais forte nos pacientes com maior pontuação Gleason ou em metástases que levantam a possibilidade de que a activação de NF-kB pode ser correlacionada com o prognóstico. Para testar essa possibilidade, immunstained 80 tumores primários de p65, de pacientes que foram submetidos a prostatectomia radical e para a qual tivemos o acompanhamento clínico. 77% dos pacientes cujas amostras de tumor primário coradas negativamente para p65 nuclear, não mostrou recorrência até 8 anos de prostatectomia radical pós. Em contraste, a doença reapareceu em 65% dos pacientes positivos NF-kB (Figura 1C). Outra importante substrato β-TRCP pró-oncogênico é β-catenina. Desde a inibição β-TRCP iria aumentar a estabilidade β-catenina e promover tumorigênese, foi necessário para monitorar também correlação β-catening a evolução dos pacientes com câncer de próstata. A localização nuclear de activação β-catenina não se correlacionou com a gravidade da doença no mesmo grupo de pacientes (Figura S1). Juntos, estes resultados implicam uma vantagem clínica para a inibição da β-TRCP no cancro da próstata. No entanto, a multiplicidade de substratos de p-TRCP (37, possivelmente com mais a ser identificado) se opõe a uma análise exaustiva de todos eles, da mesma forma, e exige uma abordagem direta para estudar a utilidade de inibição β-TRCP no câncer de próstata.

seções câncer de próstata foram imunocoradas usando p65 anticorpos. fotomicrografias representativas A. de um tumor primário (esquerda) e metástases em linfonodos (direita) do mesmo paciente. B. Percentagem de casos negativos, positivos e fortemente positivos vistos em um tissue microarray a partir da pontuação de Gleason indicados (p = 0,0014, teste exato de Fisher). C. tumores de próstata primário (n = 131) foram histoquímica para p65 e avaliados para a atividade de NF-kB. Kaplan-Meier revelou uma correlação entre o estado de NF-kB e o risco de recorrência da doença. Azul, amostras fortemente coradas; , amostras fracamente manchado de vermelho; Verde, amostras coradas negativos (p = 0,02).

β-TRCP Inibição Reduz Prostate Cancer Cell Growth

A seguir, examinou o efeito de inibição da β-TRCP sobre o crescimento de células de câncer de próstata . Para este fim, construímos um doxiciclina indutível shRNA lentiviral vector de direccionamento tanto β-TrCP1 e β-TrCP2 com que transduzidas as duas linhas de células sensíveis de androgénio humano com cancro da próstata, LNCaP e LAPC4. tratamento doxiciclina das células LNCaP trasnduced resultou na batida eficiente para baixo de ambos os genes de p-TRCP (85% e 75% para β-TrCP1 e β-TrCP2, respectivamente) como determinado usando quantitativa PCR em tempo real (qRT PCR – Figura 2A). Isto foi acompanhado por estabilização IκBα tanto antes como após a estimulação de TNF, demonstrando a indução eficaz da proteína regulação negativa (Figura 2B). Para avaliar a consequência de β-TRCP knock down em células de câncer de próstata, nós monitorados células tratadas com doxiciclina e LNCaP não tratada durante nove dias e crescimento celular medido

in vitro

. A Figura 2C apresenta o crescimento celular diminuída após uma inibição β-TRCP ou de tratamento de ablação de androgénios (inferiores painéis esquerdo e direito superior, respectivamente). Além disso, a combinação de inibição β-TRCP com a ablação do andrógeno mostra um efeito aditivo (Figura 2C painel inferior direito e Figura 2D). A seguir, o crescimento celular quantificada utilizando o método de XTT e confirmou a análise morfológica (Figura 2D). Resultados semelhantes foram obtidos com células LAPC4 (Figura S2).

células LNCaP foram infectadas com um vector lentiviral tendo uma doxiciclina induzivel dependente β-TRCP shRNA. A. As células foram tratadas durante 72 horas foram medidos com 1 ug /mL de doxiciclina e os níveis de ARN de β-TrCP1 e β-TrCP2 utilizando qRT PCR. análise de mancha B. ocidental de extratos de proteínas a partir de células tratadas com TNF, doxiciclina ou MG-132 foram coradas imunologicamente com qualquer IkB ou tubulina. photomicrograph C. Representante das células tratadas como indicado e corados com hematoxilina e eosina. D. Ensaio XTT utilizada para quantificar o crescimento das células em diferentes pontos de tempo. DOX, doxiciclina; NT, sem tratamento; FCS, o meio condicionado contendo soro fetal de vitelo; CSS, o meio condicionado contendo soro empobrecido androgénio (carvão despojado de soro). As barras de erro, SD. * Significativamente diferente a partir de células não tratadas e uns com os outros, valor de p . 0,01, teste t

Para descartar shRNA off efeitos alvo, utilizamos uma construção dominante negativo descrito anteriormente β-TRCP sem o domínio F-box [33]. Esta variante estabiliza substratos β-TRCP, uma vez que se liga os alvos fosforiladas, mas falha para recrutar os componentes adicionais do complexo de SCF que são críticos para a actividade catalítica de ligase E3. Os efeitos de inibição β-TRCP usando a forma dominante negativa, foram essencialmente semelhantes aos resultados shRNA (Figura S3A e B).

β-TRCP Inibição coopera com andrógeno ablação

In Vivo

Para analisar ainda mais o efeito de inibição da β-TRCP no crescimento do tumor do câncer de próstata humana, usamos um modelo de xenotransplante. Nós injetamos células LNCaP carregando um inducible β-TRCP shRNA construir no tecido subcutâneo de 39 imunossuprimidos

Balb /c RAG1

– /- ratos do sexo masculino. 25 dos ratinhos (64%) desenvolveram tumores visíveis e mensuráveis ​​30 dias pós-injecção. Desde o desenvolvimento inicial do tumor era um tanto heterogêneo em tamanho e cinética, dividimos aleatoriamente estes 25 ratos em quatro grupos de tratamento: 1. ratos Intact sem tratamento (NT, n = 4; volume médio de tumor 123,1 ± 70,7); 2. Os camundongos que receberam tetraciclina na água de beber resultando na inibição β-TRCP (Tet, n = 5; volume médio de tumor 80,3 ± 98,2); 3. ratos castrados, resultando em ablação de androgénios (Elenco, n = 7, média de volume de tumor 121,6 ± 95,0); 4. A castração mais tetraciclina (Elenco + Tet, n = 8; volume médio de tumor 180,3 ± 143,9). Não houve diferença significativa no tamanho médio do tumor no início do tratamento entre os quatro grupos. Nós monitoramos o crescimento do tumor uma vez por semana, e sacrificou os ratos 30 dias após o tratamento inicial. ARN extraído de tumores dos murganhos tratados revelou Tet β-TRCP derrubar variando de 50% a 80% (Figura 3A). Similar aos nossos

in vitro

descobertas, inibindo a β-TRCP reduziu o crescimento do tumor com ou sem ablação de androgénios (Figura 3B). Análise de proliferação do tumor usando BrdU imunocoloração revelou que os ratos tratados com tanto ablação de androgénios e inibição β-TRCP apresentaram as menores taxas de proliferação (Figura 3C e Figura S4). supressão do crescimento do tumor não pode ser explicada através de apoptose, uma vez anti caspase-3 imunocoloração não revelaram quaisquer diferenças entre os grupos de tratamento (Figura 3D). Resultados semelhantes foram obtidos com células de cancro de próstata de rato AT2.1 transfectadas estavelmente com um transgene dominante negativo indutível β-TRCP (Figura S2B). Em conclusão, nossos resultados indicam que a inibição β-TRCP suprime o crescimento do câncer de próstata, tanto

in vitro

e

in vivo

e mostra um efeito aditivo com ablação de androgénios.

células LNCaP tendo uma tetraciclina induzida construção β-TRCP shRNA foram injectados por via subcutânea a imunossuprimidos

RAG1

– /- ratos. Os ratinhos (n≥4 em cada grupo) foram não tratadas (NT), tratada com tetraciclina na sua água de beber (Tet), castrados cirurgicamente (fundido) ou ambos (fundido + Tet) durante 30 dias. Os volumes dos tumores foram medidos semanalmente. (UMA). qRT PCR para ambas as isoformas de p-TRCP foi realizada em RNA extraído de os tumores colhidos no dia 30. cinética (B) o crescimento tumoral. As secções de tecido foram coradas para BrdU (C) ou por activação da caspase 3 (D) e as contagens de proliferação e de apoptose, respectivamente, foram determinados para cada tumor. Mostrados são a média ± desvio padrão (A) ou ± S.E.M (B, C e D) * valor de p . 0,05, ** p = 0,0002, teste t; p-valor em C refere-se a t-teste.

Hidrocarboneto de Aril Receptor (AhR) é regulada mediante β-TRCP Inibição e andrógeno ablação

Para elucidar as vias moleculares que são responsáveis para o efeito inibidor do crescimento de depleção β-TRCP em combinação com ablação de androgénios foi conduzida uma análise ampla gama de microarray. LAPC4 células infectadas com o vector lentiviral shβ-TRCP, foram ou não tratados ou tratados esquerda durante 72 horas com doxiciclina, soro carvão despojado ou ambos. amostras de cDNA foram submetidos à análise de microarranjos utilizando chips de U133 Affimetrix sondagem ~30,000 conjuntos de sondas. Em seguida, procurou identificar genes que são cooperativamente afetadas por ambos ablação de androgénios e inibição β-TRCP. Entre os genes regulados positivamente, eram potenciais genes anti inflamatórios (por exemplo ANXA1) e entre os genes específicos proeminente reprimidos foram próstata (por exemplo KLK2). No entanto, o aumento mais dramático foi a expressão do receptor de hidrocarboneto de arilo (dioxina) (AHR). Este gene foi regulada positivamente após ablação de androgénios, quer ou β-TRCP inibição e foi o gene mais altamente alterado devido ao tratamento combinado (Figura 4). Poderíamos atribuir AhR nível de regulação positiva para beta-TRCP esgotamento, uma vez que a doxiciclina por si só não alterou mRNA do receptor (Figura S5).

A. LAPC4 células infectadas com indutível β-TRCP shRNA foram tratadas durante 72 horas com o tratamento indicado, sujeita a extracção de ARN e análise de cDNA microarray (Affymetrix). Após normalização dos dados, os perfis de expressão de gene foram comparados entre o tratamento e as amostras de controlo não tratadas. mapa A. Calor dendrograma que mostra os dez mais altamente up (vermelho) e para baixo (verde) genes devido ao tratamento combinado regulado. Fold mudança refere-se às sondas de tratamento combinado valores relativamente ao controlo. Expressão de isoformas de p-TRCP é apresentada a seguir. células B. LAPC4 infectado com o mesmo vetor lentiviral e tratados conforme indicado foram submetidos a extracção de ARN e análise de qRT PCR com os iniciadores listados. CSS, soro carvão despojado; DOX, doxiciclina; As barras de erro, SD.

O AhR é um fator de transcrição ligando activado envolvido na organogénese, na desintoxicação de endo e xenobióticos e na mediação de diversas respostas tóxicas específicas do órgão de dioxinas. Este receptor pertence à helix- alça-hélice básico (bHLH) /PAS (receptor de hidrocarboneto Período Arilo espírito translocator-Single nuclear) da família de reguladores de transcrição heterodiméricos. proteínas bHLH /PAS está envolvida no controlo de diversos processos fisiológicos, tais como os ritmos circadianos, desenvolvimento de órgãos, neurogénese, o metabolismo e a resposta ao stress de hipoxia [38] – [40]. Estudos recentes revelaram uma conexão entre a via e câncer de próstata AhR tanto

in vitro

e

in vivo

, mostrando que o AhR interage e inibe a AR. Além disso, o AhR atua como uma ligase E3 da AR [41] e AhR

ratinhos TRAMP nula

mostram aumento tumorigênese prostática [42]. Usamos qRT PCR para validar a análise de arranjo de cDNA. Verificou-se que enquanto cada tratamento por si só aumentou os níveis de ARN AhR mais de 2 dobras, o tratamento combinado resultou em mais de 4 vezes na regulação positiva tanto LAPC4 (Figura 4B) e células LNCaP (Figura S6). Para testar a actividade funcional da via AhR foram medidos os níveis de ARNm do seu 1A1 do citocromo P450 alvo canónica (CYP1A1). As análises mostram que os níveis de CYP1A1 foram aumentados em correlação com os níveis de AHR em 4 grupos de tratamento (Figura 4B). Deve notar-se que esta regulação positiva ocorreu sem adição de um ligando AhR exógeno. Além do potente ligando AhR TCDD ainda mais agravado upregulation CYP1A1 (Figura 5C e dados não mostrados).

células LNCaP infectadas com um vector lentiviral indutível para shahr sozinho (A) ou em conjunto com shβ-TRCP (B) foram tratadas durante 72 horas com o crescimento celular e tratamentos indicada foi medida pelo ensaio de XTT. C. qRT PCR confirmou β-TRCP e AhR eficiente derrubar. borrões D. ocidentais que mostram a estabilização β-catenina após a inibição β-TRCP e confirmando a elevação do nível de proteína AhR ou derrubar devido a shRNAs relevantes. DOX, doxiciclina; FCS, soro fetal de vitelo; CSS, carvão despojado soro. As barras de erro, SD.

O efeito de supressão de crescimento de β-TRCP inibição é mediada através de regulação positiva do Hidrocarboneto de Aril Receptor

Para investigar o significado da ativação da via AhR seguinte β- esgotamento TRCP, primeiro infectado células LNCaP com inducible AhR shRNA. Embora o tratamento doxiciclina resultou em níveis de ARNm de Ahr reduzidas não conseguimos detectar qualquer efeito sobre o crescimento celular (Figura 5A). Em seguida nós co-infectados células LNCaP que ostentam inducible β-TRCP shRNA com o inducible vector AhR shRNA. A adição de doxiciclina ao meio de células knockdown dupla resultou em níveis de ARNm β TRCP-reduzidas, semelhante à das células de knockdown individuais; No entanto, como esperado, nestas células AhR níveis foram reduzidos em vez de aumento em ambos os mRNA e proteína níveis (Figura 5C, D). Assim, as células de knockdown duplos nos permitem testar se o efeito inibidor do crescimento de modulação β-TRCP é mediada através de regulação positiva AhR. Com efeito, nas células LNCaP knockdown duplos, depleção β-TRCP não conseguiu reduzir o crescimento de células, quer com ou sem ablação de androgénios (Figura 5B). Resultados semelhantes foram obtidos com um shRNA diferente dirigido contra a Ahr (dados não mostrados). Interessantemente, a adição de ligando exógeno potente TCDD não reduziu o crescimento celular por si só; nem tinha um efeito com qualquer um dos diferentes tratamentos (Figura S7). Isto sugere que esse efeito AhR é ligando independente. A análise Western blot confirmou estabilização β-catenina e a sobre-regulação de ARNm de Ahr mediante inibição β-TRCP (Figura 5C). Assim, os resultados knockdown duplas indicam que a maior parte do efeito da β-TRCP knockdown é mediada por regulação positiva do AhR.

AhR expressão em pacientes com cancro da próstata

Observing AhR regulação positiva sobre β-TRCP inibição em células de câncer de próstata nos levou a verificar o estado AhR em vários estágios de câncer de próstata. Para fazer face a este objectivo, foram coletadas 39 amostras de tumores de câncer de próstata primários do Centro Médico Hadassah. Fora deste grupo, 17 pacientes sofreram de recorrência da doença. Foi realizada anti coloração AhR immunohitochemical e monitorados expressão AhR citoplasmática e nuclear. Em primeiro lugar, que detectada uma elevada AHR em células basais localizadas no perímetro da glândula benigna (Figura 6A). Curiosamente, atrofia proliferativa inflamatória (PIA), considerada como uma lesão precursora para o cancro da próstata mostraram forte coloração nuclear e citoplasmática (Figura 6B). Utilizou-se uma pontuação subjetiva de 0 a 3 para quantificar a intensidade de coloração em células epiteliais normais e malignas em cada espécime. A nossa análise demonstra sobre-regulação de AHR em ambos os locais nucleares e citoplasmáticos no epitélio maligno (Figura 6C, D, P 0,001, teste de Mann-Whitney). No entanto, não observamos uma correlação entre a expressão AhR nas células tumorais e recorrência da doença (dados não mostrados).

secções de próstata foram imunocoradas com anticorpo AhR. As fotomicrografias mostram a expressão forte AHR em células basais (setas em A) e atrofia inflamatória proliferativa (B). expressão C. AhR Superior é observado nas glândulas malignas (t) em comparação com glândulas normais (N). D. normal e glândulas malignas foram marcados usando uma escala de 0-3. Valores médios ± S.E.M. são mostradas (valor-p 0,001, Mann-Whitney).

Discussão

O câncer de próstata é uma doença heterogênea que compreende muitas características genéticas e fenotípicas. Uma característica importante do cancro da próstata é a progressão para uma fase independente de androgénio (IA), após tratamento hormonal. As causas para esta transição não são totalmente compreendidos e tratamentos adjuvantes fortificantes manipulação hormonal são necessários. Um factor que é frequentemente implicado na progressão do tumor em diversos tipos de cancro é o NF-kB. Aqui podemos confirmar que o NF-kB é activado frequentemente em pacientes com cancro da próstata avançado (Figura 1). Além disso, a activação de NF-kB está correlacionada com a recorrência do cancro da próstata (Figura 1C). Um dos principais reguladores de NF-kB é a ubiquitina-ligase E3 SCF

β-TRCP, que tem como alvo IkB bem como muitos outros substratos para a ubiquitinação e degradação, [27]. p-TRCP é pensada para desempenhar um papel pro-tumorigénico em certos tipos de cancros [43]. Com base na modulação positiva observada de NF-kB, foi importante para seguir outro β-TRCP substrato, β-catenina pró-oncogénica comum, que também foi implicado no cancro da próstata [28], [29], [44]. No entanto, não foi possível detectar uma correlação entre a activação β-catenina e recorrência do câncer de próstata (Figura S1), sugerindo que os alvos apenas algumas beta-TRCP são de relevância para a progressão da doença. Para avaliar o escopo completo de efeitos beta-TRCP, partimos para inibir β-TRCP em células de câncer de próstata e acompanhar o seu efeito sobre o crescimento de células de câncer de próstata. Nosso

in vitro

e

In vivo

estudos revelaram que, após o crescimento de células de câncer de próstata inibição β-TRCP é reduzida. Também se pode detectar um efeito aditivo quando se combinam inibição β-TRCP com ablação de androgénio (Figura 2 e 3). Para elucidar os mecanismos de supressão do crescimento por inibição β-TRCP, foi realizada uma análise de matriz de cDNA e observada uma regulação positiva aditivo do AhR (Figura 4). Ahr foi anteriormente demonstrado que agem como uma ligase E3 do ar [41], nos fornecer uma possível ligação de sinalização AR. Além disso, notamos que a expressão AhR é maior após combinação ablação de androgénios e inibição β-TRCP. Por conseguinte, a hipótese de que a sobre-regulação de Ahr poderia ser mediar o efeito inibitório do crescimento de knockdown β-TRCP em células de cancro da próstata. Esta ideia foi apoiada por relatórios anteriores que demonstram um papel inibidor para a via AhR no câncer de próstata. Morrow

et ai

mostraram uma inibição do crescimento dependente do ligando a AHR em células LNCaP. Da mesma forma, outros estudos também têm implicado o receptor de andrógeno na inibição do crescimento AhR [45], [46]. Em nosso estudo, derrubando o AhR

per se

em células LNCaP não alterou o crescimento de células de câncer de próstata (Figura 5A), sugerindo que os níveis basais de AhR não exercem um efeito inibitório, a menos estimulada por ligando. Por outro lado aumentando a expressão AhR através depleção β-TRCP foi associado com a supressão do crescimento independente de ligando considerável. esgotamento AhR reverteu o efeito a supressão do crescimento de β-TRCP knockdown, mesmo sob a ablação do andrógeno, provando que AhR regulação positiva, que nós também observou em outras condições de estresse (por exemplo, atrofia, inflamação e ablação de androgénios) é responsável por o efeito inibitório β-TRCP (Figura 5). Curiosamente, a administração do ligando não afetou o crescimento celular, mesmo que ele fez regular a expressão do clássico AhR CYP1A1 alvo percurso. Estes resultados implicam um ligando e CYP1A1 via AhR independente em células cancerosas da próstata.

Chesire

et al

identificou o AhR como um alvo β-catenina putativa em células LNCaP [47]. Como mostramos que a depleção de β-TRCP estabiliza β-catenina, juntamente com a regulação positiva de Ahr (Figura 5D), é possível que a causa de Ahr elevação após a depleção β-TRCP é estabilização β-catenina.

O nosso estudos indicam um romance estratégia independente do ligando de impulsionar AhR expressão como meio de suprimir o crescimento do câncer de próstata. Esta estratégia também pode ser ecoado na história natural do câncer de próstata. Descobrimos que AhR é normalmente expressa em níveis baixos no epitélio da próstata células basais (citoplasmática e coloração nuclear, Figura 6A) e é substancialmente regulado positivamente em áreas de atrofia inflamatória proliferativa (PIA), considerado uma lesão precursora de cancro (Figura 6B). activação AHR em células basais e atrófica pode, portanto, ser visto como um mecanismo de anti-cancro. É possível que os sinais do microambiente inflamatório são responsáveis ​​por tal sinalização induzida por stress. Uma mutação no alelo de um β-TrCP1 foi identificada em um tumor da próstata humana em uma tela sistemática de mutações via Wnt [48]. No entanto essa mutação é susceptível de ter um efeito sobre a via de NF-kB como o outro alelo e possivelmente ambos os alelos β-TrCP2 eram do tipo selvagem. Da mesma forma, a nosso conhecimento, mutações ativadoras da via NF-kB foram até agora não relatados em tumores de próstata humanos. No entanto, o NF-kB conhecida por mediar a transformação maligna é regulada positivamente de forma constitutiva neste tipo de tumor através de vários mecanismos. Conclui-se que os sinais de estresse diferentes, incluindo a inflamação, a atrofia e a ablação de androgénios regular a expressão a AHR em ambas as células da próstata normais e malignas e realizar um mecanismo de protecção. Inibindo a β-TRCP em estágios avançados da doença podem ser relevantes no desenvolvimento de estratégias para melhorar a eficácia dos tratamentos de câncer de próstata.

Declaração de Materiais e Métodos

Ética

As experiências com tecidos humanos foram aprovados pelo Conselho de revisão Institucional, Hadassah-Hebrew University Medical Center. Devido à natureza retrospectiva deste estudo e de acordo com a declaração de Helsinki, os participantes não foram obtidos constantemente informado. Além disso, nosso IRB dispensou a necessidade de consentimento informado por escrito. Todos os experimentos ratos foram aprovados pelo IACUC.

negativo dominante β-TRCP (WD)

Dominante negativo β-TRCP (WD)

foi clonado utilizando E3RS excluídos do pCDNA3 plasmídeos -ee-hE3RS com os iniciadores 5 ‘para 3’ para a frente: GCGGCCGCTATGGACCC-GGCCGAG (com

NotI

local no seu 5 ‘); reversa: TTATCTGGAGATGTAGGTGT; o produto foi clonado no vector TA (Invitrogen). O último vector foi cortado com

AvrII /Asp718

, preenchido e sem corte ligado. O fragmento relevante foi cortada e inserida pFLAG-CMV ™ -2 vetor de expressão (Sigma-Aldrich) com

NotI /BamHI

. Este procedimento produziu uma construção WD faltando parte da F-box e conjugado com FLAG. O WD-FLAG foi inserido sob promotor teracycline bidirecional expressando GFP. O plasmídeo resultante foi transfectado para células de cancro de próstata de rato que expressam o AT2.1 trans-activador tetraciclina, utilizando o reagente de Fugene (Roche Applied Science). As células transfectadas foram seleccionadas usando higromicina e neomicina (Sigma-Aldrich), contendo meios para produzir um clone estável que expressa um dominante negativo β-TRCP depois da adição de tetraciclina ou doxiciclina seu derivado.

induzível β-TRCP e AhR shRNA

O shRNA 5′-humano GUGGAAUUUGUGGAACAUC 3 ‘alvo contra β-TrCP1 e β-TrCP2 foi construído no plasmídeo PTER e inserido num vector lentiviral pRRL.sin.PPT.tetO7.MCS.PRE modificado. O vector consiste de um promotor de HI, operador tet, a sequência de codificação e promotor shRNA eF1α dirigir o repressor tet fundido com eGFP. produção e infecção pelo vírus foram realizados como previamente descrito [49]. Para atingir o AhR foram utilizados os seguintes sequências shRNA: 1. 5 ‘CAGCUGAAUUAAAUAACAU 3’; 2. 5 ‘CAGACAGUAGUCUGUUAUA 3’. Ambos os quais provaram ser eficientes em derrubar o receptor (os dados apresentados representam os obter com a última sequência). shRNA expressão é induzida apenas após a administração de tetraciclina ou doxiciclina (Sigma-Aldrich). O vector foi utilizado, isoladamente, como controlo. Duplo derrubado células LNCaP foram desenhados por células shβ-TRCP co-infectar com vetores de lentivírus que transportam tanto da sequência acima descrita.

Cultura de Células

DMEM, RPMI 1640, tripsina EDTA, penicilina solução de estreptomicina, L-glutamina, soro fetal de vitelo (FCS), carvão despojado soro (CSS) foram adquiridos de Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel.