Abstract
receptores do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR) são ativados por mutação e sobre-expresso em cancros da bexiga (BCS), e inibidores de FGFR estão actualmente a ser avaliado em ensaios clínicos em doentes BC. No entanto, as células BC exibir heterogeneidade acentuada nas suas respostas a FGFR inibidores, e os mecanismos subjacentes a esta heterogeneidade biológicos não são bem definidas. Aqui utilizou-se um novo inibidor de FGFR 1-3 e ARNi para determinar os efeitos da inibição de FGFR1 ou FGFR3 em um painel de linhas celulares humanas aC. Observamos que FGFR1 foi expressa em células BC, que também expressou a “mesenquimais” marcadores ZEB1 e vimentina, enquanto a expressão de FGFR3 foi restrita ao E-cadherin- e p63-positivas “epitelial” subconjunto. A sensibilidade aos efeitos inibidores do crescimento de BGJ-398 também foi restringida às células epiteliais “BC” e que estão directamente correlacionados com os níveis de ARNm de FGFR3, mas não com a presença de mutações de activação de FGFR3. Em contraste, BGJ-398 não inibiu fortemente a proliferação mas fez bloco de invasão nas “mesenquimais” células BC in vitro. Da mesma forma, BGJ-398 não inibiu o crescimento do tumor primário, mas bloqueou a produção de células tumorais (CTCs) e a formação de nó de linfa e metástases distantes em ratinhos com células de UM-UC3 “mesenchymal” implantados ortotopicamente circulante. Juntos, nossos dados demonstram que FGFR1 e FGFR3 têm um papel em grande parte não sobrepostas na regulação invasão /metástase e proliferação “mesenquimais” distinta e subconjuntos “epiteliais” de células BC humanos. Os resultados sugerem que o fenótipo EMT tumor será um determinante importante dos efeitos biológicos dos inibidores de FGFR em pacientes
Citation: Cheng T, Roth B, Choi W, Black PC, Dinney C, McConkey DJ (2013. ) Crescimento Fator de Receptores-1 e -3 desempenham papéis relevantes na regulação do crescimento do cancro de bexiga e Metástase: Implicações para o direcionamento terapêutico. PLoS ONE 8 (2): e57284. doi: 10.1371 /journal.pone.0057284
editor: Chih-Hsin Tang, China Medical University, Taiwan
Recebido: 25 de outubro de 2012; Aceito: 21 de janeiro de 2013; Publicação: 26 de fevereiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Cheng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi financiado pelo MD Anderson bexiga SPORE (P50 CA91846), a Fundação Baker, eo MD Anderson CCSG (P30 016.672). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:.. Os autores declararam não há interesses concorrentes
Introdução
o câncer de bexiga (BC) é o quinto câncer mais comum nos países ocidentais. cancros da bexiga pode ser dividido em dois subgrupos principais que possuem patológico distinto, clínico, e características moleculares [1], [2]. A maioria dos BCs (70% -80%) são de baixa qualidade, não-invasiva músculo papilar ( “superficiais”) tumores (NMIBCs) que raramente progresso, assim que os pacientes com este tipo de cancro têm um prognóstico muito bom. Por outro lado, os pacientes com cancros da bexiga invasivo do músculo-(MIBCs) têm um prognóstico muito pior ( 50% de sobrevivência de 5 anos) [1], [2]. MIBCs frequentemente progride para se tornar metastático, e os pacientes com doença metastática têm uma taxa de sobrevivência de 5 anos sombrio de menos do que 5%. Consequentemente, a identificação dos mecanismos moleculares envolvidos na BC invasão e metástase e identificar estratégias terapêuticas que têm como alvo estes processos são muito elevadas prioridades em investigação em curso.
receptores de factores de crescimento de fibroblastos (FGFR) são alvos candidatos muito atraentes em ambos os subconjuntos de BCs [3]. Pelo menos dois terços do NMIBCs contêm mutações de activação FGFR3 que resultam na dimerização do receptor independente de ligando e transdução de sinal a jusante constitutiva [4], [5], [6], [7], e em estudos in vitro estabeleceram que os inibidores de FGFR bloquear a proliferação em células uroteliais normais que sobre-expressam estes receptores [8], [9]. Embora a frequência de mutações de activação de FGFR3 em MIBCs é muito mais baixa ( 25%), muitos dos quais expressam níveis elevados de FGFR3 e outros FGFR [3], [10], [11]. Além de promover a proliferação, FGFR têm sido implicados na regulação da epitelial-mesenquimal-a transição (EMT), invasão e crescimento independente de ancoragem em células BC [11].
BGJ-398 é um selectiva inibidor de FGFR 1, 2, e 3, que foi sintetizada utilizando uma abordagem nova química [12]. Ele apresenta IC
50 de cerca de 5 nM para a FGFR de tipo selvagem e mutante a forma mais comum de FGFR3, que é expressa em BCs (S249C) [12]. Uma caracterização inicial de efeitos inibidores do crescimento dos compostos em um painel de 8 linhas de células BC humanos revelou heterogeneidade acentuada nas respostas, onde indicadas IC
50 de 5-30 nM em metade das linhas celulares e IC
50 do mais de 1 mm na outra metade [12]. A heterogeneidade observada é consistente com os resultados obtidos utilizando um inibidor químico distinto [13], mas a base molecular para esta heterogeneidade ainda não está claro. Por conseguinte, o presente estudo iniciado para se obter uma melhor compreensão dos efeitos de inibição em células de FGRF-BC, com o objectivo de identificar os mecanismos biológicos e biomarcadores que poderiam ser usados para identificar prospectivamente tumores dependentes de FGFR. Nossos resultados revelam, papéis distintos relacionados com a EMT para FGFR3 e FGFR1 na proliferação de condução e invasão que têm implicações importantes para o desenvolvimento de terapias à base de inibidores de FGFR em pacientes.
Materiais e Métodos
Chemicals e reagentes
BGJ-398 foi generosamente fornecidos pela Novartis. Para estudos in vitro, BGJ-398 foi reconstituída em DMSO a uma concentração de estoque de 10 mmol /L e armazenado a -20 ° C. O estoque BGJ-398 foi diluído em meio imediatamente antes da utilização de modo a que a concentração de DMSO nunca excedeu 0,1%. Para estudos in vivo, BGJ-398 foi dissolvido em 10% de Tween-80.
linhas de tumor de células e condições de cultura
As linhas celulares foram obtidas a partir da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center de bexiga ESPORO Banco de Tecidos, e as suas identidades foram confirmadas por impressão digital de ADN, utilizando os protocolos de amplificação AmpFlSTR® Identifiler® (Applied Biosystems) ou AmpFlSTR® Profiler Amplificação por PCR (Applied Biosystems). Todas as linhas celulares foram mantidas como monocamadas em meio MEM de Eagle modificado suplementado com 10% de soro fetal bovino, vitaminas, piruvato de sio, L-glutamina, penicilina, estreptomicina e aminoácidos não essenciais a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO
2 incubadora .
Animais
ratinhos nus atímicos fêmea (NCr-nu) foram adquiridos a partir do National Cancer Institute. Os ratos foram alojados em condições específicas isentos de agentes patogénicos no Biotério Núcleo da Universidade do Texas M. D. Anderson Cancer Center. A instalação recebeu a aprovação da Associação Americana para Credenciamento de Laboratório Animal Care e de acordo com os regulamentos e as normas do Departamento de EUA de Saúde e Serviços Humanos, o Departamento de Agricultura dos EUA, eo NIH atuais. Os ratinhos utilizados nestas experiências foram de 6 a 8 semanas de idade.
Análises FGFR3 Mutação
O ADN foi isolado a partir de linhas de células BC utilizando um estojo de extracção de ADN genómico (Qiagen). A PCR foi realizada para amplificar exões 7 e 10, utilizando polimerase de ADN AmpliTaq Gold (Applied Biosystems) e os iniciadores 5′-CGGCAGTGGCGGTGGTG- GTG-3 ‘(sentido) e 5′-AGCACCGCCGTCTGGTT GGC-3′ (anti-sentido) para o exão 7 (23 ) e 5’-CCTCAACGCCCATGTCTTT-3 ‘(sentido) e 5′-AGGCAGCTCAGAACCTGGTA-3’ (anti-sentido) para exão 10 (adquirido da Sigma Genosys). Foram utilizadas as seguintes variáveis de ciclismo: 95 ° C durante 10 min, depois 35 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 65 ° C (exão 7) ou 58 ° C (exão 10) durante 30 s, e 72 ° C durante 30 s, seguido de uma incubação final a 72 ° C durante 10 min (23). iniciadores não incorporados foram removidos e desoxinucleótidos utilizando fosfatase alcalina de camarão e exonuclease I (EUA Biochemical). Os produtos foram analisados por Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems), e os dados foram analisados com análise de sequenciação de software 3.0 (Applied Biosystems).
Knockdown mediada por RNAi de FGFR3, FGFR1 ou bFGF
UM-UC14 e RT4 foram transfectadas com pequenos ARN interferentes (siRNAs) segmentação de FGFR3 e FGFR1 usando Oligofectamine (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. oligonucleótidos de sequências específicas () e um controlo não foram adquiridos a segmentação Ambion. O ARN total foi recolhido 48 horas após a transfecção e analisadas por RT-PCR para confirmar knockdown alvo. Em paralelo, as células transfectadas foram colhidas em siRNA de 48 horas e analisadas utilizando a proliferação celular e os ensaios de ciclo celular descrito abaixo. UM-UC3 e UM-UC13 foram transduzidas com RNAs curtos lentivirais hairpin (shRNA) (Open Biosystems). As células foram cultivadas continuamente para 5~7 dias em 10% de MEM contendo puromicina. O ARN total foi recolhido depois da selecção e analisados por RT-PCR para confirmar knockdown alvo. knockdown células estáveis foram mantidas em puromicina e usados nos ensaios de invasão câmara de Boyden de MTT e descritos abaixo.
Análises Immunoblotting
As células foram colhidas em -75% a 85% de confluência e lisadas. As concentrações de proteínas foram medidas utilizando o ensaio de Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Os lisados foram fervidas em tampão de amostra (62,5 mmol /L de Tris-HCl (pH 6,8), 10% (w v) de glicerol /, 100 mmol /l de DTT, 2,3% de SDS, 0,002% de azul de bromofenol) durante 5 minutos e arrefeceu-se em gelo durante 5 minutos. As amostras foram separadas em 8% ou 12% de gel SDS-PAGE a 110 V, em tampão de electroforese (25 mmol /L de Tris-HCl (pH 8,3), 192 mmol /l de glicina, 0,1% SDS) e, em seguida, transferidas electroforeticamente para metanol-prewetted difluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas em tampão de transferência (25 mmol /L de Tris-HCl, 192 mmol /l de glicina, metanol a 20%) durante 1 hora a 100 mV. As membranas foram incubadas em tampão de bloqueio (TBS: 10 mmol /L de Tris-HCl (pH 8,0), 150 mmol /L de NaCl, 5% de leite desnatado) durante 1 hora à temperatura ambiente, com agitação e, em seguida, enxaguada rapidamente uma vez com TBS-T (TBS contendo 0,1% de Tween-20). As membranas foram incubadas com anticorpos primários diluídos em tampão de bloqueio 1:1000 durante a noite, lavou-se e, em seguida, incubadas com os segundos anticorpos (anti-rato ou de imunoglobulina anti-coelho, peroxidase de rábano ligada ao F (ab) 2 de ratinho) diluído 1: 8000 em tampão de bloqueio durante 1 hora à temperatura ambiente enquanto se agita. proteínas imunorreactivas foram detectadas utilizando quimioluminescência aumentada (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) de acordo com as instruções do fabricante.
Gene Expression Profiling
A expressão de genes de perfis foi realizada num painel de 30 linhas celulares humanas aC usando a plataforma Illumina. Para cada linha de células, o ARNm foi gerado a partir de uma cultura de fase log único. pureza e integridade de ARN foram medidos usando um NanoDrop ND-1000 e um Agilent Bioanalyzer, e apenas RNA de alta qualidade foi utilizado para amplificação de ARNc. A biotina marcado com ARNc foi preparado utilizando o kit de amplificação de ARN Ilumina (Ambion, Inc., Austin, TX), e amplificado ARNc foi hibridado com Ilumina HT12 V4 fichas (Illumina, Inc., San Diego, CA). Depois de terem sido lavadas, as lâminas foram digitalizados com iScan (Illumina, Inc.). intensidades de sinal foram quantificados com GenomeStudio (Illumina, Inc.), e a normalização quantil foi usado para normalizar os dados. BRB ArrayTools versão 4.2 desenvolvido pelo Instituto Nacional do Câncer [14] foi usado para analisar os dados. Para observar os padrões de genes diferencialmente expressos de expressão, os valores de expressão de genes específicos, ajustado para uma média de zero, foram usados para clusters com cluster e TreeView [15].
MTT Assays
Células ( 5 × 10
3) foram plaqueadas em placas de 96 poços e deixou-se aderir durante 24 horas antes de serem incubadas com ou sem concentrações crescentes de BGJ-398 durante 48 h ou 5 dias. MTT (brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio) ensaios foram usados para medir os números de células relativos baseados na conversão de MTT em formazano em células viáveis. Cinquenta ul de MTT dissolvida em PBS (50 ug /ml) foi adicionado a cada poço e as placas foram incubadas durante 3 horas. O meio foi então removido e 100 ul de DMSO foi adicionado a cada poço, para lisar as células e solubilizar o formazan. Um leitor de micro-placa padrão foi utilizada para determinar a absorvância (600 nm). Cada ponto experimental representa dados valores médios obtidos a partir de seis repetições e cada experiência foi realizada pelo menos duas vezes.
em tempo real A análise de PCR de Transcriptase Reversa
As células foram colhidas em 75% a 85% de confluência e RNA total foi isolado usando Mirvana ™ miRNA kit de isolamento (Ambion, Ciências da vida, CA). FGFR e outros genes de interesse foram analisados por baseada em Taqman PCR em tempo real (ABI Prism 7500; Applied Biosystems). O método comparativo CT foi utilizado para determinar a expressão do gene relativo para cada gene alvo; a ciclofilina Um gene foi usado como controlo interno para normalização da quantidade de ARN amplificável. iniciadores Taqman foram adquiridos à fabricação (Applied Biosystem, CA) como se segue: E-caderina; Hs00170423_m1, TP63; Hs00978343_m1, ZEB1; Hs00232783_m1, Vimentin; Hs00185584_m1, FGFR1; Hs00915142_m1, FGFR2; Hs01552926_m1, FGFR3; Hs00179829_m1, FGFR4; Hs01106908_m1, bFGF; Hs00266645_m.
Análises do Ciclo celular
As células foram plaqueadas em placas de 6 poços e mantidas em 10% de FBS MEM durante 24 horas. As células foram então expostas a várias concentrações de BGJ-398 durante 48 horas ou cultivadas mais 24 horas (atingindo -75% a 85% de confluência) para analisar os efeitos de FGFR3 ou FGFR1 knockdown. As células foram colhidas por tripsinização e peletizadas por centrifugação. Os sedimentos foram então ressuspensos em PBS contendo iodeto de 50 ug /mL de propídio, 0,1% de Triton X-100, e citrato de sódio a 0,1%. Propídio fluorescência iodeto foi medida por células activadas por fluorescência (FL-3 canal, Becton Dickinson, Mountain View, CA), utilizando software de análise de ciclo do instrumento.
Boyden Câmara Invasão Assays
câmaras Invasão contendo membranas de tereftalato de polietileno revestido com Matrigel-8 uM poros foram adquiridos a BD Ciência num formato de placa de 24 poços. As células (2,5 x 10
5) foram libertados a partir de frascos de cultura de tecidos utilizando EDTA (1 mmol /L), centrifugadas, suspensas num meio isento de soro e colocadas nos compartimentos superior de câmaras de invasão. meio de soro fetal de bovino a trinta por cento foi colocado nos compartimentos mais baixos como quimioatractivas e invasão ensaios foram realizados durante 48 h. Cada linha de células foi plaqueada em triplicado. Para examinar a invasão de células após exposição a BGJ-398, células que não tinham invadido foram removidas e as células na superfície inferior do filtro foram corados com Diff-Quick (American Scientific Products, McGaw Park, IL). actividade invasiva foi medido por meio da contagem das células que tinham migrado para o lado inferior do filtro. Para avaliar a invasão após o silenciamento FGFR1 ou bFGF, as membranas foram removidas após incubação durante 48 horas a 37 ° C e coradas em iodeto de propídio (Sigma-Aldrich), sem remoção das células a partir das superfícies superiores das membranas. Os filtros foram montadas em lâminas de vidro e analisadas por microscopia confocal a 100 vezes. Os planos de foco foram ajustadas de modo que as células que não tinham invadido poderiam ser distinguidas das células invadidas e contados em 8 campos independentes. atividade invasiva foi medida pelo cálculo das razões da invadiu a células noninvaded.
Archorage Independent Crescimento Ensaio
UM-UC3 e UM-UC13 tipo selvagem ou bFGF /FGFR1 células silenciadas foram semeadas a 1 × 10
4 células por poço de 6 poços em placas suplementadas com 10% de FBS MEM contendo 0,6% de agar. As células foram deixadas crescer durante 2 semanas. As imagens foram adquiridas utilizando um Olympus IX microscópio de contraste de fase invertida. O número total de colónias por vista aleatório (100 ×) eo diâmetro médio de colónias por vista aleatório (100 ×) foram determinadas usando um analisador de imagem SliderBook.
Experimentos Ortotópico xenoenxertos
O humano a linha de células BC de uM-UC-3 foi transduzida com um vector que codifica a luciferase de lentivírus (Luc) e proteína fluorescente vermelha (RFP; mCherry) tal como descrito anteriormente [16]. Depois de transdução estável com o repórter luc-RFP, as células foram classificadas segundo a fluorescência celular ativado (FACS), utilizando um classificador de Afluxo de alta velocidade (BD Biosciences). A actividade da luciferase foi quantificada in vitro usando D-luciferina (150 ug /mL) e o sistema de bioluminescência IVIS (Xenogen Co.). Para produzir tumores em ratinhos nus, culturas subconfluentes de rotulado UM-UC3 foram levantadas com tripsina, misturado com 10% de FBS MEM, centrifugada a 1200 rpm durante 5 minutos, lavadas em PBS e ressuspensas em HBSS. As células foram então injectados ortotopicamente na parede da bexiga, a uma concentração de 5 × 10
5/50 uL utilizando uma laparotomia inferior. metástases rolamento ratinhos foram sacrificados 5 a 8 semanas após a injecção das células tumorais, o nó de linfa e metástases distantes foram excisados, cortados em pequenos pedaços, utilizando bisturis, expostas a 1% de tripsina, durante 20 minutos, centrifugadas (1200 rpm durante 5 min), e cultivadas em 10% suplementado MEM. Após separação por FACS, as células foram reciclados subconfluently cultivadas e reinjectado a uma concentração de 2 x 10
5/50 uL de HBSS, como descrito acima. Assim, a reciclagem de células de tumor foi realizado três vezes, a fim de seleccionar uma subpopulação altamente metastático UM-UC3, que se desenvolve metástases em -75% dos ratinhos. Para nosso experimento terapia, que injetou a 4
th ciclo da reciclagem UM-UC3 a uma concentração de 2 × 10
5/50 mL. Os ratinhos com crescimento tumoral detectável no momento da primeira imagem (5 dias após a injecção) foram divididos aleatoriamente em dois grupos (n = 7 /grupo).
In vivo A bioluminescência Imagiologia
imagem de bioluminescência foi realizada sobre um sistema de imagiologia IVIS 100 com estar programa Image (Xenogen) tal como descrito noutro local [16]. Em resumo, os animais foram anestesiados antes de imagem com uma mistura de 2,5% de isoflurano /ar e injectado s.c. com 15 mg /mL de sal de potássio luciferina em PBS a uma dose de 150 mg /kg de peso corporal. A imagem Animal digitais em escala de cinza foi adquirida e uma imagem pseudocolored foi sobreposto representando a distribuição espacial dos fotões detectados emergentes da luciferase activa. intensidade do sinal foi quantificado como a soma de todos os fotões detectados dentro da região de interesse por segundo, contando separadamente cada tumor primário e cada local metastático.
Recolha de tumores primários e de circulação células tumorais (CTCs)
Quarenta dias após injecção, quando os animais no grupo de controlo tornou-se moribundos, os ratinhos foram anestesiados com isoflurano, conforme descrito acima. Para medir o número de CTC, a quantidade máxima de sangue (600-1200 ul) foi recolhido por punção cardíaca utilizando uma seringa de 1 ml, com agulha de calibre 22, e os tubos de recolha revestidos com heparina como descrito anteriormente [17]. Os ratinhos foram então sacrificados com monóxido de carbono. Os tumores foram excisados, e as amostras ou foram fixados em formalina e embebidos em parafina, incorporado em OCT (Miles, Inc.), ou congeladas rapidamente em azoto líquido e armazenado a -80 ° C para o ARN e a extracção de proteínas. Para processamento adicional do sangue, as células vermelhas do sangue foram lisadas por duas vezes durante 5 min com 1 ml de tampão de lise ACK (Invitrogen), e centrifugado durante 5 min a 1200 rpm em tubos Eppendorf. O pellet foi finalmente lisadas e processados para isolamento de RNA total utilizando o kit de isolamento Mirvana ™ miRNA (Ambion, Life Science). Para a análise de PCR em tempo real, a tecnologia de PCR (Passo Um; Applied Biosystems) foi utilizado em conjunto com os ensaios de expressão de genes TaqMan ® (Applied Biosystems). quantificação absoluta foi usada para gerar os valores de limiar de ciclo (CT) para o iniciador específico humano HLA-C (Hs00740298_g1) para cada amostra. A análise de RT-PCR de amostras de sangue (em triplicado) foi executado em conjunto com isolados padrões (0, 2, 20, 200, 2000 e 20000 células UM-UC3 em 100 ul de sangue do rato). valores CT das normas foram usadas para criar uma curva padrão para UM-UC3 CTC, e o número de CTCs de cada amostra de sangue foi calculada em conformidade.
Resultados
Relação entre E-caderina e bFGF /FGFR expressão em células UC
Analisou-se a expressão de FGFR os 4 e o ligando associado a um cancro dominante (FGF FGF-2 /base) ao nível do ARNm num painel de 30 linhas celulares de UC por toda perfil de expressão do genoma (plataforma Illumina). Expressão de FGFR3 correlacionam-se directamente com a expressão de p63 [18], [19] e E-caderina [20] (Fig. 1A), indicando que FGFR3 está expresso pela subconjunto “epitelial” de células BC. Por outro lado, a expressão de FGFR1 mais correlacionado directamente com a “mesenquimais” marcador vimentina (Fig. 1A). Utilizou-se quantitativa em tempo real da transcriptase reversa PCR (RT-PCR) para definir com maior precisão os padrões de expressão de “epiteliais” marcadores “e mesenquimais” através do painel de linhas celulares. Os resultados são apresentados na Figura 1B, em que organizada as linhas de células BC em todos os painéis de acordo com a sua expressão relativa da canónica “epitelial” marcador de E-caderina (Fig. 1B, painel superior esquerdo) [20]. A expressão de E-caderina correlacionam-se directamente com a expressão de p63 e inversamente com a expressão de ZEB1 e vimentina, demonstrando que os “epiteliais” e marcadores “mesenquimais” são expressas de uma forma em larga medida não-sobreposição nas linhas BC (Fig. 1B) . Apenas duas das linhas celulares (1A6 e UM-UC18) co-expressa “epiteliais” e “mesenquimais” marcadores (Fig. 1B).
A. Correlação de FGFR1 e FGFR3 com marcadores EMT canónicas. níveis de mRNA foram medidos usando toda perfil de expressão de mRNA genoma (plataforma Illumina). O mapa de calor descreve a expressão de FGFR1, FGFR3, FGF2 (bFGF), p63 (TP63), E-caderina (CDH1), Slug (SNAI2) e vimentina. B. Análise quantitativa da expressão do marcador EMT. níveis relativos dos marcadores “epiteliais” E-caderina (CDH1) e p63, eo “mesenquimais” marcadores ZEB1 e vimentina foram medidos por quantitativo em tempo real RT-PCR.
Nós expressão, então, medida de FGFR 1-4 e FGF-2 por RT-PCR quantitativo (Fig. 2A). Confirmação da expressão do gene de perfis resultados, FGFR1 foi expresso principalmente por células no interior do subconjunto “mesenquimais” (UM-UC3, UM-UC13, T24, BV e UC12) (Fig. Top 2A esquerdo), enquanto que a expressão de FGFR3 foi concentrada no ” células “epiteliais, com RT4 tendo a mais alta expressão seguido por UM-UC14, SW780 e RT112 (Fig. 2A, canto superior direito). FGFR2 também pareceu ser ligeiramente enriquecido no “epitelial” e FGFR4 nas células “mesenchymal”, respectivamente, mas os seus níveis de expressão eram muito mais baixos do que os níveis de FGFR3 ou FGFR1 (média de 36 ciclos versus 30 ciclos de PCR), consistente com os resultados anteriores [10]. Finalmente, as células “mesenchymal” expressaram níveis mais elevados de FGF2 (bFGF) do que as células epiteliais “” (Fig. 2A). Confirmou-se que a expressão de FGFR3 foi enriquecida na “epitelial” e FGFR1 e expressão de bFGF foi enriquecida nas linhas de células “mesenchymal” ao nível da proteína por imunotransferência (Figura S1). Pela correlação não paramétrico de análise, constatou-se que a expressão de FGFR3 fortemente correlacionada e directamente com a expressão de E-caderina (Spearman, r = 0,8155, P 0,0001, Fig. 2B) e inversamente com a expressão dos marcadores de “mesenchymal” (Fig S2.). Por outro lado, a expressão de FGFR1 e bFGF fortemente e directamente correlacionada com a expressão de ZEB1 (Spearman, r = 0,799, p = 0,0001 para FGFR1 e r = 0,6198, p = 0,008 para bFGF) (Fig. 2B). Além disso, a expressão de bFGF e FGFR1 correlacionam-se directamente uns com os outros como esperado (Fig. 2B). Em seguida examinado se as diferenças observadas na expressão de mRNA traduzido para expressão diferencial ao nível da proteína em um subconjunto de linhas celulares por imunotransferência. Descobrimos que FGFR3 mas não FGFR1 foi expressa no epitélio de UM-UC14, células RT4 e RT112, enquanto FGFR1, mas não foi expresso em FGFR3 mesenquimais UM-UC3, UM-UC12 e UM-UC13. FGF-2 foi expresso em todas as linhas de células de 6, mas as células mesenquimais expressa mais de FGF-2 do que o epitelial “células fez. Juntos, estes dados suportam a ideia de que FGFR3 e bFGF /FGFR1 provavelmente funcionar na não-sobreposição epiteliais e mesenquimais subconjuntos de células BC.
A. A expressão de FGFR 1-4 e bFGF em relação à expressão de E-caderina. Os níveis de ARNm relativos foram determinados por quantitativo em tempo real de RT-PCR. As linhas celulares em cada painel são organizados pela expressão da caderina-E relativo (baixo para cima, da esquerda para a direita, ver Fig 1B.). B. Scatterplots que descrevem as relações entre FGFR1, bFGF, FGFR3, e expressão do marcador de EMT. correlação não paramétrico de análise foram utilizados para avaliar as relações entre FGFR3 e expressão de E-caderina (CDH1), FGFR1 e expressão ZEB1, bFGF e expressão ZEB1, e bFGF e expressão de FGFR1. Os coeficientes de correlação e os valores de p são indicadas na figura.
Efeitos de BGJ-398 sobre a proliferação celular
Estudos anteriores concluíram que os inibidores de FGFR bloquear a proliferação em algumas células BC humanas in vitro [ ,,,0],12], [13]. Portanto, testou os efeitos de BGJ-398 sobre a proliferação em 17 linhas de células BC para caracterizar o grau de heterogeneidade na sensibilidade ao fármaco. Incubámos as células com concentrações crescentes de BGJ-398 durante 48 horas e citotoxicidade medido e a paragem do crescimento, utilizando ensaios MTT. Foram identificados 5 linhas celulares (UM-UC14, SW780, RT4, RT112 e UM-UC1) que eram droga sensível, tal como definido pela inibição do crescimento ≥50% em concentrações de droga de 1 umol /L ou painel inferior esquerdo Fig. 3A (e dados não mostrados). Para determinar as contribuições relativas de paragem do crescimento e morte celular a estes efeitos, foram expostas as células UM-UC14 e RT4 a concentrações crescentes de BGJ-398 durante 48 horas e medida directamente paragem do ciclo celular e apoptose pelo iodeto de propídio coloração e análise de FACS. Em ambas as linhas de células concentrações crescentes de BGJ-398 produziu aumentos nas percentagens de células em fase G1 e diminuições paralelas nas percentagens de células em fase S. Especificamente, as percentagens de células dentro da fase G1 aumentou de 47,5% e de 54% para 74,2% e 69,1%, enquanto a percentagem de células em fase S diminuiu de 33,5% e 25% para 2,7% e 8,8% no BGJ-398- células expostas UM-UC14 e RT4, respectivamente (Fig. 3A). Por outro lado, BGJ-398 não induziu a apoptose em qualquer linha celular em concentrações inferiores a 10 uM (dados não apresentados). Portanto, BGJ-398 exerce efeitos principalmente citostáticos em células BC in vitro.
A. Efeitos de BGJ-398 sobre a proliferação celular nas células sensíveis a fármacos. No painel da esquerda, as células foram incubadas durante 48 h na presença das concentrações indicadas de crescimento celular BGJ-398 e foi medido por redução de MTT. Média ± SEM, n = 6. Nos painéis central e direito, células UC14 ou de UM-RT4 foram incubadas com as concentrações indicadas de BGJ-398 e as percentagens de células dentro de cada quadrante do ciclo celular foram quantificadas por coloração com iodeto de propidio e análise de FACS . Média ± SEM, n = 3. B. sensibilidade aos efeitos anti-proliferativos de BGJ-398 correlaciona-se com a expressão de FGFR3, mas não com a presença de mutações de activação de FGFR3. O nível de inibição do crescimento observada após 48 h de exposição para 1 uM BGJ-398 (tal como medido em ensaios MTT) foi correlacionada com o nível relativo de FGFR3 (painel da esquerda) ou de FGFR1 (painel da direita) a expressão do mRNA em um painel de 17 aC humano linhas celulares .. C. Efeitos de FGFR3 knockdown sobre a proliferação celular. Painel esquerdo: células UM-UC14 ou RT4 foram transitoriamente transfectadas com não-alvo (NT) ou siRNAs específicos de FGFR3 e crescimento celular foi medido às 48 h por redução MTT. Média ± SEM, n = 6. painéis central e direito: células UC14 ou de UM-RT4 foram transfectadas transientemente com quer sem segmentação (NT) ou siRNAs e percentagens de células dentro de cada fase do ciclo celular específicos de FGFR3 foram quantificados por propídio iodeto de coloração e análise por FACS. Média ± SEM, n = 3. Painel inferior: a eficiência do FGFR3 silenciamento foi medido por RT-PCR quantitativo e imunotransferência
Em seguida, examinaram a relação entre BGJ-398 a sensibilidade e a presença de activação. mutações FGFR3. Usando sequenciação exão foram identificados 5 linhas de células dentro do nosso painel que continha mutações de activação FGFR3 (UM-UC6, UM-UC14, UM-UC15, UM-UC16 e UM-UC17) (Fig. S3). Surpreendentemente, apenas uma das linhas de células de FGFR3-mutante (UM-UC14) também foi BGJ-398 sensíveis. Por outro lado, observou-se uma boa correlação entre a expressão do mRNA FGFR3 e sensibilidade às drogas (Spearman r = 0,7247 p = 0,01) (Fig. 3B painel da esquerda), ao passo que não houve correlação entre a sensibilidade para BGJ-398 e expressão FGFR1 (Spearman r = -0,2931 p = 0,2536) (Fig. 3B painel da direita).
Dada a não-sobreposição padrões de FGFR1 e expressão FGFR3, os resultados sugerem que FGFR3 desempenha um papel mais importante do que FGFR1 na condução proliferação humana células BC. Para testar mais diretamente esta hipótese, utilizou-RNAi para derrubar FGFR1 ou FGFR3 nas células do UM-UC14 e RT4 BGJ-398-sensíveis e medidos os efeitos sobre a proliferação celular utilizando ensaios de MTT. RT-PCR quantitativa revelou eficiências de knockdown de 50% e mais de 80% nas células RT4 e UM-UC14 transfectadas com ARNsi específico-FGFR3, respectivamente, em comparação com células transfectadas com o ARNsi de controlo não específico, e estes resultados foram também confirmados no nível de proteína por imunotransf erência (Fig. 3C painel inferior). Os efeitos sobre a proliferação de células correspondentes foram muito semelhantes, em que a proliferação foi reduzida em quase 50% nas células RT4 e em mais de 80% em Um-UC14 transfectadas com o ARNsi de FGFR3 (Fig. 3C painel da esquerda). A análise do ciclo celular confirmou que FGFR3 knockdown aumentado as percentagens de células em fase G1 e diminuiu as fracções de células em fase S (Fig. centro 3C /painéis da direita), consistente com os resultados de MTT e os efeitos observados anteriormente de BGJ-398 [ ,,,0],12]. Em contraste, o knockdown de FGFR1 não teve efeito significativo sobre a proliferação (Fig. S4).
Efeitos de BGJ-398 da invasão
Embora as células mesenquimais “” UM-UC3 e UM-UC13 expressa níveis relativamente elevados de FGFR1, que eram resistentes aos efeitos anti-proliferativos de BGJ-398 (Fig. 4A painel da esquerda). Porque invasão, migração e metástase são características de células “mesenquimais” tumor [20], que examinou os efeitos de BGJ-398 na invasão nas células UM-UC3 e UM-UC13, utilizando dois “epitelial”, BGJ-398 linhas resistentes ao celulares (UM-UC6 e UM-UC9) como controles. Nós expuseram as células a concentrações crescentes de BGJ-398 e invasão medido utilizando câmaras de Boyden modificadas.