Sumário
Várias cópias regiões alterou-número (CNAs) foram identificados no genoma do câncer do colo do útero, nomeadamente, amplificações de 3T e 5p. No entanto, a contribuição de alterações no número de cópias para a carcinogênese cervical não está resolvido, porque todo o genoma existe uma falta de correlação entre as alterações no número de cópias e a expressão do gene. Neste estudo, investigou-se ANC nas linhas de células Calo, CaSki, HeLa, SiHa e foram associadas a alterações na expressão de genes. Em média, 19,2% dos genomas de linha de célula tinha CNA. No entanto, apenas 2,4% composta regiões mínimas recorrentes (MRRS) comuns a todas as linhas celulares. Considerando 3T tinha ganhos comuns limitadas (13%), 5p foi totalmente duplicada recorrentemente. Genome-wide, apenas 15,6% dos genes localizados na expressão alterada do gene CNAs; Em contraste, a taxa em MRRS foi até 3 vezes esta. Chr 5p foi confirmado inteiramente amplificado por FISH; no entanto, máximo 33,5% dos genes exploradas em 5p foram desregulados. No 3T, esta taxa foi de 13,4%. Mesmo em 3q26, que tinha 5 MRRS e 38,7% SNPs recorrentemente adquirida, a taxa foi de apenas 15,1%. Curiosamente, até 19% dos genes desregulados em 5p e 73% em 3q26 foram reprimidos, sugerindo fatores adicionais foram envolvidos na repressão do gene. Os genes desregulados no 3T e 5p ocorreu em grupos, sugerindo factores de cromatina locais também podem influenciar a expressão do gene. Em regiões amplificadas de forma descontínua, os genes regulados negativamente aumentou progressivamente à medida que o número de SNPs amplificados aumentou (P 0,01, correlação de Spearman). Por conseguinte, a amplificação do gene parcial pode funcionar em silenciar a expressão do gene. genes adicionais em 1q, 3q e 5p poderiam estar envolvidos na carcinogênese cervical, especificamente na apoptose. Estes incluem
PARP1
no 1T,
TNFSF10
e
ECT2
no 3T
e CLPTM1L
,
AHRR
,
PDCD6
, e
DAP
em 5p. No geral, os perfis de expressão gênica e número de cópias revelam que não sejam dosagem do gene fatores, como domínios epigenéticas ou cromatina, pode influenciar a expressão de genes dentro dos segmentos do genoma inteiramente amplificados
Citation:. Vazquez-Mena O, Medina-Martinez I , Juárez-Torres E, Barrón V, Espinosa A, Sepulveda Villegas-N, et al. (2012) Genes ampliado pode ser sobre-expresso, Inalterado ou reprimidos em linhas celulares de cancro do colo do útero. PLoS ONE 7 (3): e32667. doi: 10.1371 /journal.pone.0032667
editor: Alessandro Marcello, Centro Internacional de Engenharia Genética e Biotecnologia, Itália |
Recebido: 05 de setembro de 2011; Aceito: 30 de janeiro de 2012; Publicação: 07 de março de 2012
Direitos de autor: © 2012 Vazquez-Mena et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (CONACYT), conceder números 8135 /A1, 24341 (JB) e 80680 (a SK), e da Universidade Nacional do México (UNAM), conceda número SDI.PTID.05.2 ( a JB). OVM, AE, IMM, e VB foram destinatários de uma bolsa de estudos do CONACYT. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer cervical (CC) é o segundo tipo de câncer mais comum em mulheres em todo o mundo, afetando 500.000 pessoas por ano, e é a principal causa de morte de mulheres com câncer nos países em desenvolvimento [1]. As oncoproteínas virais E6 e E7 de papilomavírus humano de alto risco (HPV) desempenham um papel importante na carcinogénese. Eles inibem vários alvos celulares, incluindo proteínas p53 tumor-supressores e pRb, interromper processos celulares importantes, tais como apoptose e do ciclo celular controle e levar a instabilidade genômica e desenvolvimento neoplásico [2]. Apesar dos danos causados pelas proteínas oncoviral, CC é uma complicação rara da infecção viral, porque a maioria das infecções são transitórias e não evoluir para lesões neoplásicas. Em média, leva-se 12-15 anos antes de uma infecção persistente por HPV pode, através dos estágios pré-malignas de lesões neoplásicas intra-epitelial cervical (NIC), levar a [3] CC. Estes resultados sugerem a infecção pelo HPV sozinho não provoca a doença e outros factores, tais como genes hospedeiras anormais, pode ser associado com o desenvolvimento de cancro invasivo. Várias regiões genómicas foram identificados com as alterações no número de cópias de ADN (regiões alterou-número de cópia, ANC) em CC, através da análise do genoma do tumor, utilizando métodos tais como a hibridação genómica comparativa (CGH), hibridação in situ fluorescente (FISH ), e micromatrizes de SNPs. Ganhos em 1q, 3q, 5p, 8q e 20q e supressões no 2T, 3p, 4p, 4T, 5q, 6q, 8p, 11q, 13q, 18q, e Xq têm sido relatados tanto em CC [4] – [10 ] e linhas de células derivadas de CC [9], [11] – [16]. desequilíbrios genómico podem contribuir para a expressão desregulada de oncogenes e genes supressores de tumores em células de cancro, e a acumulação de tais genes alterados tem sido correlacionada com a progressão do tumor [17]. No entanto, a contribuição dessas alterações para a carcinogênese cervical ainda é uma questão de debate. Os ganhos de 3T [5] – [9], [18], [19] e 5p [5], [13], [20] – [22] são a alteração cromossómica mais frequente em carcinomas cervicais, e eles têm também sido descritos em outros tumores sólidos [23] – [25]. A região de menor consenso da amplificação 3T em mapas CC em cytobands cromossômicas 3q26-27 [6] – [9], [14], [18], sugerindo alguns genes localizados nessas regiões poderiam ser envolvidos na carcinogênese cervical. Alguns deles, incluindo
TERC
[26], [27] e
PIK3CA
[28] oncogenes candidatos, são considerados para CC. Grandes regiões do 3T, incluindo a loci onde
TERC
e
PIK3CA
estão localizados, foram confirmados amplificado por FISH no núcleo interfase de tumores cervicais e Chr metaphase em linhas celulares [14], [29]. No entanto, uma caracterização detalhada destes genes amplificados não foi realizado e apenas o ganho de
PIK3CA
foi validada por PCR quantitativa [28]. Não tem sido demonstrado que
TERC
é regulada em amostras de tumor ou linhas celulares em que é amplificado, e a correlação entre a amplificação e a sobre-regulação do
gene PIK3CA
é ainda controversa. A amplificação de
PIK3CA
não está associada com o aumento da expressão do gene em amostras de tumores [30], [31]. No entanto, tem sido associado com um aumento da quantidade de proteína por western blot em linhas de células [28] e o aumento da actividade de proteína em tumores [32] e linhas de células [28]. A medida em que estas alterações cromossômicas recorrentes são relevantes para o desenvolvimento do tumor ainda é em grande parte desconhecido. Por outro lado, a amplificação total de 5p está bem documentada por FISH em amostras de tumores e linhas celulares [13], [16], [29]. Alguns genes amplificados nutria por esta região e propôs a ser envolvido em CC, como
Skp2
,
TERT
,
TRIO
,
RNASEN
e
PRKAA1
, foram encontrados para ser regulada em amostras de tumor [22] e linhas celulares [13], [16]. No entanto, em todo o genoma, nenhuma correlação foi observada entre o número de cópia e expressão do gene, mesmo nos braços cromossômicos completamente amplificados como 5p ou 3T. Em linhas celulares tendo 5p amplificada, apenas 22% dos genes investigados foram upregulated. Da mesma forma, os tumores invasivos ou linhas celulares tendo 3q amplificado mostrou uma percentagem ainda mais de genes regulados positivamente [16]. A falta de correlação entre o número de cópia (CN) e a expressão do gene [16], [31] sugere que algumas das regiões identificadas por SNP alterados ou mCGH matrizes podem ser alteradas de forma descontínua-CN e nem todos os genes no interior das regiões são afectadas. No entanto, o papel do número de cópias do gene na desregulação não foi estudada em regiões específicas do genoma de largura e apenas detalhe têm sido investigadas [16], [31], [33]. Neste estudo, investigou-se as alterações NC em linhas celulares, em todo o genoma de um nível do gene-por-gene, foram associadas a alterações na expressão de genes. Para o efeito, as alterações NC de todo o genoma e o nível de expressão de mais de 20.000 genes foram explorados em 4 linhas de células usando os 100 SNP e Human Gene K 1.0 ST microarrays da Affymetrix.
Resultados
Identificação de genes potencialmente alterados no número de cópias
Cada linha celular teve, em média, 49.167 cópias SNPs alterou-numéricas (CN-AS; 42,6% de todos os SNPs avaliados), principalmente ganhos (45,5%) e exclusões individuais (48,5%). Amplificações (5,5%) e, em particular, eliminações duplas (0,5%) foram eventos raros. Um total de 1065 ANC diferente foi identificada em linhas de células investigadas 4, 599 e 466 ganhos deleções. Em média, as linhas celulares teve 273 ± 32 (intervalo, 240-317) CNAs e o genoma CN-alteradas global foi de cerca de 19,2%. Quando o ANC das linhas celulares de 4 foram alinhadas (Figura S1), foram identificadas as regiões 108 recorrentes mínimas (MRRS) (Tabela S1). Eles tinham um tamanho médio de 787 kb (gama, 3.4-16,755 kb) e a quantidade de ADN incluído em todo o conjunto de MRRS correspondeu a 2,4% do genoma. Os SNPs recorrentes que constituíram os MRRS representou apenas 5,8% de todos os SNPs avaliados. Apenas 10 braços cromossómicos apresentaram uma proporção superior e estatisticamente significativa (marcado com um asterisco na Figura 1). Três deles só tinha ganho SNPs (1q, 3q, e 5p), 6 só tinha excluído SNPs (4p, 13q, 18q, 20p, 21p e Xq) e 1 (11q) tiveram ambos ganharam e excluídos SNPs. É de notar que 94% dos SNPs 2,045 avaliadas em 5p foi amplificado, sugerindo que toda a 5P foi duplicado (Figura 2A). A percentagem de SNPs alterados nos outros braços era muito mais baixa do que em 5p, 21p, excepto em, que tinha 100% SNP alterados. No entanto, houve apenas 5 SNPs avaliadas neste braço (Figura 1). Por outro lado, 45 de 297 cytobands teve uma maior taxa significativa de SNPs alterados recorrentes de todo o genoma, a maior parte deles estão localizados nos cromossomas identificados acima (Tabela S2). Cytobands com as maiores taxas incluídas 9 amplificado (1q31, 5p12, 5p13, 5p14, 5p15, 3q24, 3q26, 7p11, 7q32) e 6 suprimido (4p16, 11q23, 11q25, 13q12, 13q14 e 18q11).
no lado esquerdo, o número de SNPs localizados em cada braço cromossómico é indicado, que foram exploradas pelo 100 K microarray. No lado direito, o número de genes localizados em cada braço é indicado, que foram exploradas para alterações na expressão de genes por microarrays a expressão ST1.0. Cada barra representa a percentagem de SNPs alterados recorrentes (à esquerda) ou genes desregulados (direita) comuns às linhas celulares 4. Os braços cromossômicos são indicados na coluna do meio. Braços marcados com asteriscos teve um número significativo de SNPs CN alterados superiores e estatisticamente significativas (p 0,05, teste de qui-quadrado) em comparação com o genoma inteiro significa. Braços com um enriquecimento gene desregulado estatisticamente significativa foram marcados com “a” (identificado tanto com o teste do qui-quadrado e PAGE), “b” (identificado apenas com o teste do qui-quadrado, p 0,05) ou “c” (identificado apenas com PAGE).
o painel a mostra o registro de número de cópias
2 proporção de SNPs investigados na Chr 5 pela K SNP microarrays 100 em HeLa, CaSki, SiHa e Calo. Painéis B a D mostram a alteração da expressão do gene de dobragem de genes avaliados pela expressão microarray ST1.0 localizado em MRR 5-1 (n = 64), MRR 5-4 (n = 44), e MRR 5-5 (N = 37) a 5p. As barras representam os genes regulados positivamente, genes regulados negativamente, e genes sem mudança na expressão do gene. Os genes são ordenados de acordo com a posição no genoma. O método SAM foi utilizado para a análise, utilizando valores de corte da mudança dobra de ≥1.5 ou ≤0.66 para cima ou genes reprimidos e dobre taxa de detecção (FDR) de 0%. Genes previamente relatados associados com o cancro do colo do útero são marcados com asteriscos (sistema IPA) ou círculos (PubMed).
Assumindo que CNAs e MRRS foram continuamente regiões, para identificar genes com alterações NC alterados, eles estavam alinhados com o total de genes humanos de acordo com a sua posição no genoma (Figura S1). O número de genes alterados por linha de células variou de 6.864 em Calo para 17.829 em SiHa (média, 11,669 genes; Tabela 1). Curiosamente, 14 MRRS faltava genes e o número de genes nas MRRS restantes (n = 94) variou de 1 a 103. Um total de 1.264 genes foi localizado no MRRS, 619 excluídos, 626 adquirida, e 19 eliminada em algumas células e adquirida em outros (Tabela S3).
análise
expressão gênica de 20,741 genes em linhas celulares CC
A quantidade de mRNA transcrito de 20,741 genes foi comparada entre linhas de células individuais ou todos os 4 linhas celulares em conjunto e 10 controles epiteliais cervicais normais. Os dados brutos foi padronizado com o algoritmo robusto média microchip (RMA) do software FlexArray e genes com um nível de expressão diferente foram identificados com a “análise da significância dos microarrays” Método (SAM), utilizando valores de corte da mudança dobra de ≥ 1,5 e uma taxa de descoberta dobra (FDR) de 0% (ver Materiais e Métodos). O número médio de genes expressos diferencialmente entre células cancerosas e o grupo de controlo foi de 3127 e variaram de 2,069 (10%) em SiHa de 5295 (25,5%) em células HeLa (ver Tabela 1). Quando as experiências das linhas celulares 4 foram tomadas em conjunto como um grupo, 3.122 genes (15,1%) foram encontrados expressos de forma diferente em comparação com a do grupo de controle, 1.434 regulada e 1.688 subregulado (Tabela S4).
A frequência genes de desregulados foi calculada em cada braço cromossômico e cytoband. Apenas 7 braços cromossômicos (4T, 5p, 15q, 16p, 16q, 18q e 19p) mostraram uma maior e estatisticamente significante; percentual (p Figura 1). 5p braço tinha o maior percentual (33,5%) dos genes desregulados seguido de 16q (22,1%), 16p (21,3%), 18q (21%), 15q (20,8%), 19p (20,4%) e 4T (18,9%) . Em 5p, 16p, 16q e 19p os genes regulados positivamente predominou, enquanto no 4T, 15q e 18q os genes reprimidos predominou (Figura 1). Apenas 10 dos 297 cytobands teve também uma taxa maior e estatisticamente significativa, a maioria deles localizados nesses cromossomos (Tabela S2). Cytobands com as taxas mais elevadas foram 19p12 (61,8%), 15q11 (52,5%) e 5p15 (45,1%). A maioria destes Chr e cytobands foram confirmadas com a análise de PAGE (Figura 1 e Tabela S2), que considerar nos cálculos, além do número de genes desregulados, o valor médio da alteração de dobragem (FC; ver materiais e métodos). No entanto, 8 Chr e 29 cytobands, não descobertos com o teste do qui quadrado, foram também detectados enriquecido de genes desregulados com este método (marcado com um “C” sobrescrito na Figura 1, Tabela S2), indicando que, ao contrário a percentagem, média valores de FC foram significativamente diferentes em comparação com a média global
a alta correlação positiva estatisticamente significativa (p 0,01). foi encontrada entre os valores de qRT-PCR e micro-matrizes em todos os 23 genes avaliados com as duas metodologias . Os coeficientes de correlação variou de 0,61 a 1,0 ea média foi de 0,82. A Figura 3 mostra a intensidade média de mRNA de 9 genes localizados no 1T (PARP1), 3T (MCM2, ECT2,
NAALDL2
,
NLGN1
, TNFSF10 e
RFC4
) e 5p (
TRIO, CLPTM1L
), que foram avaliados com qRT-PCR e microarrays. Estas experiências sugerem que todo o conjunto de dados de microarrays HG1.0ST era confiável.
O painel A mostra as experiências de microarrays e painel B os experimentos qRT-PCR. Painéis mostram a média ± erro padrão da intensidade de 9 genes CN-alteradas localizados em 1q expressão (
PARP1
), 3T (
MCM2
,
ECT2
,
NAALADL2
,
NLGN1
,
TNSF10
e
RFC4
) e 5p (
TRIO e CLPTM1L
). Para ambos os métodos intensidades são expressas em unidades relativas (ver Materiais e Métodos).
Correlação de alterações no número de cópias com a expressão do gene
Análise da expressão gênica em todo o conjunto de CNAs e MRRS.
Apenas 63% dos genes CN-alteradas podiam ser avaliados para mudanças na expressão gênica com a HG1.0ST microchip. Por outro lado, a partir dos 20,741 genes investigados para alterações na expressão de, em média, 35,4% deles foram identificados com potenciais alterações do número de cópias nas linhas de células (Tabela 1). A proporção de genes desregulados foi ligeiramente superior no grupo de genes com alterações NC do que no grupo de genes sem alterações NC (15,6% versus 14,8%; p 0,05, qui-quadrado). Uma diferença maior foi encontrada no grupo de genes alterados recorrentes (18,8% versus 14,9%; p = 0,0035, qui-quadrado). Estas pequenas diferenças podem sugerir ou que a maioria dos genes identificados com alterações potenciais no número de cópias não são realmente excluídos ou adquirida ou que são alteradas no número de cópias sem mudanças na expressão gênica. No primeiro caso, o CNA pode ter sido alterada de forma descontínua-CN. No segundo, os CNA foram presumivelmente NC-alterada continuamente, mas a expressão do gene pode ter sido modulada por outros factores. Curiosamente, em média, 69,1% de genes potencialmente NC-modificado em cada linha de células que não foram alterados os SNPs; ao contrário, eles foram localizados entre 2 SNPs alterado dentro do CNAs (Figura S1). O restante (30,9%) tinham de 1 a 282 SNPs alterados (média de 6 ± 10). No entanto, espera-se que os genes localizados em uma região totalmente alterada seria desregulamentado da mesma forma, independentemente do número de SNPs.
Uma forma indireta para testar esta hipótese foi globalmente para investigar se a percentagem de genes desregulados aumenta à medida que o número de aumentos de SNPs /gene ou região. Em todo o conjunto de CNA, a taxa de genes desregulados não aumentar à medida que o número de SNPs por CNA aumentado, em vez disso, permanece uniforme em torno de 15,6% (Figura 4A). Por contraste, nos MRRS, a tendência de um aumento de 14,5% em genes localizados em MRRS com 1-100 SNPs para 36,1% em genes localizados em MRRS com mais de 500 SNPs (p 0,001, associação de Mantel-Haenszel linear-a-linear teste do qui-quadrado; Figura 4A). Os números também aumentou com a densidade de SNPs alterado, de 16,5% em genes localizados em MRRS com mais de 20 kb /SNP para 23,2% em genes localizados em MRRS com menos do que 20 kb /SNP (p = 0,03, Pearson Chi-quadrado ; dados não mostrados). Estes dados sugerem que MRRS com o maior número de SNPs são mais susceptíveis de ser completamente CN alterada. No entanto, o facto de a percentagem de genes desregulados aumentou linearmente com o número de SNPs alterados por gene aumentou (P 0,01, de Mantel-Haenszel linear-por-linear teste de associação de Qui-quadrado; Figura 4B), sugere que muitas dessas regiões foram CN-alteradas de forma descontínua.
a figura mostra as tendências percentuais de genes desregulados como o número de SNPs CN-alteradas por região (painel a) ou gene (painel B) aumentou. MRR inclui os genes abrigadas pelas regiões recorrentes mínimas comuns para as linhas de células 4. A associação linear entre as variáveis em todos, mas uma parcela (CNAs, painel A) foi estatisticamente significativa, p . 0.01, Mantel-Haenszel linear-by-linear teste do qui-quadrado de associação
A estratificada a análise foi realizada para clarificar a relação precisa entre essas variáveis. No conjunto de CNA, a tendência percentagem de genes desregulados aumentou com o número de SNPs /gene, ou eles estavam localizados em CNA de ter menos ou mais do que 500 SNPs ou de baixa ou de alta densidade de SNPs (dados não mostrados). Estes dados sugerem a maioria dos CNA não são CN-alterada continuamente. No conjunto de genes recorrentes alterado, a tendência de genes desregulados diferente se eles foram localizados em MRRS com menos ou mais de 500 SNPs. No primeiro grupo, a tendência foi semelhante ao observado em todo o conjunto de ANC (p 0,001, Mantel-Haenszel linear-por-linear teste de associação de Qui-quadrado; Figura 5A), sugerindo que eles foram também NC-alterada de forma descontínua. É notável que, nos CNA descontínuas (dados não mostrados) ou MRRS, a tendência ascendente é devido aos genes regulados negativamente, quer eles foram eliminados (por MRRS, p = 0,01, correlação de Spearman; Figura 5B) ou amplificado (por MRRS , p 0,01, correlação de Spearman; Figura 5C). No caso das 2 MRRS amplificados que possuem mais de 500 SNPs, embora a tendência de genes regulados-de diminuiu ligeiramente de 40,8% para 28,6% com o número de SNPs /gene (Figuras 5A), que não era estatisticamente significativa (P = 0.333, Mantel-Haenszel linear-by-linear associação qui-quadrado). É notável que este subconjunto de MRRS apresentou o maior percentual de genes regulados por de (36,1%, 39 dos 108; Figura 5D), com mais de 89,7% regulada (35 de 39; Figura 5D). Estes dados sugerem que estes MRRS são mais susceptíveis de ser completamente CN alterada. Curiosamente, estes 2 MRRS estão localizados em 5p, o braço já demonstrada como totalmente amplificado. Um (MRR 5-1) está localizado em cytoband 5p15 e o outro (MRR 5-4) está localizado em cytoband 5p14 (Tabela S1).
No painel A, a tendência percentagem de genes é comparada entre desregulados os genes localizados em MRRS possuindo 1-100, 101-500, e 500 SNPs. As tendências de genes de cima e regulados negativamente estão apresentados nos painéis B (47 MRRS suprimido, 500 SNPs), C (51 MRRS amplificados, 500 SNPs), e D (2 MRRS amplificados, 500 SNPs). O número total de genes estudados quanto à expressão e incluídos na análise de painéis B, C e D foi de 390, 267, e 108, respectivamente. Os números acima das barras indicam o número de genes desregulados.
Análise
expressão gênica por MRR individual.
Outra forma de investigar o estado copy-número real de MRRS é comparando a percentagem de genes desregulados em cada MRR com a de todo o conjunto de RMM. Em princípio, espera-se que, quando o MRR é, na verdade, suprimida ou adquirida, a maioria dos genes localizados em que MRR deve alterar a expressão do mesmo modo como a alteração CN. Apenas 61,9% (783 de 1264) dos genes situados em 85 MRRS foi investigado por alterações na expressão. A porcentagem do total de genes desregulados foi de 18,8% (147 de 783) e apenas 32 MRRS teve um maior do que esse percentual. No entanto, somente em 4 deles, 2 ganhou (MRR 3-13 e 5-1, Tabela S1) e 2 excluído (MRR 4-4 e 13-2; Tabela S1), a diferença contra todo o conjunto (18,8%) foi estatisticamente significativa. De particular interesse é MRR 5-1, pois 43,8% dos genes investigados (28 dos 64) foram desregulados e o valor p era muito baixa (4,5 × 10
-6; qui-quadrado). Destes, 27 genes foram regulados positivamente e apenas 1 (
FBXL7
) foi regulada negativamente (Figura 2B). Como esperado, a percentagem de genes sobre-expressos foram semelhantes nos subgrupos de genes com (50%) ou sem (38,9%) SNP alterados (p 0,05, qui-quadrado; dados não mostrados). A elevada percentagem de genes regulados positivamente em ambos os subgrupos de genes sugere fortemente que esta MRR é totalmente duplicado. As outras 3 regiões (RMM 3-13, 4-4 e 13-2) tiveram uma maior percentagem de genes desregulados (57,1%, 75% e 46,2, respectivamente), mas eles só tinha genes limitados avaliados para expressão e os valores de p eram apenas abaixo de 0,05 (Tabela S1). É importante notar que, se todos os genes localizados em MRRS foram exploradas e genes desregulados foram encontradas nas mesmas proporções, a diferença destas 3 MRRS da média deveria ser mais forte, e 2 MRRS adicionais podem ser identificados (e 1-4 MRRS 19-2; Tabela S1). Curiosamente, o MRR 3-13 está localizado em 3q26, um cytoband frequentemente amplificados em CC. Os outros potencialmente ganharam MRR contendo mais de 500 SNPs (MRR 5-4), identificados na análise mostrou acima, não têm uma percentagem de genes desregulados muito maior do que a média a ser estatisticamente significativa (p 0,05; teste qui-quadrado ), pois apenas 25% (n = 11) dos 44 genes investigados para a expressão foram desregulados.
análise
expressão gênica por braços cromossômicos e cytobands.
A correlação de CN e expressão de genes analisados pelas armas cromossômicas e cytobands era muito pobre. Só 5p mostrou uma correlação clara entre CN e expressão gênica (Figura 1), porque a alta porcentagem de recorrência ganhou SNPs (94%) correlacionado com uma alta proporção de genes regulados positivamente (27,7%). A correlação era especialmente superior em 5p15 e 5p12 em que a taxa de genes regulados positivamente aumentou até 45,1% (Tabela S2). Em menor grau, as percentagens mais elevadas de SNPs eliminados foram correlacionados com o enriquecimento de genes regulados negativamente em 4p, 13q e 18q (Figura 1). Os outros 6 braços e 37 do cytobands 43 restantes, identificados com uma elevada percentagem de CN-AS, não apresentou qualquer enriquecimento gene em comparação com todo o genoma, incluindo 3T (13,4%) e 3q26 (15,1%), que tinha exclusivamente SNPs ganhou, mas genes reprimidos predominou (7,8% no 3T, Figura 1; e 11% em 3q26, Tabela S2). Quando 3q foi analisado separadamente em cada linha celular, uma alta proporção de SNPs obtidas foi encontrada em Calo (93,5%) e HeLa (87,2%; Figura 6). No entanto, a proporção de genes desregulados aumentou apenas cerca de 2 vezes em HeLa (23,4%), mas não em Calo (12,7%) em comparação com o que em CaSki (13,9%) e SiHa (9,4%). Por outro lado, 4T, 5q, 6q, 14q, 15q, 16q, 16p, 17q, 19p e 20q, que também mostrou um enriquecimento de genes desregulados, não tinha nenhum ou um percentual muito baixo de CN-AS (Figura 1). Este também é o caso de 31 dos 39 cytobands que mostraram um enriquecimento significativo de genes desregulados. É especialmente notório em 15q11 e 19p12, que não tem alterado recorrentes SNPs, mas mostrou downregulated mais de 50% dos genes exploradas (Tabela S2).
O painel A mostra o registo de número de cópia
2 proporção de SNPs investigada em Chr 3 pela K SNP microarrays 100 em HeLa, CaSki, SiHa e Calo. Painéis B a D mostram a alteração da expressão do gene de dobragem de genes avaliados pela expressão microarray ST1.0 localizado em 3q26 (n = 73), 3q27 (n = 63), e 3q28-29 (n = 66). Os genes são ordenados de acordo com a posição no genoma. Consulte a legenda da Figura 2 para obter mais informações.
Análise de 5p, 3T e 1q.
Embora o braço cheio 5p parecia ser amplificado (Figura 2A), vale a pena notar que cerca de 2/3 dos genes localizados neste braço não foram desregulados, e a partir desses genes desregularizaram, foram encontrados 9 regulados negativamente (Figura 2B-D). Além disso, a proporção de genes desregulados não foi uniformemente distribuída ao longo 5p, porque era muito mais elevado em MRR 5-1 (5p15; 43,8%; Figura 2B) do que em MRR 5-4 (5p14.3-5p13.2; 25% ; Figura 2C) e MRR 5-5 (5p13.1-5p12; 24,3%; Figura 2D). genes reprimidos eram quase ausentes em MRR 5-1 mas aumentou em MRRS 5-4 e 5-5. É notável que 48,8% dos genes desregulados em 5p, especialmente em MRR 5-1, foram distribuídos em grupos de 2 ou mais genes desregulados contíguos (Figura 2B). Esta distribuição foi estatisticamente significativo de uma distribuição aleatória (p 1 × 10
-8, teste de qui-quadrado), o que sugere que além de a amplificação do segmento, a localização de genes dentro da mesma região da cromatina, talvez, a um nível de loop, podem influenciar a expressão génica. Vários genes previamente relatado e deve estar envolvido na carcinogênese cervical, como
BRD9
,
POLS
,
SdhA
, e
TRIO
, também foram identificados regulada positivamente e localizado em MRR 5-1 (Figura 2B).
a Figura 6 mostra a intensidade (log
2 ratio) de SNPs investigados em Chr 3 (Figura 6A) e a mudança de dobragem expressão de genes avaliada em 3q26-29 (Figura 6B-D), onde existem genes frequentemente identificado ou associado com o CC. Apenas 3q26 tinha MRRS (MRRS 3-11, 3-12, 3-13, e 3-14; Figura 6B). Uma percentagem muito baixa de genes desregulados por cytoband é mostrado (~13%), particularmente em 3q28 /3q29. No entanto, 31,9% dos genes desregulados, semelhante àqueles investigados em 5p, foram localizados juntos em grupos de 2 ou mais genes, intercalados com vários genes sem mudanças na expressão gênica. No caso de 3q26 (Figura 6B), há um aglomerado, alinhado com MRRS 3-13 e 3-14, incluindo 3 regulados negativamente (
TNFSF10
,
NLGN1
, e
NAALADL2
) e 2 genes regulados positivamente (
AADACL1
e
ECT2
). Por outro lado, há um MRR (3-12) que tinha genes com nenhuma alteração na expressão de genes. Em 3q27, há um cluster com 5 genes sobre-expressos (
ALG3
,
ECE2
,
CAMK2N2,
PSMD2
, e
EIF4G1
). É interessante notar que os genes, como
TERC
,
PIK3CA
(3q26), e
LAMP3
(3q27) não foram nem CN alterado recorrentemente nem regulada (Figura 6B e C).
a Figura 7 mostra a intensidade do sinal (log
2 ratio) de SNPs investigados em Chr 1 (Figura 7A) e MRR 1-15 (Figura 7F), a mudança de dobragem expressão de genes avaliada 4 MRRS (1-8, 1-9, 1-14 e 1-15; Figura 7B-e) e o número de cópias do gene de PARP1 avaliada por qPCR (7G). Da mesma forma que 3T, a percentagem de genes desregulados por cytoband no 1T foi muito baixa (média = 13%) e apenas 1q21 teve uma taxa maior do que todo o genoma (22,2%, Tabela S2). Mesmo nas MRRS, apenas uma média de 17% dos genes foi desregularizaram (calculado a partir da Tabela S1) e a pequena diferença (2,5%), em comparação com toda a 1q (14,5%; Figura 1), não era estatisticamente significativa. Nas figuras 7B-E são mostradas as MRRS (1-8, 1-9, 1-14 e 1-15) que tinha o maior número de genes exploradas para alterações na expressão (Tabela S1). Em MRR 1-9 (Figura 7C), é notório que nenhum dos 27 genes exploradas foram regulada, em vez dois deles foram reprimidos (MNDA e DARC). Em contraste, em MRR 1-15 (Figura 7E), 7 dos 33 (21,2%) explorou genes foram supra-regulada, incluindo PARP1. Da mesma forma que 5p e 3T, os genes desregulados eram frequentemente (37,9%) localizados juntos em grupos de 2 ou mais genes intercalados com vários genes sem mudanças na expressão gênica. Isto é claramente visível na MRRS 1-8 (Figura 7B), 1-14 (Figura 7D) e 1-15 (Figura 7E). A amplificação do gene foi validado PARP1 nas quatro linhas celulares por qPCR com um ensaio TaqMan (Figuras 7G). Curiosamente, o número de cópias correlacionados com a intensidade média (razão log2) dos 110 SNPs localizados no MRR 1-15 explorada com o microarray 100 K (Figura 7F). Considerando Calo, CaSki e HeLa tinha cerca de 4 cópias do gene PARP1 e uma razão log2 em torno de 0,2, SiHa teve 10 cópias e um rácio de 0,4 log2.
O painel A mostra o número rácio log2 cópia do SNPs investigada em Chr 1 pela K SNP microarrays 100 em HeLa, CaSki, SiHa e Calo. Painéis B a D mostram a mudança dobra de expressão gênica de genes avaliados pelo microarray expressão ST1.0 localizado na MRRS 1-8, 1-9, 1-14 e 1-15. Os genes são ordenados de acordo com a posição no genoma. Para o painel F, a média ± S.D. do sinal de relação de log2 110 SNPs localizados no MRR-15 foi representada graficamente. No painel G é mostrado o número de cópias do gene de PARP1 calculada por qPCR em experiências em triplicado. Consulte a legenda da Figura 2 para obter mais informações.
fluorescente de hibridização in situ (FISH)
O número de cópias da região 5p15, onde MRR 5-1 está localizado, foi investigada uma. b. c. d. uma. b. c. d. uma. b. uma. b.