Abstract

irradiação de íons pesados ​​induz uma maior frequência de DNA dupla rupturas dos filamentos (LAP), que deve ser devidamente reparado . encurtamento dos telómeros crítica pode desencadear respostas danos no DNA, tais como LAP. Os telômeros são muito sensíveis ao estresse oxidativo, tais como a radiação ionizante. A subunidade catalítica da proteína dependente de ADN quinase (DNA-PKcs) é o componente central na extremidade não-homóloga de união (NHEJ) reparar complexo e participam na manutenção dos telómeros. Portanto, espera-se aumentar o efeito de morte celular de irradiação de iões pesados ​​por meio da inibição de ADN-PKcs. Para testar esta hipótese, radiossensibilidade celular foi medida pelo ensaio genético clonal. DNA reparação de danos foi relativamente quantificada por PCR longo. A apoptose foi quantificada por análise de citometria de fluxo de anexina V /PI dupla coloração, e senescência foi analisada por galactosidase. comprimento dos telómeros foi semi-quantificados por PCR em tempo real. P53 e p21 de expressão foi determinado por western blotting. Os nossos dados demonstraram que as células MCF-7 e HeLa com a inibição de ADN-PKcs eram mais susceptíveis a irradiação de iões de carbono do que aqueles sem a inibição de ADN-PKcs. Embora NHEJ foi inibida pelo inibidor específico de ADN-PKcs, NU7026, a maioria dos danos no DNA induzidos por irradiação de iões de carbono foi reparado no prazo de 24 horas após a irradiação em ambas as linhas celulares. No entanto, o potencial de reparação de dano letal (PLDR) não poderia restaurar a inactivação celular no ADN PKcs células inibidas. Células MCF-7 mostraram extensa senescência e redução do comprimento de telómeros acelerado, enquanto que as células HeLa sofreram apoptose significativa após a irradiação com NU7026 incubação. Além disso, ambas as linhas celulares com mais curtos dos telómeros eram mais susceptíveis a radiação carbono-ião. Nossos dados atuais sugerem que a inibição DNA-PKcs poderia aumentar a sensibilidade celular à radiação de carbono-ion via perturbar o seu papel funcional na protecção dos telómeros final. A combinação da inibição da DNA-PKcs e irradiação de carbono-ion pode ser um método eficiente de terapia de íons pesados ​​

Citation:. Zhou X, Zhang X, Xie Y, Tanaka K, Wang B, Zhang H (2013 ) células cancerosas DNA-PKcs Inibição sensibiliza para Carbon-Ion irradiação via Telomere capping Disruption. PLoS ONE 8 (8): e72641. doi: 10.1371 /journal.pone.0072641

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 14 de abril de 2013; Aceito: 11 de julho de 2013; Publicação: 27 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Programa de Pesquisa básica Nacional da China (2010CB834202), o National Natural Science Foundation da China (10.835.011), ea tecnologia projectos de Investigação científica da província de Gansu (0702NKDA045, 0806RJYA020) e HIMAC projeto 11J364 que é apoiado pela National Instituto de Ciências radiológicas. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os telómeros são estruturas especializadas DNA-proteína que cap nas extremidades dos cromossomos. Cerca de 90% das células cancerosas conter telómeros curtos, mas exibem uma elevada actividade de telomerase. Como as células cancerosas se dividem mais frequentemente, possuem, em média, os telômeros mais curtos do que as células normais. Portanto, sem a função da telomerase adequada para manter o comprimento dos telômeros, os telômeros em células cancerosas pode encurtar a um ritmo mais rápido do que as células normais. Telómeros criticamente curtos podem conduzir a aberrações cromossómicas [1] e induzem a resposta a danos no ADN (DDR) [2]. Assim, o comprimento do telómero pode ser um factor importante para a inactivação de células de cancro.

telómeros desempenham papéis importantes em respostas celulares a agentes que danificam o ADN, tais como a radiação ionizante (IR) [3]. Várias linhas de evidência sugerem que a manutenção dos telómeros está relacionada com a radiossensibilidade. Por exemplo, tanto o radiossensíveis AT células e células ABS mostrou um número de defeitos associados-telómeros e a proteína relacionada com a radiossensibilidade está presente nos telómeros [4] – [7]. quebras de cadeia dupla em telómeros devem ser adequadamente processados ​​pela telomerase com a ajuda de proteínas de ligação a telómeros. Se não, as quebras no telômeros poderia iniciar a degradação cromossomo e /ou rearranjos, DDR e, eventualmente, levar à morte celular [8].

radiação alta LET pode induzir a maior e mais complexa danos no DNA do que a radiação de baixo LET. radiação de baixa LET produz principalmente quebras de cadeia simples (SSB), enquanto que a radiação de alta LET produz principalmente LAP e danos em cluster, que representam uma forma perigosa de danos. Se não for devidamente reparado, LAP causar alterações genéticas e /ou morte celular. As respostas diferenciais de células após exposição a irradiação a diferentes valores DEIXAM pode corresponder ao facto de a natureza do dano do ADN é distinta. Há relatos que mostram que a estrutura dos telômeros é particularmente suscetível ao estresse oxidativo [9]. Portanto, a radiação de alta LET pode causar danos mais graves aos telômeros do que radiação de baixa LET. Como a maioria das células cancerosas abrigar telômeros mais curtos do que as células normais, os telômeros em células cancerosas podem ser mais propensos a diminuir para um comprimento crítico com a inibição da telomerase. Portanto, postulamos que a morte celular efeito da irradiação de iões pesados, pode ser realçada por interferência devido ao alongamento dos telómeros nas células cancerosas.

Neste estudo, mostrou que a radiossensibilidade das células MCF-7 e foi HeLa bastante reforçada pelo NU7026, um inibidor específico DNA-PKcs, após irradiação de carbono-ion. Investigações posteriores demonstraram que com um efeito limitado sobre a capacidade de reparo do DNA, células MCF-7 tratadas com NU7026 mostrou acelerada perda de telômeros após a irradiação de carbono-ion. Como DNA-PKcs não é apenas o componente chave no complexo de reparo NHEJ, mas também está envolvida em função dos telômeros, postulamos que NU7026 poderia aumentar a radiossensibilidade por interferir com o acesso telomerase para o telômero após a irradiação de carbono-ion.

Materiais e Métodos

Cultura celular e tratamento de irradiação

a célula de cancro da mama humano lineMCF-7 e linha de células de cancro do colo do útero HeLa foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection. As células foram mantidas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (Gibco, EUA) suplementado com soro bovino fetal a 10%. As células foram cultivadas em 5% de CO

2 em ar humidificado a 37 ° C.

de raios X foram gerados com um aparelho de raios-X (Pantak-320S, Shimadzu, Japão) operado a 200 kVp e 20 mA utilizando uma Alumínio + 0,5 mm filtro de cobre de 0,5 mm. Um medidor de taxa de exposição (AE-1321 M, Applied Engineering Inc, Japão) foi utilizado para a dosimetria. As doses foram de 1,1 Gy /min. As células em crescimento exponencial foram irradiadas a temperatura ambiente, com as células de cultura não-irradiados de controlo (), que foram tratados em paralelo com as amostras irradiadas.

irradiações carbono-iões foram realizadas à temperatura ambiente a que o Heavy Ion Médico Acelerador center (HIMAC) do Instituto Nacional de Ciências radiológicas (Chiba, Japão), com 290 MeV /n carbono-ion; o valor LET para o carbono-ion foi de 40 KeV /m. As doses foram de 1 Gy /min. Alguns procedimento de irradiação também foi realizado em Facilidade de Íons Pesados ​​Pesquisa em Lanzhou HIRFL, Instituto de Física Moderna, da Academia Chinesa de Ciências, Lanzhou, China, com 300 MeV /n carbono-íon e um valor LET de 49 KeV /m.

clonogênica Ensaio

As células em crescimento exponencial foram semeadas em placas de petri para a formação de colónias. 1000-10000 células foram semeadas dentro de uma hora após a irradiação com base na dose de radiação recebida. Para o exame de danos potencialmente letais recuperação (PLDR), as células foram cultivadas no meio durante um período de recuperação de 24 h após a irradiação e em seguida semeado. As células foram novamente incubadas até as colónias formadas foram suficientemente grandes para serem contadas, enquanto continua a ser separáveis. As colónias foram então fixadas com metanol e coradas com solução Giemsa 0,6%. As colónias foram contadas manualmente. Apenas as colónias contendo mais do que cerca de 50 células foram contadas.

Ensaio de Apoptose

A quantificação de células apoptóticas foi obtido usando o kit de detecção de anexina V-FITC (beyotime, NC) de acordo com o protocolo do fabricante. Os dados foram avaliados com FlowJo 7.2.1 software. Seguintes controles foram usadas para criar remuneração e quadrantes:. Células não coradas e as células coradas com FITC-anexina V ou com PI sozinho

Senescence Ensaio

células MCF-7 foram lavadas duas vezes com PBS e fixo com 2% de formaldeído, 0,2% de glutaraldeído, durante 5 min. As células foram então lavadas novamente com PBS e coradas com uma solução de 1 mg /ml de 5-bromo-4-cloro-3-inolyl-ß-galactosidase em dimetilformamida (20 mg /ml de stock), ferrocianeto de potássio 5 mM, 150 mM de NaCl, 40 mM de ácido cítrico /fosfato de sódio, pH 6,0, e 2 mM MgCl

2. A seguir à incubação durante a noite a 37 ° C, as células foram lavadas duas vezes com PBS e depois fotografadas.

QPCR para Telómero comprimento da medida

O FTC-3000 sistema de qPCR (FUNGLYN, CA) foi utilizado para análise. O ADN genómico total de 50 ng foram usadas para o ensaio do comprimento dos telómeros, numa reacção de 20 ul contendo 1X SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Japão) e 200 nmol /L de cada iniciador. A informação sobre a sequência em relação aos iniciadores foi listada na Tabela 1. Reacções em triplicado foram realizadas para cada marcador usando o seguinte perfil de ciclos térmicos adaptado de Cawthon [10]: 15 min a 95 ° C a stage1; 2 ciclos de 15 s a 94 ° C, 15 s a 49 ° C na fase 2; e 32 ciclos de 15 s a 94 ° C, 15 s a 58 ° C, 15 s a 72 ° C, com a aquisição de sinal na fase 3. A 72 ° C lê proporcionou os valores de Ct para a amplificação do telómero e c-myc modelo. abordagem quantificação relativa (△△ Ct) foi utilizada de acordo com o método anteriormente descrito [11]. Cada teste foi realizado em triplicado.

DNA reparar danos Ensaio

Long PCR para avaliação de danos mtDNA foi realizada utilizando o kit GeneAmp XL PCR (Perkin-Elmer, Boston, MA) . longo PCR quantitativo foram realizadas num Eppendorf Mastercycler sistema de PCR (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). O teste de ciclo de PCR foi realizado antes de garantir a PCR na fase exponencial. A informação sobre a sequência dos iniciadores foi listada na Tabela 1. A PCR foi iniciado com uma de 75 ° C além de arranque a quente da polimerase e deixou-se submeter o seguinte perfil: uma desnaturação inicial de 1 min a 94 ° C, seguido de 25 ciclos para grandes fragmentos ou 20 ciclos de pequenos fragmentos de 94 ° C desnaturação durante 15 segundos e 68 ° C de extensão por 15 min. Uma extensão final a 72 ° C, foi realizada durante 10 min após a conclusão do perfil. Uma aliquota de cada produto da PCR foi resolvido sobre um gel de agarose a 1% e vertical, a electroforese em TBE durante 4 h. Os géis foram então fotografadas digitalmente e quantificados com FluorChem FC2 (Alpha Innotech corporação). O dano do ADN foi quantificado através da comparação do nível relativo de amplificação dos fragmentos grandes de ADN (do gene HPRT 10,4 kb) esta normalização para a amplificação de 54-pb (c-myc) fragmentos menores.

Criação de células com mais curtos Telómero

As células foram incubadas com 2 uM MST312 (Sigma, EUA) por 50-70 dias em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (Gibco, EUA) suplementado com soro bovino fetal a 10%. As células foram cultivadas em 5% de CO

2 em ar humidificado a 37 ° C. O meio com 2 uM MST312 foi substituído a cada 3 a 4 dias. comprimento dos telómeros foi determinada por QPCR como anteriormente descrito. MST312 foi removido a partir do meio 24 horas antes do procedimento de radiação.

Ensaio de Citotoxicidade

Citotoxicidade de MST312 foi determinada por monitorização em tempo real de células aderentes por o sistema RT-CES (ACEA Biosciences, EUA ). 10000 células foram semeadas em cada 360 uL bem com 200 uL forma, antes da medição. O meio foi trocado a cada 3 dias. A proliferação de células MCF-7 e HeLa foi registada a cada 2 horas durante 144 horas.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada sobre as médias dos dados obtidos a partir de pelo menos três experiências independentes. Os dados são apresentados como médias ± DP. programa de teste t de Student no Microsoft Excel foi utilizado para detectar a significância estatística.

p

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

NU7026 Tratamento Avançado Cellular Inactivação via apoptose e /ou senescência em células cancerosas depois de Carbono-ion Irradiação

A radiossensibilidade de células foi examinada pelo ensaio clonogênica. Tal como ilustrado na Figura 1, a radiossensibilidade das células tratadas com NU7026 foi maior do que o controlo, em ambas as linhas celulares. O efeito de inactivação celular de irradiação de iões de carbono foi maior do que o de raios-X. Para investigar mais profundamente o destino celular após a irradiação e /ou tratamento NU7026, apoptose celular e senescência foram determinadas por coloração com anexina PI /dupla e ß-galactosidase de coloração histoquímica, respectivamente. A apoptose em células MCF-7 e células HeLa não foi significativamente elevada quando tratados com irradiação de carbono-ião ou NU7026 sozinho, mas foi marcadamente aumentado pela combinação de irradiação de iões de carbono e NU7026 tratamento (Tabela 2). Células MCF-7 tratadas com NU7026 após a irradiação de iões de carbono mostrou extensa senescência celular 30 dias após irradiação; sozinho irradiação de carbono-ion também induziu senescência, mas em muito menor medida (Figura 2). As células HeLa foram submetidos a perda significativa da população através de apoptose 48 horas após a irradiação e não pode sustentar a proliferação depois.

As células foram incubadas com 10 mM NU7026 por 3 horas antes da irradiação.

avançado Radiosensibilidade foi independente do DNA reparar danos Capacidade

DNA-PKcs é necessário para a via NHEJ de reparo do DNA, que se junta LAP. Como a capacidade de reparo do DNA está intimamente ligada à radiossensibilidade, NU7026, um inibidor da DNA-PKcs específico, poderia aumentar a radiossensibilidade por interferir com a reparação de LAP mediadas por NHEJ. No entanto, sem perda significativa da capacidade de reparo do DNA foi detectado em ambas as células tratadas com 10 mM NU7026 após 1 Gy de irradiação de carbono-ion. Além disso, PLDR não restaurou a inactivação celular de células de ADN-PKcs inibidas conforme medido pela fracção de sobrevivência, o que indica que a DNA-PKcs poderia afectar radiossensibilidade através de uma via alternativa independente do seu papel na reparação de danos no DNA (Figura 3).

A. A fracção de sobrevivência das células irradiadas, após 24 horas de recuperação; B. A cinética de DNA reparar danos após 1 Gy de irradiação de carbono-ion com /sem tratamento NU7026, medida pela amplificação relativamente longo PCR.

DNA-PKcs Inibição Resultou em acelerado Redução comprimento dos telômeros depois de Carbono -ion ​​irradiação

o comprimento do telômero é um fator crítico para o início da senescência celular. Para investigar se a senescência induzida por radiação é devido à redução do comprimento dos telómeros, PCR em tempo real foi usada para determinar a quantificação relativa do comprimento dos telómeros. Como mostrado na Figura 4, células MCF-7 cultivadas com NU7026 exibiu nenhuma perda significativa de telómeros; No entanto, o comprimento dos telômeros em células irradiadas de carbono-íon diminuiu gradualmente dentro de 30 dias. Em particular, o comprimento dos telómeros nas células tratadas com a combinação de irradiação e NU7026 carbono-ião diminuiu mais severamente. Esta perda acelerada dos telómeros poderia explicar o aumento da senescência visto em células 30 dias após a irradiação.

células MCF-7 foram incubadas com NU7026 10 uM. *: P 0,01 versus controlo;

#:. P 0,01 versus 1 Gy de irradiação de carbono-ion

Curtas Telômeros causada Celluar Inactivação após Carbon-ion Irradiação

Para determinar se o encurtamento do telômero foi a causa da inactivação celular após a irradiação de iões de carbono, as células MCF-7 e HeLa com telómeros mais curtos foram estabelecidas através de incubação contínua com a MST312 inibidor de telomerase. Um ensaio de citotoxicidade demonstrou que 2 uM MST312 não conduziu a paragem do crescimento significativa em comparação com o controlo (Figura 5A-B). encurtamento significativo do comprimento dos telómeros foi detectada em células MCF-7 depois de 50 dias e em células HeLa após 30 dias de incubação contínua com MST312 (Figura 5C). (Figura 5B). ß-galactosidase coloração histoquímica revelou que, enquanto a senescência menor foi detectada em células MCF-7 depois de 50 dias de co-incubação com MST312 (Figura 5C), 1 Gy de irradiação de iões de carbono induzida senescência extensa nestas células (Figura 5D). radiação carbono-ião induzida elevado nível de apoptose em células HeLa com mais curto do telómero (Tabela 2).

o acompanhamento em tempo real do crescimento e proliferação de células MCF-7 e HeLa na presença de MST312 utilizando a RT plataforma -CES. B. comprimento dos telómeros Relativa em células MCF-7 e HeLa após prolongada incubação MST312. C. senescência das células MCF-7 50 dias após MST312 de incubação; D. senescência das células MCF-7 com telômeros mais curtos 5 dias após 1 Gy de irradiação de carbono-ion.

Discussão

Uma das diferenças importantes entre os de alta LET e de baixo LET radiação é que a radiação de alta LET produz mais densamente distribuída e clusters de LAP que low-LET radiação. Tem sido sugerido que seria mais difícil para o sistema de reparação de ADN celular para reparar danos no ADN agrupado [12], [13]. Existem dois principais mecanismos de reparação de DSB em células de mamíferos: NHEJ e recombinação homóloga (HR). Acredita-se que a via NHEJ é dominante reparação de DSB em células de mamíferos [14] – [17]. No entanto, os fragmentos de ADN curtos induzidas por irradiação de iões pesados ​​foram relatados para inibir o processo de NHEJ [18]. Além disso, de íons pesados ​​irradiação induzida LAP complexos que são pensados ​​para ser reparado por HR [19]. Assim, o efeito inibidor adicional de NHEJ poderia ter imposto um efeito limitado sobre a reparação de carbono-ion danos no DNA induzidos por irradiação em nosso experimento. A inibição de ADN-PKcs abrandou a cinética de reparação do ADN no nosso estudo e pode ter sido devido à cinética de reparação de ADN mais lentas de HR, em comparação com o processo de NHEJ. Como o dano ao DNA foi eventualmente reparado dentro de 24 horas após a irradiação, a radiossensibilidade reforçada poderia ter sido causado por outros factores, tais como o encurtamento dos telómeros crítica. Drissi et.at. informou que telômeros curtos induzir a estrutura da cromatina alterações que limitam o acesso de activado ATM aos seus alvos a jusante na cromatina, que pode contribuir para o aumento da sensibilidade à radiação visto com o encurtamento do telômero [20]. A irrelevância do reparo NHEJ a radiossensibilidade também ficou evidente em nossos dados PLDR, o que demonstra que, apesar de a maior parte do dano ao DNA foi reparado após 24 horas de incubação, a inibição DNA-PKcs ainda pode levar a célula de sobrevivência menor.

Sabatino et.al sugeriu que telomere encurtar após a irradiação pode representar um importante mediador entre a exposição a radiação, formação de ROS e dano vascular [21]. O aumento marcado na sensibilidade à radiação com a inibição de ADN-PKcs poderia ter sido causado pelo o outro papel de ADN-PKcs, que actua como uma proteína de ligação dos telómeros [22]. DNA-PKcs revogação pode levar a uma taxa mais rápida de degradação dos telómeros, devido à sua interacção com a telomerase na manutenção dos telómeros [23]. Os estudos mostraram que a DNA-PKcs também foi envolvida na extremidade do telómero protecção. As características de disfunção do telómero com a inibição de ADN-PKcs tem sido extensivamente estudada por Bailey SM et.al. [24], [25]. Estes autores demonstraram que os telómeros não niveladas com DNA-PKcs são inadequadamente detectado e processado como LAP, participando assim em eventos de fusão telômero-DSB induzida por radiação ionizante.

Como um componente crítico no telômero final de nivelamento [26], inibição de DNA-PKcs pode perturbar o acesso correto de telomerase aos telômeros, resultando em encurtamento dos telómeros. Uma vez que a maioria das células cancerosas abrigar telómeros mais curtos do que as células normais, os telómeros são mais susceptíveis de ser reduzido a um comprimento crítico se a telomerase é disfuncional. No presente estudo, acelerado encurtamento dos telómeros foi detectada nas células após a irradiação de iões de carbono DNA-PKcs-inibida em células MCF-7, acompanhada por grande senescência celular. Não podemos detectar encurtamento dos telómeros nas células HeLa após carbono-ião com a inibição de ADN-PKcs, devido à sua incapacidade para a proliferação contínua. A apoptose significativa em células HeLa poderia ser mediada por resposta a danos no ADN. No entanto, o ensaio damge DNA revelou que o dano ao DNA foi eficientemente reparado dentro de 24 horas após a irradiação. Desde ADN PKcs não participou apenas em DNA dupla reparação estande, mas também agir como um elemento crucial para o final do telômero nivelamento, é possível, portanto, que a resposta de danos ao DNA foi induzida por telômero disfuncional. Com o estabelecimento de HeLa e células MCF-7 abrigava mais curto do telômero, confirmou-se que a disfunção dos telômeros poderia contribuir para a inactivação celular de células cancerosas após a irradiação de carbono-ion. Estes resultados fornecem evidências de que a inibição DNA-PKcs pode resultar em radiossensibilização devido ao seu papel crítico no final dos telômeros de nivelamento.

Em conclusão, constatamos que NU7026 sensibilizado significativamente células MCF-7 e HeLa à irradiação de carbono-ion. Este aumento da radiossensibilidade foi pouco provável causada por incompleta reparação de danos no DNA, mas por disfunção dos telômeros. Nossos resultados fornecem evidências que sugerem que a segmentação da proteína de protecção das extremidades dos telômeros poderia ser uma forma eficaz de tratamento de câncer de mama.

Reconhecimentos

Os autores gostariam de agradecer Programa de Cooperação Externa da Academia Chinesa de Ciências, Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência e Nacional de Programa Cooperativo de Pesquisa. Os autores também agradecer Ms. H. Arai e Ms. M. Nakajima para a sua assistência técnica ao longo do estudo.