Abstract

Fundo

Como uma proteína quinase serina /treonina, p70S6K desempenha um papel importante nas células tumorais. Evidência revelou a sobre-expressão de p70S6K e p70S6K fosforilado (p-p70S6K) em vários tecidos tumorais, com estas proteínas identificadas como marcadores de prognóstico independentes no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Neste estudo, nós exploramos o papel do inibidor específico p70S6K PF-4708671 em NSCLC.

Métodos

Três linhas de células NSCLC (A549, SK-MES-1, e NCI-H460) foram tratados com PF-4708671 em cinco concentrações diferentes, incluindo 0,1 uM, 0,3 uM, 1 uM, 3 um e 10 �, e os níveis de proteína foram determinadas por Western-blot. Em seguida, foram avaliados os efeitos PF-4708671 de ambos

in vitro

(proliferação celular, apoptose, a distribuição do ciclo celular e invasão) e

in vivo

.

Resultados

os níveis de p-p70S6K ea jusante efetoras S6 expressão foram significativamente reduzidos pela PF-4708671. Diametralmente oposta, os níveis de proteína a jusante do BAD, Caspase3 e ERK tinham aumentado após o tratamento com PF-4708671. Além disso, a PF-4708671 proliferação celular drasticamente inibida e capacidade de invasão no A549, células NCI-H460 SK-MES-1 e

in vitro

, causando interrupção do ciclo celular na fase G0-G1. Foram observados efeitos limitados da PF-4708671 na apoptose nas três linhas de células NSCLC avaliados. Importante, PF-4708671 pode inibir a tumorigénese em ratinhos nus

in vivo

.

Conclusão

Estes resultados demonstraram que a PF-4708671 p70S6K inibidor específico tenha efeitos inibidores sobre NSCLC tumorigênese

in vitro

e

in vivo

. Portanto, p70S6K deve ser considerada um novo alvo terapêutico potencial e PF-470867 pode ser utilizado como fármaco alvo para tratamento de câncer

Citation:. Qiu ZX, Sun RF, Mo XM, Li WM (2016) O p70S6K inibidor específico PF-4708671 impede não-pequenas células Crescimento do câncer pulmonar. PLoS ONE 11 (1): e0147185. doi: 10.1371 /journal.pone.0147185

editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha

Recebido: 17 de novembro de 2015; Aceito: 30 de dezembro de 2015; Publicação: 15 de janeiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Qiu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (No. 81372504), o Programa de Apoio à Ciência e Tecnologia da Ciência e Tecnologia Departamento de Sichuan província (2014SZ-0148), e do Programa de Cooperação Internacional da Ciência e Tecnologia Departamento da província de Sichuan (2014AA022202-2)

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Fundo

o cancro do pulmão, uma das neoplasias mais comuns, é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, com as mais altas taxas de morbidade e mortalidade na China. Mais de 80% dos pacientes com cancro do pulmão são diagnosticados como o cancro do pulmão de células não pequenas [1]. Apesar de terapia de combinação com a ressecção cirúrgica, quimioterapia, radioterapia e terapia biológica-alvo, a taxa de sobrevida em 5 anos global de câncer de pulmão é de apenas 16%, variando de 52,2% a 4% em pacientes em estágio locais e distantes, respectivamente [2]. Portanto, a identificação de novos alvos e elucidação de alterações a nível molecular poderia ser benéfico para o tratamento do cancro do pulmão.

Como uma proteína quinase serina /treonina da família AGC quinase, p70S6K é fosforilada por diferentes factores de crescimento e insulina -como factores através da via PI3K /mTOR, e interage com S6, eIF4B, eEF2K, PDCD4 e muitos outros substratos; isto é importante para a proliferação induzida por mitogénios de células, a sobrevivência, a motilidade e a resistência à droga de quimioterapia em células cancerosas [3]. Estudos recentes demonstraram que a sobre-expressão de P-p70S6K e p70S6K em vários tecidos tumorais é importante na previsão de mau prognóstico, e contribui para a resistência à quimioterapia [4-14].

In vitro

superexpressão de p70S6K promove a proliferação celular, angiogênese e supressão de apoptose [15, 16]. Enquanto isso, S6K1 knockdown inibe a expressão p70S6K e reduz significativamente a proliferação de células, diminuindo a formação de tumores em ratinhos nus [17]. Além disso, os níveis de p70S6K e p-p70S6K são significativamente maior nos tumores do que nos tecidos normais dos pacientes com NSCLC [18, 19]. O nosso estudo anterior mostrou que a P-p70S6K está intimamente relacionado com a sobrevivência a longo prazo em NSCLC [20]. Portanto, p70S6K desempenha um papel importante no NSCLC, e avaliação de alta especificidade inibidores p70S6K poderia ajudar a definir melhor este novo alvo terapêutico para aplicação clínica.

Os estudos atuais de terapias-alvo para o câncer se concentram principalmente em inibidores de mTOR [20] , enquanto obras avaliando especificamente inibidores p70S6K no tratamento do câncer de pulmão são limitados [21-25]. Este estudo incidiu sobre os p70S6K inibidor específico PF-4708671 para avaliar os efeitos da inibição p70S6K em NSCLC [22].

Métodos

1. PF-4708671 (C

19H

21F

3N

6)

PF-4708671 (# 559273 Calbiochem, MERCK, EUA) é um inibidor da S6K1 (Ki = 20 nM ; IC50 = 160 nM). 10 mg de PF-4708671 foram completamente dissolvidos em 1 ml de DMSO e armazenadas a -80 ° C durante

in vitro

experiências. Para

In vivo

ensaios, PF-4798671 foi dissolvido em 10% de DMSO em primeiro lugar e em seguida diluído em 30% PEG 400, 0,5% de Tween 80 e 5% de propileno glicol, para se conseguir uma concentração final de DMSO de 1%.

2. cultura de células

Três linhas celulares de cancro de pulmão não pequenas células foram obtidas a partir Type Culture Collection da Academia Chinesa de Ciências, e cultivadas de acordo com as recomendações do fornecedor. Incluíram, NCI-H460 (carcinoma de células grandes), e SK-MES-1 (carcinoma de células escamosas), células A549 (adenocarcinoma). Todas as células foram mantidas num ambiente humidificado contendo 5% de CO2 a 37 ° C.

3. Western Blot

As proteínas foram extraídas a partir de células utilizando o kit de extracção de proteína fosforilada (KEYGEN, Nanjing, China), e as concentrações foram medidas usando o BCA Protein Assay Reagent (Thermo Scientific, Rockford, EUA). Quantidades iguais de proteína a partir de várias amostras foram separadas por electroforese de sódio dodecil sulfato-poliacrilamida gel (SDS-PAGE) e em fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billeraica, EUA) transferiu-eletro. Em seguida, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com anti p70S6K-R365, anti-P-p70S6K T389, anti-proteína de ribossoma S6 A229 (# BS1568, # BS4440, # BS3610, 1; 1000, Tecnologia Bioworld, Nanjing, China ), anti-Bad, anti-Caspase3, anti-ERK (# 9239P, # 96625, # 3552S, 1: 1000, Cell Signaling Technology), e anti-β-actina (# 4970, 1: 5000, Cell Signaling Technology) anticorpos, respectivamente. As proteínas alvo foram detectadas utilizando o sistema ChemiDoc XRS (Bio-Rad, Filadélfia, EUA) após a exposição ao substrato de HRP quimioluminescente (Millipore, Billerica, EUA). Os dados foram analisados ​​com o Um software de análise 1-D Quantidade (Bio-Rad).

4. A proliferação celular ensaio

proliferação celular de linhas celulares de NSCLC foi medida utilizando contagem celular Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japão) de acordo com o protocolo do fabricante. As células de tumor foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 x 10

3 por poço. Após a incubação em presença de PF-4708671 (0,1 uM, 0,3 uM, 1 uM, 3 um e 10 uM) durante 24, 48 e 72 horas, respectivamente, a proliferação celular foi avaliada. DMSO tratadas ou células não tratadas foram usadas como controlos negativos. Além disso, o marcador de proliferação celular Ki-67 foi examinada por imuno-histoquímica em tecidos tumorais nus.

5. Análise do ciclo celular

para cada linha celular, aproximadamente 1 × 10

6 as células foram recolhidas após o tratamento com 10 uM PF-4708671 para 24h; distribuição do ciclo celular foi avaliada utilizando Kit de Detecção de Ciclo Celular (Keygen, Nanjing, China); conteúdo de ADN foram determinadas com um citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, EUA). Os dados foram analisados ​​usando o software CellQuest e Modfit.

6. invasão celular

invasão celular foi avaliada utilizando o kit de ensaio de invasão de células de Millipore (# ECM550, Millipore, EUA) de acordo com as instruções do fabricante, após o tratamento com PF-4708671 a 10 uM, durante 24 h. As suspensões de células contendo 1 × 10

6 células /ml foram semeadas sobre a câmara superior com meio suplementado com 1% de soro. Meios contendo 20% de FBS foram adicionados às câmaras inferiores.

7. Celular apoptose

Cerca de 5 x 10

5 células foram colhidas após o tratamento com PF-4708671 a 10 � durante 24 horas, e coradas com anexina V-APC /7-AAD Apoptosis Detection Kit (KeyGen, Nanjing, China ) de acordo com o protocolo do fabricante. A fluorescência foi medida com um citómetro de fluxo FACSCalibur. células de Anexina V-positivos e negativos 7AAD considerados apoptótica. Além disso, o método de TÚNEL foi usada para determinar a apoptose em tecidos de tumor de xenoenxerto.

8.

In vivo

efeitos da PF-4708671 em um modelo de xenotransplante ratinho nu estabelecida com células H460

H460 células, que mostrou a maior taxa de crescimento, foram selecionados para

in vivo

experimentos. camundongos nu feminino (4 semanas, de 18 a 20 g) foram adquiridos a partir de Pequim WeiTongLiHua animal experimental co técnica., LTD. (China), e alojados no Centro de animal de West China Sichuan University, com uma luz 12h ciclo escuro /12h. Todos os experimentos foram realizados em SPF condições (Especial Pathogen Free). Os ratinhos foram divididos aleatoriamente em três grupos e cada grupo continha três ratinhos (n = 3 /cada grupo). Os pontos finais de observação foram como se segue: 1) o diâmetro dos tumores 3 centímetros; 2) tumores transplantados teve necrose e /ou decomposição; 3) a morte natural. O método de sacrifício no final da investigação foi decapitado vivo após a anestesia, sob a premissa de sem outros ratinhos podia ver. No Grupo 1 (grupo de H460), 1 × 10

7 H460 células foram injectadas subcutaneamente em ratinhos. Grupo 2 (controle negativo, grupo NC) animais foram injetadas células como no Grupo1; três dias mais tarde, eles foram administrados por via intraperitoneal 200 uL de mistura de solvente (1% de DMSO, 30% de PEG 400, 0,5% Tween 80 e 5% de propileno glicol) diariamente durante 1 semana. No grupo 3 (H460 + PF4708671 grupo), os murganhos foram tratados como descrito para o Grupo 2, com 200 ul PF4708671 (50 mg /kg) em vez da mistura solvente. tamanhos tumores foram medidos diariamente durante mais de uma semana (tempo = um diâmetro; diâmetro = curta b), e os volumes foram obtidos como se segue: V = Ab2 /2. taxa de inibição de tumor = [(tumor controle de peso-experimental peso do tumor) /controle de peso do tumor] x 100%. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética de West China Hospital.

9. A análise estatística

Os dados foram processados ​​pelo Microsoft Excel 2010. Usando o SPSS 19.0 software, t-teste e um way-ANOVA foram aplicados para análise de dados. Os dados são média ± SD, e dois lados

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados de

1. PF-4708671 inibe p70S6K e S6 fosforilação

Os resultados revelaram que os p70S6K inibidor específico PF-4708671 reduziu significativamente a fosforilação de p70S6K e sua S6 jusante para 0,1 uM (

P Art 0,05) ; Os níveis de expressão de p-S6 diminuiu com o aumento das concentrações da droga (

P

0,05). Nos níveis contrárias, proteína de Bad a jusante, Caspase3 e ERK foram aumentadas após o tratamento com PF-4708671 com a concentração de 1 uM. No entanto, os níveis de proteína total p70S6K e S6 não apresentaram diferenças significativas entre os grupos de controle e tratamento negativos (Fig 1, Arquivo S1).

1. os níveis de expressão da proteína de p70S6K, p-p70S6K, S6, e p-S6 após o tratamento com várias concentrações da droga. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. 2. As expressões de proteína níveis de p-p70S6K e p-S6 sob diferentes concentrações da droga.

P Art 0,05: grupo de tratamento de drogas vs grupo controle negativo. N, controle negativo; Um, H460; B, A549; C, SK-MES-1.

2. PF-4708671 inibe a proliferação de células NSCLC

CCK-8 Os dados do ensaio mostraram que as capacidades de proliferação das três linhas de células NSCLC foram significativamente inibidas por PF-4708671. Após 24 horas de tratamento, PF-4708671 inibiu a proliferação de células H460 a 10 uM e os valores A549 e SK-MES-1 de células foram significativamente reduzidos em 3 um e 0,1 uM, respectivamente, (

P

0,05). Além disso, H460, A549 e SK-MES-1 taxas de crescimento celular foram significativamente inibido pela PF-4708671 a 0,3 uM, 0,1 uM e 0,1 uM, respectivamente, 48 horas após o tratamento (

P Art 0,05). Todas as linhas de células mostraram uma redução significativa a proliferação em 72 horas após o tratamento com 0,1 uM PF-4708671 (

P

0,05). tempo- significativa e dependente da concentração de inibição da proliferação celular foi observada em todas as linhas de células (

P

0,05).

Proliferação taxa de inibição = [1 (Figura 2) – (grupo experimental valores – valor em branco) /(valor negativo grupo controle -. valor em branco)] × 100%

3. PF-4708671 afecta ciclo celular NSCLC

Após a coloração do ADN pela PI, citometria de fluxo análise mostrou a paragem do ciclo celular na fase G0 /G1 para todas as três linhas celulares de NSCLC (

P

0,05). Enquanto isso, as proporções de células em S e G2 /M fases foram significativamente diminuída em células A549 (

P

0,05). Além disso, quantidades reduzidas de fase S (H460) e de células G2 /M fase (SK-MES) foram também detectados (

P

0,05). (Fig 3)

(* p . 0,05, grupo de tratamento de drogas vs grupo controle negativo)

4. PF-4708671 inibe significativamente a invasão de células

PF-4708671 capacidade invasão inibida nas três linhas de células NSCLC avaliada. De fato, os números médios de células que passam através do gel matriz extracelular foram significativamente menores nos grupos de tratamento do que nos controles negativos (

P Art 0,05), com taxas de inibição de invasão de 75,90%, 46,23% e 82,73%, para H460, A549 e SK-MES-1 células, respectivamente (Fig 4).

5. PF-4708671 aumenta célula NSCLC apoptose

PF-4708671 mostrou efeito limitado sobre a apoptose nas três linhas de células NSCLC, apesar de diferenças estatisticamente significativas foram obtidos (

P Art 0,05). Comparado com os grupos de controlo negativo, as taxas de apoptose para H460, A549 e SK-MES-1 As linhas celulares foram aumentadas por 1,537%, 2,483% e 3,475%, respectivamente, (

P

0,05) (Figura 5).

6. PF-4708671 inibe tumorigênese

in vivo

Todos os tumores transplantados foram cultivadas com sucesso em cada rato, e todos os ratos não têm sinais de miscomfort e /ou sofrimento até que colocá-los à morte. As tendências de volume de tumor em ratinhos nus para cada grupo estão resumidas na Tabela A em Ficheiro S1 e S2 Fig. Os animais tratados com o inibidor específico p70S6K PF470867 mostrou o crescimento do tumor abertamente inibido em comparação com o Grupo 1 (H460) e Grupo 2 (NC) (todo o

P Art 0,05). Como se mostra na Tabela B em Ficheiro S1 e S3 Fig, pesos e volumes dos tumores excisados ​​foram inferiores após o tratamento com PF470867 em comparação com valores de controlo (

P

0,05). Além disso, a proliferação celular, tal como expresso por Ki-67, foi significativamente reduzida no grupo H460 + PF4708671 em comparação com os valores obtidos para os dois grupos de controlo. Finalmente, TUNEL coloração demonstrou significativamente maior taxa de apoptose de células tumorais no Grupo 3, em comparação com o controlo (Grupos 1 e 2) valores (Figura 6). Células

As setas mostram positivamente coradas. ampliação original, × 400.

Discussão

p70S6K participa de tumorigenicidade e câncer progressão, mas o mecanismo subjacente o seu efeito não é completamente compreendido. Os estudos que avaliam p70S6K em relação ao NSCLC são escassos; que anteriormente descobriu que p70S6K superexpressão promove a proliferação de células NSCLC, inibe a apoptose celular e melhora a capacidade de invasão. Para entender melhor o papel dos inibidores p70S6K em câncer de pulmão não-pequenas células, o presente estudo avaliou três linhagens de células NSCLC (A549, SK-MES-1, e NCI-H460) tratados com PF-4708671, e avaliadas as mudanças do maligno fenótipos, tais como a proliferação, invasão e evasão apoptose.

como se mostra acima, o inibidor de p70S6K PF-4708671 inibiu significativamente a activação de p70S6K e sua chave efector a jusante S6, de um modo dependente da concentração. Além disso, os níveis de proteína do BAD a jusante; Caspase3 e ERK, afectando a capacidade que a apoptose de células, aumentaram após tratamento com PF-4708671. Isso provou que PF-4708671 pode afetar a sobrevivência das linhagens de células NSCLC ‘regulando os fatores relevantes de apoptose. Além disso, a proliferação de células NSCLC foi tempo e concentração dependente inibida pela PF-4708671, confirmando relatos anteriores [15-17]. Assim, propusemos que a regulação p70S6K está associada a apoptose celular. As diferenças nas concentrações de droga eficazes mínimas para as linhas de células NSCLC avaliadas pode ser devido aos seus níveis p70S6K distintas e taxas de crescimento: encontramos taxa de inibição de crescimento de 30 a 40%

Nossa hipótese é que através da regulação do ciclo celular. , PF-4708671 podem inibir a proliferação celular. Estudos recentes mostraram que S6K1 e p70S6K são críticos para a paragem em G1 [26-28]. Consistentemente, descobrimos que PF-4708671 afectada a distribuição do ciclo celular nas três linhas de células NSCLC avaliadas, retardar significativamente a progressão do ciclo celular na fase G0 /G1. Outro fator importante que afeta a proliferação celular é a apoptose; um ensaio de fase I do LY2584702 avaliar doentes com tumores sólidos avançados não mostrou efeito anti-tumor manifesta por esta droga [25]. Como mostrado acima, PF-4708671 teve efeito limitado sobre a apoptose celular em células NSCLC, com uma taxa de apoptose perto de 3% in vitro. Por isso, assumiu-se que as vias de p70S6K não pode estar envolvida na apoptose celular. No entanto, este estudo também demonstrou que PF-4708671 inibe NSCLC tumorigênese

in vivo

.

p70S6K superexpressão foi mostrado para ser associado com doença agressiva e mau prognóstico no câncer de mama [29]. Nosso estudo anterior mostrou p70S6K superexpressão promove a invasão de células

in vitro

. Curiosamente, PF-4708671 podem inibir a capacidade de invasão de todas as linhas celulares de NSCLC avaliados neste estudo. Em contraste, os estudos em doentes com NSCLC mostraram que a expressão de p-p70S6K não está associada com metástases nos linfonodos e fase do cancro [18-29]. Mais estudos são necessários para confirmar o papel de p70S6K em NSCLC invasão e metástase

in vivo

.

No entanto, ainda tinha algumas limitações em nossa pesquisa. Em primeiro lugar, embora todas as células eram linhas celulares de NSCLC, as fontes foram diferentes. Assim, os nossos resultados não poderiam ser completamente consistente porque pode haver diferentes mecanismos entre os diferentes origens genéticas. Além disso, a quantidade não era grande o suficiente para experimentos de ratinhos nus in vivo. Portanto, os resultados precisam de mais investigação em profundidade para confirmar.

Em conclusão, nosso estudo demonstrou que a p70S6K inibidor PF-4708671 poderia afetar a distribuição do ciclo celular, inibindo a proliferação celular, apoptose e invasão em células NSCLC. Inibir o eixo p70S6K-S6 resultou em actividade antitumoral potente. Portanto, a terapia de combinação com um inibidor da p70S6K e quimioterapia representa uma nova estratégia promissora para o tratamento de NSCLC.

Informações de Apoio

S1 Fig. Os níveis de expressão de proteína de Bad, Caspase3 e ERK após o tratamento com PF-4708671

doi:. 10.1371 /journal.pone.0147185.s001

(TIF)

S2 Fig. tendência de crescimento do volume do tumor em cada grupo de ratos pelados (mm

3)

doi: 10.1371. /journal.pone.0147185.s002

(TIF)

S3 Fig. Comparação de tamanhos de tumor entre grupos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0147185.s003

(TIF)

S1 Arquivo. Tabela A. Tumor crescimento do volume de cada grupo em camundongos nus (, n = 3 /mm

3). Tabela B. Tumor xenoenxertos peso de cada grupo ()

doi:. 10.1371 /journal.pone.0147185.s004

(DOCX)

Reconhecimentos

Graças a professora Mo XM forneceu-nos um bom ambiente e equipamentos de laboratório.