Sumário
Fundo
proteína secretada ácida e rica em cisteína (SPARC), uma glicoproteína matricellular de ligação ao cálcio, está implicada na progressão de muitos cancros. Neste estudo, foi investigada a expressão e função do SPARC no câncer de ovário.
Métodos
análise de cDNA microarray foi realizada para comparar os perfis do altamente invasivo e os subclones invasivos baixos derivados de expressão gênica a linha de ovário humano SKOV3 célula cancerosa. A imuno-histoquímica (IHC) coloração foi realizada para investigar a expressão SPARC em um total de 140 espécimes de tecidos ovarianos. Em ensaios funcionais, foram investigados os efeitos da SPARC knockdown no comportamento biológico das células de cancro do ovário. Os mecanismos de SPARC na proliferação do câncer de ovário, apoptose e invasão também foram pesquisados.
Resultados
SPARC foi overexpressed no subclone altamente invasivo em comparação com a baixa subclone invasivo. a alta expressão de SPARC foi associado com alto estágio, a baixa diferenciação, metástases em linfonodos e pior prognóstico de câncer de ovário. Knockdown de expressão SPARC suprimiu significativamente a proliferação de células de câncer de ovário, a apoptose celular induzida e invasão celular inibida e metástase.
Conclusão
SPARC é abundante no subclone altamente invasivo e tecidos de cancro do ovário e desempenha um papel importante no crescimento do cancro do ovário, apoptose e metástase
Citation:. Chen J, Wang M, Xi B, Xue J, ele D, Zhang J, et al. (2012) SPARC é um regulador chave da proliferação, invasão e apoptose no cancro do ovário humano. PLoS ONE 7 (8): e42413. doi: 10.1371 /journal.pone.0042413
editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América
Recebido: 21 de março de 2012; Aceito: 05 de julho de 2012; Publicação: 03 de agosto de 2012
Direitos de autor: © Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma bolsa-in-aid para a investigação científica (2012TS088) da Universidade Shandong. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de ovário é o segundo câncer ginecológico mais comum e uma das principais causas de morte por câncer em mulheres [1]. Alta porcentagem de pacientes de cancro do ovário são diagnosticados em estágio avançado. Apesar de avanços substanciais foram feitos na pesquisa do câncer de ovário, a sobrevivência a taxa de incidência ainda é pobre e taxa de cura global continua a ser muito baixo [2]. recorrência de tumores e metástases são consideradas as principais razões para pobres mortes clínicas de resultado e câncer [3]. Por isso, estudar o mecanismo de invasão tumoral e metástase fornecerá mais insights sobre o desenvolvimento e progressão do câncer de ovário.
SPARC (proteína secretada ácido e rico em cisteína), também denominado osteonectina, BM-40, e 43 proteína K, é uma glicoproteína matricellular de ligação ao cálcio, cuja função é o de modular as interacções célula-matriz e a função das células sem participar no andaime estrutural da matriz extracelular [4]. Embora há uma crescente evidência para um papel importante para SPARC em uma variedade de cancros, não existe um modelo unificador, o que explica todas as facetas da sua função e contribuição para o desenvolvimento e progressão do cancro [5]. SPARC é diferencialmente expressos em tumores e seu estroma circundante, em vários tipos de cancro, em comparação com o tecido normal. Por exemplo, os níveis mais elevados de expressão SPARC foram relatados no cancro da mama [6], [7], carcinoma hepatocelular [8], [9], o cancro da próstata [10], cancro colorrectal [11], [12], e do ovário câncer [13], [14]. No entanto, uma correlação oposto também foi demonstrada, sugerindo que SPARC pode ser capaz de inibir a tumorigénese ou a progressão do tumor no cancro da mama [15], [16], o carcinoma hepatocelular [17], o cancro da próstata [18], cancro colorrectal [19] , [20], e cancro do ovário [21]. Portanto, a função de SPARC em méritos câncer mais investigação.
No presente estudo, foi realizada a análise cDNA microarray para investigar o perfil do subclone altamente invasivo S1 eo baixo subclone invasiva S21 expressão diferencial de genes, ambos que foram derivadas a partir da linha celular de cancro do ovário humano SKOV3. Descobrimos que muitos genes foram diferencialmente expressos nestes dois tipos de subclones. Particularmente, SPARC foi encontrado para ser significativamente sobre-expresso na altamente invasivo subclone S1 em comparação com os do baixo subclone invasiva S21. Para esclarecer a relação entre SPARC e progressão do câncer de ovário, as expressões de SPARC em amostras de tecido do ovário humano foram medidos por imuno-histoquímica (IHQ). No ensaio de função, por interferência de ARN mediada por lentivírus, que diminuíram a expressão da SPARC no subclone altamente invasivo S1 e HO8910PM para determinar o efeito da SPARC no ovário proliferação de células de cancro, a apoptose, invasão e metástase.
Materiais e linhas celulares métodos
linhas celulares
SKOV3, NIH3T3 e HO8910PM (uma linha de células de cancro do ovário altamente metastático [22]) foram obtidos a partir de Xangai Instituto de Ciências Biológicas, da Academia chinesa de Ciências. O subclone altamente invasiva (S1) e a partir do subclone invasiva (S21) foram derivadas a partir da linha SKOV3 de células de cancro do ovário humano [23]. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 para SKOV3 ou DMEM durante NIH3T3 e HO8910PM suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e antibióticos (Gibco BRL, Rockville, MD).
Microarray Analysis
o ARN total foi extraído a partir do sub-clone altamente invasiva (S1) e a partir do subclone invasiva (S21) utilizando RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). ARN qualidade foi avaliada através de espectrofotometria e de electroforese em gel desnaturante. O ARN foi amplificado e marcado utilizando o kit de rotulagem da Agilent Breve Amp e hibridado com Agilent todo genoma oligo microarray. As lâminas foram digitalizados usando scanner de DNA microarrays Agilent. Os dados foram processados usando Agilent recurso de extração de Software (versão 10.5.1.1) e analisados utilizando software Agilent GeneSpring GX (versão 11.0). Os experimentos foram realizados em triplicado.
Tecido Os espécimes
As amostras de tecido foram obtidos com o consentimento informado por escrito de 80 mulheres com cancro epitelial do ovário (com 29 cystadenocarcinoma serosa, 25 cistoadenocarcinomas e 26 de carcinoma endometrioid ), a partir de 35 mulheres com tumor de ovário benignos e, a partir de 25 de tecido do ovário de controlo normal no Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Shandong Hospital Provincial, entre 2005 e 2007. Todos os pacientes com câncer ovariano foram clinicamente classificados de acordo com o sistema de estadiamento FIGO [com 38 tumores estágio de baixa (FIGO fases I e II) e 42 tumores alto estágio (FIGO estágios III e IV)]. Nenhum dos pacientes com câncer ovariano recebeu radiação pré-operatória ou quimioterapia. O estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Ética Médica da Universidade de Shandong.
imuno-histoquímica (IHQ)
De acordo com procedimentos complexos de estreptavidina-biotina-peroxidase padrão, IHC foi realizada em fixado em formol e parafina seções -embedded (5 mm de espessura) e slides de células fixadas em paraformaldeído a 4%. Resumidamente, depois desparafinação, de re-hidratação, e recuperação de antigénios, as secções foram incubadas com anticorpo SPARC anti-humano (AF941, R D Systems e BS-1133R, BIOS) com diluição de 15 ug /ml para AF941 e 10 ug /ml para trabalhar BS-1133R a 4 ° C durante a noite. O anticorpo secundário foi a peroxidase de rábano conjugada com IgG anti-cabra para AF941 e IgG anti-coelho de BS-1133R. Um controlo negativo foi obtido por substituição do anticorpo primário com imunoglobulina normal de coelho (IgG). A expressão positiva da proteína SPARC foi definido como a presença de grânulos no citoplasma castanhos ou estroma.
(A) Gráfico de dispersão que mostra os valores de dobragem com as alterações em comparação com os valores de p para a visualização de expressão diferencial entre a baixa altamente invasivo e invasivo clones. As linhas verticais representam 1,5 vezes para cima e para baixo-regulação, respectivamente. A linha horizontal representa um valor P de 0,05. Os pontos vermelhos na trama representam os genes diferencialmente expressos com significância estatística. (B, C, D) expressão SPARC como medido por Western blot (B), Q-RT-PCR (C), e imuno-histoquímica (D) (ampliação de × 200). * P . 0,05
imuno-histoquímica (IHQ) Análise
Um sistema de pontuação semi-quantitativa com base na intensidade de coloração e distribuição de células positivas foi usado para avaliar a expressão de SPARC [24]. A intensidade de coloração SPARC positivas variou de 0 a 3 (negativo = 0, fraco = 1, moderado = 2, ou forte = 3) e a percentagem de células coradas positivamente foi pontuada como 0 (0%), 1 (1 a 25 %), 2 (26-50%), 3 (51-75%) e 4 (76-100%). A soma da pontuação de intensidade e porcentagem foi usado como a pontuação final de marcação (0 a 7). A soma-índices (-), (+), (++), e (+++) indicou pontuação final coloração de 0, 1-3, 4-5, e 6-7, respectivamente. Para a análise estatística, soma-índices (-) e (+) foram definidos como baixa expressão SPARC, enquanto soma-índices (++) e (+++) foram definidos como alta expressão SPARC. Cada seção foi submetida à avaliação individual por dois patologistas. Se uma inconsistência ocorreu, um terceiro patologista foi consultado para alcançar consenso.
Peptide ensaio de bloqueio
Para testar a especificidade do anti-SPARC, o anticorpo foi incubada durante a noite a 4 ° C com SPARC recombinante humano (941-SP, R D Systems). A imuno-histoquímica foi então realizada tal como descrito acima, mas o bloqueio anti-SPARC foi usado como anticorpo primário.
(A) humana normal do tecido do ovário usando AF941 anticorpo, (B), tumor ovariano benigno usando AF941 anticorpo, (C) A alta diferenciação de carcinoma do ovário usando AF941 anticorpo, (D) diferenciação Médio de carcinoma do ovário usando AF941 anticorpo, (E) baixa diferenciação de carcinoma do ovário usando AF941 anticorpo, (F), o tecido do ovário humano normal usando BS-1133R anticorpos, (L) benignos tumorais do ovário BS-1133R usando anticorpos, (H) A alta diferenciação de carcinoma do ovário usando BS-1133R anticorpos, (I) diferenciação Médio de carcinoma do ovário usando BS-1133R anticorpos, (J) de baixa diferenciação de carcinoma dos ovários utilizando o anticorpo BS-1133R ( ampliação × 200). Setas pretas indicam citoplasma de células coradas, setas vermelhas indicam estroma coradas.
em tempo real quantitativa de RT-PCR (Q-RT-PCR)
O RNA total foi extraído usando o reagente Trizol ( Invitrogen) e reverteu transcrita. A análise de PCR quantitativa em tempo real foi realizado utilizando ABI PRISM 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Cada poço (volume de reacção de 20 ul) continham 10 uL de alimentação de SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 1 ul de cada iniciador (5 umol /L) e 1 uL de ADNc molde (50 ng /ul). Os iniciadores (tabela 1) foram concebidos por software iniciador 5 e sintetizados pela Takara Biotecnologia (Dalian) Co., Ltd.
Western Blot
As células foram lisadas em tampão RIPA contendo PMSF 1 mM. Cinquenta microgramas de proteína por faixa foram separados por SDS-PAGE e transferidas para membrana de PVDF e bloqueadas com BSA a 5%. As membranas foram incubadas primeiro com o anticorpo primário contra SPARC, PCNA, ciclina D1, P53, P21, Bax e Bcl-2 em 1:1000 diluições dia para o outro, e, em seguida, incubadas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano de cabra anti-IgG ou anti-murganho durante 1 hora à temperatura ambiente, as manchas foram desenvolvidas utilizando o método ECL. intensidade da banda foi analisada utilizando Gel-Pro Analyzer Software (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD).
RNA Interferência
Auto-inativação de lentivírus vetor (GeneChem, Xangai, China) contendo uma repórter GFP conduzido por CMV e um promotor U6 a montante dos locais de clonagem (idade I e Eco RI) foi usado para a clonagem de pequenas hairpin RNAs (shRNAs). A sequência-alvo para SPARC foi 5′- AACAAGACCTTCGACTCTTCC-3 ‘; a sequência de controlo negativo foi 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘. As células subclone altamente invasivos (S1 e HO8910PM) foram cultivadas em placas de seis poços de cultura de tecidos e infectadas com lentivírus a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100, durante 24 h. Em seguida, o meio foi substituído com meio completo fresco. Após 4 dias, as células foram observadas ao microscópio de fluorescência para confirmar que mais de 80% das células foram positivas para GFP.
Ensaios de Proliferação de Células
A proliferação celular foi determinada pela utilizando o ensaio de MTT e macio independente da ancoragem em ágar de formação de colónias. Para o ensaio de MTT, 20 ul de MTT (5 mg /ml em PBS) foi adicionado directamente em cada poço da placa de 96 poços e incubou-se a 37 ° C durante 4 h. Em seguida, removeu- se o meio e 200 uL de DMSO foi adicionada para dissolver cristais de formazano. A densidade óptica a 570 nm foi lida com um leitor de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Para o ensaio de formação de colónias em agar mole, 500 ul de 2 × DMEM suplementado com FBS a 20% foi misturada com 500 ul de 1,2 % Mar praga de agar solidificado e em cada poço de uma placa de 24 poços para formar a camada de agar de base. Para camada de agar de topo, 25 uL de células (5 × 10
3 /ml) foram misturados com 500 ul de DMEM e 2 × 500 uL de 0,7% de agar e Mar praga adicionado no topo da camada de agar de base. Depois de crescido, durante 14 dias, a formação de colónias foi monitorada por microscopia. Um conjunto de dez ou mais células foi definida como uma colónia.
Anexina V-PI Ensaios de apoptose
As células foram recolhidas e lavadas duas vezes com PBS, suspensas em 200 uL de tampão de ligação e 10 uL Anexina V-FITC durante 20 minutos no escuro, e em seguida tampão, a ligação 300 mL e 5 mL de iodeto de propidio (PI) foram adicionados a cada amostra. As células apoptóticas foram determinados utilizando um citómetro de fluxo (Becton Dickinson) com o software CellQuest (Becton Dickinson).
Análise do Ciclo Celular Distribuição
As células foram colhidas, lavadas com PBS arrefecido em gelo, e coradas com 50 ug /ml de PI e 250 ug /mL de ARNase durante 30 minutos. A percentagem de células em cada fase do ciclo celular foi determinada com um ensaio ADN ModFit LT2.0 programado por computador (Becton Dickinson) utilizando um citómetro de fluxo.
invasão celular e Ensaio de Migração Ensaio
ensaio de invasão foi realizada como descrito anteriormente [25]. Cada Transwell (BD Biosciences, Bedford, MA) foi revestida com 50 uL de diluição de 1:03 de Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA). As células (0,2 x 10
6) foram ressuspensas em meio isento de soro de 200 ul e semeadas para dentro da câmara superior. O meio condicionado de cultura de células NIH3T3 foi filtrada e adicionada à câmara inferior, como um factor quimiotáctico. Após 12 h, as células remanescentes na superfície superior não-invasoras foram removidos, e as células na superfície inferior foram fixadas, coradas com hematoxilina e eosina (H E), e contadas. Ensaio de migração celular também foi realizada utilizando Transwells sem revestimento de Matrigel. Cada experiência foi realizada pelo menos em triplicado. Invadindo e número de células migração de câmaras de Boyden foram contados e os dados foram expressos como média ± SE.
(A) de tecido ovariano humano normal, (B) tumor ovariano benigno, (C) A alta diferenciação de carcinoma de ovário, (D) Meio diferenciação de carcinoma do ovário, (E) baixa diferenciação do carcinoma do ovário (ampliação x 200). análise (F) de Kaplan-Meier sobre a sobrevida global dos pacientes cujos tumores tinham alta ou baixa expressão SPARC.
xenoenxertos de tumores em ratinhos nus
BALB /C-nu /nu ratinhos nus femininos 5 semanas de idade foram adquiridos a partir do Centro Nacional de Recursos para Rodent Laboratory animal da China. Cinco ratinhos nus foram injectados subcutaneamente com 5,0 × 10
6 células, e dez ratinhos nus foram injectados através da cauda veias com as mesmas células, uma vez por semana durante 3 semanas consecutivas. Os ratinhos foram mantidos numa instalação para animais estéril e monitorizados para o crescimento do tumor. Os volumes dos tumores foram monitorizados nos tempos indicados e calculada de acordo com a fórmula: 0,5 x comprimento x largura
2. Após 3 meses, os murganhos foram sacrificados e o tumor e pulmão foram dissecados e examinados histologicamente. As secções de parafina de os tecidos do pulmão foram feitas, coradas com hematoxilina e eosina (H E) e observados sob um microscópio. Os valores médios foram expressos como média ± SE. Este experimento animal foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal da Universidade de Shandong e estava em conformidade com todas as diretrizes regulamentares.
(A) a expressão da proteína SPARC em células infectadas por lentivírus como medido por Western Blot. (B) a expressão de ARNm em células infectadas SPARC-lentivírus como medidos por Q-RT-PCR. a expressão da proteína (C) SPARC em células infectadas com lentivírus tal como medida por coloração IHC (ampliação x 200). * P . 0,05 versus controlo
Análise de citometria de fluxo
As células em fase log foram recolhidas e ajustadas para uma densidade de 1~5 × 10
6 /ml com PBS e, em seguida coradas com 20 ul de fluoresceína isotiocianato (FITC) -conjugated anticorpos monoclonais durante 30 min a 25 ° C. Todos os anticorpos, incluindo β1 anti-integrina, β3 anti-integrina e anti-E-caderina foram adquiridos a BD Biosciences Pharmingen (San José, CA, EUA). Finalmente, as células coradas foram analisadas por um citómetro de fluxo. A análise dos dados foi realizada utilizando o programa WinMDI. O teste foi realizado em quadruplicado.
Ensaio de Actividade de MMP por zimografia
O ensaio de actividade de metaloproteinases de matriz foi realizada em gel de SDS-PAGE a 10% contendo 0,1 mg /mL de gelatina. 20 ug de proteína da amostra foi colocada em cada faixa de gel de SDS-PAGE. Após a electroforese, o gel foi lavado duas vezes com 2,5% de Triton X-100 durante 1 h à temperatura ambiente para remover o SDS e incubadas a 37 ° C durante durante a noite em tampão de reacção (50 mmo1 /L de Tris-HCl pH 7,4, 8,775 g de NaCl e 1.ll g CaCl
2). Após coloração com azul brilhante, a actividade MMPs Coomassie foi identificado como zonas claras contra um fundo azul.
Análise Estatística
Os dados IHC foram analisadas pelo teste do qui-quadrado. Os resultados de dados de biologia molecular e celular foram expressos como a média ± SE. Para comparação de médias entre dois grupos, um teste t de duas caudas foi usado e para comparação das médias entre os três grupos, foram utilizados ANOVA one-way. curva de sobrevida foi calculada pelo método de Kaplan-Meier eo teste de log-rank. A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS versão 13.0. P-value 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
genes diferencialmente expressos no altamente invasivo Subclone S1 e Baixo Invasiva Subclone S21
Para descobrir novos biomarcadores para invasiva. câncer de ovário, foi realizada a análise microarray para identificar o perfil de expressão gênica diferencial do subclone altamente invasivo S1 e baixa S21 subclone invasivo. Estes dois subclones foram derivadas a partir da linha celular de cancro do ovário humano SKOV3 parental e tinham antecedentes genéticos semelhantes; portanto, eles são adequados para análise comparativa. Os dados de microarranjos foram analisados utilizando a razão de expressão de corte atribuído de 1,5 a mudança vezes e
P
-Valores ≤0.05. As análises identificados 1.596 genes diferencialmente expressos (Tabela S1 e Figura 1A). Entre estes genes, SPARC foi acentuadamente regulada para cima no subclone altamente invasivo em comparação com a baixa subclone invasiva (13,8 vezes,
P
= 0,023). Real-time Q-RT-PCR, e os resultados Western blot de IHC confirmaram a superexpressão da SPARC no subclone altamente invasiva (Figura 1BCD).
(A) a proliferação celular como examinado pelo ensaio de MTT. crescimento independente (B) de fixação, conforme medido pelo ensaio de formação de colónia em agar mole. (C) distribuição do ciclo celular tal como medido por citometria de fluxo. (D) a apoptose celular como medido por ensaios de V-PI anexina. (E) a migração celular e ensaio de invasão usando câmaras de Boyden. * P . 0,05 versus controlo
expressões de SPARC em tecidos ovarianos Humanos
O uso de ambos anticorpo anti-SPARC dois em tecidos ovarianos normais, expressões SPARC foram baixo e, principalmente centrada em torno do vasculaturas no estroma (figura 2a e 2f), e em tumores de ovário benignos, expressão SPARC também era baixo e principalmente focados não só no estroma mas também no citoplasma de células de tumor (Figura 2B e 2G), finalmente, na maioria dos carcinomas do ovário, a imunorreactividade foi elevada, e a alta expressão de SPARC foi encontrada no estroma, não só mas também no citoplasma de células de cancro do ovário (Figura 2CDE e 2HIJ). Além disso, a alta expressão de SPARC foi associada com baixa diferenciação, alta estágio e status de linfonodo positivo de carcinomas ovarianos (Tabela 2 e 3). Os resultados das experiências de bloqueio de péptidos demonstraram a especificidade do anticorpo primário (Figura 3ABCDE). Para avaliar o valor prognóstico da SPARC no câncer de ovário, foi realizada análise de sobrevivência utilizando a análise de Kaplan-Meier. O resultado mostrou que pacientes com alta expressão de SPARC tiveram um prognóstico muito pior do que aqueles com baixa expressão SPARC (classificação,
p = 0,004
log; Figura 3F).
(A) Fotografia de xenotransplantes dissecados a partir de ratinhos nus após 3 meses a inoculação subcutânea (n = 5). (B) Queda da SPARC inibiu o crescimento tumoral in vivo. (C) SPARC expressão no tumor formado por células infectadas SPARC shRNA como medida por coloração IHC (ampliação x 200). (D) Expressão SPARC no tumor formado por células infectadas de controlo shRNA como medida por coloração IHC (ampliação x 200). (E) Fotografia de metástases pulmonares sob um microscópio após 3 meses a inoculação através da veia da cauda (n = 10). * P . 0,05 versus controlo
Knockdown de SPARC Expressão por Lentivírus mediada RNA Interferência
Para investigar o papel do SPARC no cancro do ovário, construímos lentivírus vetor com SPARC shRNA e as células infectadas subclone altamente invasivos (S1 e HO8910PM). Os dados semelhantes foram obtidos em células S1 e HO8910PM seguintes infecções por vírus SPARC shRNA. Após a infecção viral, mais de 80% das células foram positivas para GFP, indicando uma elevada eficiência de entrega de shRNA. Real-time Q-RT-PCR, Western Blot e IHC confirmaram a infra-regulação da expressão SPARC por sua shRNA em ambos os níveis de mRNA e proteína, como mostrado na Figura 4.
Os genes alvo a jusante (A) da SPARC como medido por Q-RT-PCR. P53, P21, a expressão (B) Ciclina D1, PCNA, Bcl-2 e Bax proteína em células infectadas com lentivírus tal como medido através de Western blot. a expressão da proteína (C) E-cardherin em células infectadas com lentivírus tal como medida por coloração IHC (ampliação x 200). actividades (D) MMPs medido por zimografia. * P 0,05 versus controlo
Knockdown de SPARC Expressão suprimidas células do cancro do ovário Proliferação
Em seguida, nós investigamos o efeito da SPARC knockdown sobre a proliferação das células subclone altamente invasivos (. S1 e HO8910PM). MTT resultados mostraram que SPARC knockdown reduzida de forma significativa a proliferação de células de S1 e células HO8910PM (Figura 5A). No ensaio de formação de colónia em agar mole, de células S1 e HO8910PM infectadas com vírus SPARC shRNA mostrou redução significativa na formação de colónias (Figura 5B). Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre as células infectadas controle de vírus shRNA e células não-infectadas.
Knockdown de SPARC expressão induzida paragem do ciclo celular no G1 /G0 Fase
Para entender o mecanismo pelo qual o proliferação de células de cancro do ovário foi inibida por knockdown de expressão SPARC, utilizou-se citometria de fluxo para identificar as fases específicas do ciclo celular. Como mostrado na Figura 5C, S1 e células infectadas com HO8910PM SPARC shRNA continha 20~30% mais células na fase G1 ou G0 (G1 /G0) (
P
0,05) em comparação com o controlo infectado shRNA células. Estes dados indicaram que knockdown de expressão SPARC inibiu a proliferação de células de cancro do ovário, bloqueando a sua progressão da fase G1 /G0 para a fase S durante o ciclo celular.
knockdown da SPARC expressão induzida do cancro do ovário a apoptose celular
Como se mostra na figura 5D, a percentagem de células apoptóticas infectadas com SPARC shRNA foi muito maior do que no grupo de controlo shRNA (P 0,05). Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre as células infectadas controle de vírus shRNA e células não-infectadas. Estes dados indicaram que knockdown de expressão SPARC induzida apoptose de células de cancro do ovário.
Knockdown de SPARC Expressão inibido Ovarian Cancer Cells migração e invasão
Foi examinado o efeito do SPARC knockdown na migração e invasão subclone das células altamente invasivos (S1 e HO8910PM). Como mostrado na Figura 5E, knockdown da SPARC inibidas as células cancerosas do ovário invasão e migração. Os dados semelhantes foram obtidos em células S1 e HO8910PM seguintes infecções por vírus SPARC shRNA. A média invasora ou contagem das células a migração das células infectadas SPARC shRNA era muito menos do que a de células infectadas de controlo shRNA. Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre as células infectadas shRNA controle e células não infectadas.
Knockdown de SPARC Expressão inibiu o crescimento tumoral e Pulmão Metástase em ratos pelados
formação de tumores foi realizada em S1 subclone infectado por vírus SPARC shRNA em ratinhos nus. As células foram inoculadas subcutaneamente em ratinhos nus e o crescimento tumoral foi medida ao fim de 3 meses. Como mostrado na Figura 6A e B, knockdown da SPARC mostrou uma diminuição do tamanho dos tumores de comparação com o seu homólogo de controlo. Não houve diferença significativa entre as células infectadas shRNA controle e células não infectadas na formação de tumores de ratinhos nus. Os tumores foram dissecados, fixados em formalina e embebidos por parafina, então os ensaios IHC foram feitos, o tumor formado por células infectadas SPARC shRNA apresentaram menor expressão SPARC (Figura 6C), enquanto o tumor formado por células infectadas de controlo shRNA mostraram maior expressão SPARC ( A Figura 6D). Além disso, a Figura 6E mostra a metástase pulmonar sob um microscópio, após injecção de células de controlo infectadas shRNA e células não infectadas através das veias da cauda de ratinhos nus. Cerca de 50% de metástases de pulmão foram encontrados após 3 meses nos ratinhos nus injectados com células infectadas shRNA controle e células não infectadas, enquanto que nenhuma metástase pulmonar foi encontrado após a injecção com células infectadas SPARC shRNA em ratinhos nus.
A Genes alvo a jusante de SPARC em afetar o cancro do ovário proliferação celular, apoptose e invasão
para entender o mecanismo de SPARC no ovário proliferação do câncer, a apoptose e invasão, em tempo real RT-PCR quantitativo foi usado para detectar as diferentes expressões da caderina-E, β-catenina, alfa-catenina, β3 integrina β1 integrina ILK, FAK, P53, P21, ciclina D1, PCNA, Bcl-2, Bax, u-PA, uPAR, PAI-1, MMP2, MMP9, TIMP1 e TIMP2 entre SPARC shRNA células infectadas subclone S1 e controle shRNA células infectadas subclone S1. Como mostrado na Figura 7A, a ciclina D1, PCNA, Bcl-2, MMP2 e MMP9 foram significativamente regulada negativamente em células infectadas SPARC shRNA. Além disso, os níveis de expressão mais elevados de E-caderina, P53, P21 e Bax foi encontrado em células infectadas SPARC shRNA. Não houve diferenças significativas nas expressões de β-catenina, α-catenin, β3 integrina β1 integrina ILK, FAK, u-PA, PAI-1, uPAR, TIMP1 e TIMP2 entre as células infectadas SPARC shRNA e controle de células infectadas shRNA . Os resultados de citometria de fluxo de análise (Tabela 4) e Western blot (Figura 7B) confirmou que a E-caderina P53, P21 e Bax foram supra-regulados e Ciclina D1, PCNA e Bcl-2 foram regulados negativamente em células infectadas SPARC shRNA. IHC experiências revelaram que a expressão de E-caderina aumento na cytomembrane de células infectadas SPARC shRNA (Figura 7C). resultados zimografia mostrou que as atividades de MMPs foram significativamente reduzidos em SPARC shRNA células infectadas (Figura 7D).
Discussão
Neste estudo, usando genoma-wide perfil transcricional, identificamos que SPARC foi overexpressed no subclone SKOV3 altamente invasivo em comparação com a baixa subclone invasiva. Outras análises de expressão SPARC em 140 tecidos ovarianos humanos revelou que SPARC foi sobre-expressos em tumores ovarianos malignos e associado com pobres características clínico-patológicas. Estes resultados sugerem que SPARC pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento do cancro do ovário. Com o anticorpo AON-5031, resultados semelhantes foram observados em 8 tecidos normais do ovário e 24 cancros do ovário invasivos humanos [13], e 14 tecidos ovarianos normais e 48 cancros do ovário [14]. Todos eles descobriram que SPARC foi regulada no estroma reativo associado com câncer de ovário invasivo. No nosso estudo, com o anticorpo e AF941 BS-1133R, verificou-se que a imunorreactividade da SPARC foi aumentada não só no estroma mas também no citoplasma de células de cancro do ovário. Em contraste, com o LF-54 do anticorpo, outro estudo indicaram que a expressão SPARC é sub-regulada no cancro do ovário; exógeno SPARC inibiu a proliferação e induz a apoptose em células de cancro do ovário [21]. Mas, no nosso estudo, por interferência de ARN mediada por lentivírus, descobrimos que a expressão de knockdown SPARC suprimiu a proliferação celular, apoptose celular induzida, e inibiu a invasão de células e de metástases em células de cancro do ovário. Resultados semelhantes foram também foram encontrados em células gástricas cancerosas [26], células de glioma [27] e células de melanoma [28], por interferência RNA. Na nossa investigação, verificou-se que não só foi SPARC secretado pelo estroma mas também secretado por células de cancro do ovário e que podem exercer efeitos intracelulares importantes sobre estas células. Knockdown da SPARC pode inibir o crescimento celular do cancro do ovário e invasão. Descobrimos que SPARC difundido a partir do estroma a domínios cancerosas. Neste processo, SPARC pode desempenhar um papel na promoção da invasão e metástases de cancro do ovário. Os resultados inconsistentes sobre a expressão em tecidos ovarianos SPARC pode ser devido a diferentes anticorpos SPARC utilizadas nestas pesquisas. Em conclusão, as funções de SPARC em câncer de ovário são necessários mais estudos.
Neste estudo, usando ensaios de MTT e formação de colónias em agar mole, concluímos que knockdown da SPARC suprimiu a proliferação de células de cancro do ovário. Citómetro de fluxo mostrou que knockdown da SPARC reduziu o número de células em fase S, enquanto o aumento do número de células em G1 /G0-fase, que indica a paragem em G1 /G0. Para entender o mecanismo de SPARC na proliferação do câncer de ovário, detectamos as diferentes expressões da ciclina D1, PCNA, P53 e P21 entre as células infectadas SPARC shRNA e controle de células infectadas shRNA.
A ciclina D1, um membro da ciclinas G1 , e o PCNA (antigénio nuclear de células em proliferação) são comumente utilizados para avaliar a proliferação de células de tumor [29], [30]. P53, um gene supressor de tumor, e P21 (inibidor da quinase dependente de ciclina), um mediador chave da p53, pode induzir a paragem do ciclo celular na barreira G1-S [31], [32].