Abstract

O sistema de DNA mismatch reparação (MMR) mantém a estabilidade do genoma através do reconhecimento e reparação de descasamentos de base única e pequenos laços de inserção-exclusão. Inativação da via MMR causa instabilidade de microssatélites e da acumulação de mutações genômicas que podem causar ou contribuir para o câncer. Na verdade, 10-20% de certos cancros sólidos e hematológicos são MMR-deficiente. cancros MMR-deficientes não respondem a algum padrão de quimioterápicos de cuidados por causa do aumento da tolerância presumido de danos no DNA, destacando a necessidade de novas drogas terapêuticas. Para este objetivo, foram geradas linhas celulares de cancro isogênicos para comparação direta de células MMR-proficientes e MMR-deficientes. Nós manipulado células de adenocarcinoma de pulmão NCI-H23 para conter um shRNA doxiciclina induzível concebido para suprimir a expressão do gene MLH1, e em comparação subclones celulares individuais que foram não induzidas (MLH1-proficiente) versus induzida pela MLH1 shRNA (MLH1 deficiente ). Aqui nós apresentamos a caracterização destas linhas celulares MMR-induzíveis e validar uma nova classe de compostos de ródio metalloinsertor que diferencialmente inibem a proliferação de células cancerosas MMR-deficientes

Citation:. Bailis JM, Gordon ML, Gurgel JL, Komor AC, Barton JK, Kirsch IV (2013) An induzível, Câncer isogênico Sistema Linha celular de Segmentação do Estado de Deficiência de reparo incompatível. PLoS ONE 8 (10): e78726. doi: 10.1371 /journal.pone.0078726

editor: Klaus Roemer, Universidade de Saarland Medical School, Alemanha |

Recebido: 24 de junho de 2013; Aceito: 17 de setembro de 2013; Publicação: 29 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Bailis et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores agradecer ao NIH (GM33309 para JKB) e NSF (comunhão para ACK) para apoio financeiro. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Julie Bailis, Marcia Gordon, Jesse Gurgel, e Ilan Kirsch são ou eram empregados da Amgen, Inc. Este não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

instabilidade do genoma é uma característica das células cancerosas e pode levar à numérica ou alterações estruturais cromossomos (instabilidade cromossômica, ou CIN), ou deficiência de reparo incompatível nucleotídeo (MMR) (MIN) [1]. Enquanto NIC pode resultar da perda de função de um número de vias celulares, resulta MIN especificamente de defeitos no sistema de MMR e é identificável pelo ganho ou perda de sequências de mono-, di- ou tri-nucleótidos repetidos, referido como instabilidade microssatélite (MSI) (revista em 2). erros de replicação, como o deslizamento polimerase gerar laços pequenos inserção-deleção (IDLs) ou desencontros de uma única base no DNA. danos no DNA também pode modificar bases de causar incompatibilidades. Em células humanas que são MMR-proficientes, heterodímeros que contêm os MutS bacterianas homólogo MSH2 ligam uma incompatibilidade e, em seguida heterodímeros que contêm a bactéria mutL homólogo MLH1 associado com o complexo proteína: ADN para mediar o recrutamento de fatores de reparo que Excise a inconsistência e restaurar a sequência de DNA correto. células MMR com deficiência são incapazes de corrigir desajustes, resultando em incorporação de erros no modelo DNA e uma fenótipo mutante.

deficiência de MMR está fortemente associada ao câncer. mutações germinativas dos genes MMR, particularmente MLH1 ou MSH2, é a base de câncer colorretal não-polipose hereditário (HNPCC), ou síndrome de Lynch, que confere susceptibilidade ao cancro colo-rectal, mas também para outros tipos de câncer específicos, incluindo endométrio e do ovário (revisto em 3,4). Mutação ou hipermetilação de genes em células somáticas MMR está associado com cerca de 15% dos cancros colorectais esporádicos, bem como 10-15% do ovário, do endométrio e cancros gástricos (revisto em 5). deficiência de MMR e MSI também foram identificados em até 20% das leucemias nos pacientes que tiveram uma recaída, ou que desenvolvem a doença como consequência de quimioterapia anterior [6].

deficiência de MMR e MSI também ocorrem em câncer de pulmão primário associado com o tabagismo ou exposição ao cromo [7-9]. Cancros com MSI têm sido relatados como sendo resistentes a diversos agentes quimioterapêuticos padrão de cuidados, tais como o antimetabolito 5-fluorouracilo (5-FU), a platina compostos cisplatina e carboplatina, a temozolomida alquilante droga, e o etoposido inibidor de topoisomerase [ ,,,0],10]. A inactivação da via de MMR pode permitir que as células de tolerar certos tipos de danos no DNA sem iniciar uma via de morte celular programada [11].

Um desafio para identificar terapias para cancros MMR deficientes é que os alvos moleculares e clínicas fenótipos resultantes de inactivação de genes MMR são variáveis. deficiência de MMR pode conduzir a mutações frameshift nos genes que contêm sequências de repetição do ADN, e, pelo menos, 30 genes foram identificados como potenciais alvos de MSI, incluindo o BRAF oncogenes e KRAS, e os genes de resposta ao dano no DNA MRE11, BRCA1 e ATR [ ,,,0],12,13]. Os esforços para identificar novos alvos terapêuticos que apresentam letalidade sintética com as células cancerosas deficientes em MMR revelaram variabilidade em alvos genéticos com perda de função ou de MLH1 MSH2 [14]. Juntas, estas observações suportam a ideia de que os cancros com MSI representam um conjunto multifacetado, heterogêneo de doenças. Em consideração a complexidade dos tumores MSI, propusemos anteriormente visando o fenótipo final ou “estado” da própria deficiência de reparo incompatível [15,16].

No esforço atual descrita aqui, o nosso objectivo foi desenvolver ferramentas para permitir estudos de deficiência de reparação de emparelhamentos incorrectos induzida. Nós descrevemos um sistema de linha de células completamente isogênico em que a expressão do gene MLH1 MMR pode ser ligado ou desligado através shRNA. Como nosso sistema modelo foi utilizado o adenocarcinoma do pulmão NCI-H23, uma linha celular seleccionada com base em níveis relativamente elevados de MLH1 que poderia ser reversivelmente inactivada por shRNA. Neste estudo, que induzem a deficiência de MMR no sistema de linha celular NCI-H23 e demonstram que isso resulta em MSI e aumento da resistência a agentes que danificam o DNA. Como um passo potencial para o desenvolvimento de uma terapêutica que tem como alvo o “estado” final da deficiência de MMR, nós também usar este sistema de linha celular para validar ainda mais uma nova classe de complexos metálicos que visam descasamentos de DNA.

Materiais e Métodos

RNA curto hairpin (shRNA)

sequências previstas para derrubar a expressão dos genes MLH1 ou MSH2 foram projetados usando BLOCK-IT RNAi Designer (Life Technologies). Quatro sequências independentes para cada gene foi escolhido como candidato shRNA dispara conforme indicado abaixo (numeração indica a posição na cDNA).

MLH1.

362 GCCTGAAGTTGATTCAGATCC

740 GCAGGTATTCAGTACACAATG

928 GGTTACATATCCAATGCAAAC

2237 GCGCTATGTTCTATTCCATCC

MSH2.

399 GCATCCAAGGAGAATGATTGG

1102 GGATTAAGCAGCCTCTCATGG

1260 GCAGCAAACTTACAAGATTGT

2,359 GGGCTATATCAGAATACATTG

O método utilizado para a construção das cassetes de shRNA tenha sido descrita em detalhe noutro local [17]. Resumidamente, as construções shRNA sentido de ciclo-anti-sentido de estas sequências foram gerados por PCR, usando como TTCATGAGA a sequência cíclica. O produto da PCR final, que continha as sequências shRNA sentido-loop-antisense ladeado pelo

attB1

local e promotor Th1 na extremidade 5 ‘, e um sinal de terminação e o

attB2

site na a extremidade 3 ‘, foi então clonado no vector pDONR gateway (Life Technologies). técnicas de recombinação de gateway foram então usadas para transferir as cassetes de shRNA em vectores de destino lentiviral Gateway compatíveis pLV736G ou pLV739G.

existências lentivirais foram preparados como descrito [17]. 293-Metr células [18] foram transf ectadas com um vector ou pLV736G pLV739G que continha uma cassete de shRNA indivíduo, juntamente com os plasmídeos contendo os genes gag /pol, Rev, e env. Após incubação durante a noite, o sobrenadante foi recolhido, filtrado, concentrado por ultracentrifugação e armazenado a -80 ° C.

geração linha celular

células NCI-H23 obtida a partir da American Type Culture Collection (ATCC ) foram cultivadas em meio RPMI com soro fetal bovino a 10%. Para a transdução de lentivírus, as células NCI-H23 foram semeadas a 2 x 10

4 células por ml em placas de 12 poços e incubadas durante a noite. O meio foi aspirado das células e substituído com meio Opti-MEM (Life Technologies) que continha 10 ug /ml de di-etilaminoetil-dextrano (GE Healthcare Life Sciences) e 1-5 x 10

6 unidades de transdução por mililitro (TU /mL ) de lentivírus. As células foram transduzidas com lentivírus que contêm MLH1 shRNA ou MSH2 shRNA. As placas foram incubadas durante a noite, e então o meio de lentivírus que contêm foi aspirado e substituído com meio RPMI fresco. Após 1-3 dias (d), as células foram expandidas para placas de 6 poços e cultivadas na presença do agente de selecção (250 ug /ml de G418 para MLH1 e 2,5 ug /ml de puromicina para MSH2). 500 ng /ml de doxiciclina (Sigma-Aldrich) foi adicionada às células para induzir a expressão do shRNA.

Células cultivadas sob selecção e com shRNA induzida durante pelo menos 2 meses, foram plaqueadas para placas de 96 poços a uma densidade de 0,3 células por poço para seleccionar para os subclones de células únicas. Os subclones celulares individuais foram expandidas e mantidas sob condições de selecção. As células não induzidas utilizados para comparação com os subclones induzidas foram obtidas por cultura dos subclones na ausência de doxiciclina durante pelo menos uma semana.

Os anticorpos e os Western blots

lisados ​​de proteína foram preparados em tampão de lise ( 50 mM de HEPES, 1% de Triton X-100, NaCl 150 mM, EGTA 1 mM, glicerol a 10%, ditiotreitol 1 mM) ao qual fosfatase e inibidores da protease (20 mM de glicerofosfato, 100 mM fluoreto de sódio, 0,5 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 0,1 mM de ortovanadato de sódio, 10 ug /mL de leupeptina) foram adicionados. Os lisados ​​foram clarificados por centrifugação e, em seguida, analisadas por SDS-PAGE em geles de 4-12% Bis-Tris (Life Technologies) seguido por imunotransferência. Os anticorpos primários utilizados foram contra MLH1 (Becton Dickinson # 551091), MSH2 (Becton Dickinson # 556349), GAPDH (Abcam # ab9484), H2AX fosforilada histona (Millipore # 05-636) ou tubulina (Cell Signaling # 2148). Os anticorpos primários foram detectados com anticorpos secundários conjugados com IRDye700 ou IRDye800 (licor) e visualizadas com o licor Odyssey. Cada experiência Western Blot foi realizada pelo menos duas vezes, em dias independentes. Os dados representativos a partir de uma única experiência são apresentados.

análise de fragmentos de ADN

O ADN genómico a partir dos subclones NCI-H23 foi preparado utilizando um kit DNeasy (Qiagen). As reacções de PCR multiplex foram realizadas de acordo com o Sistema de Análise de MSI, Versão 2.1 (Promega). Os produtos de PCR foram analisados ​​num sequenciador ABI 3130, e, em seguida, os dados foram analisados ​​utilizando o software GeneMapper (Life Technologies). Os subclones que exibiram MSI para pelo menos um marcador na primeira experiência foram novamente testados numa experiência independente para confirmar os resultados.

ensaios de viabilidade celular

As células cultivadas na ausência ou na presença de doxiciclina foram plaqueadas 2000-5000 em células por poço em placas de 96 poços e deixou-se incubar durante a noite. As células foram então tratadas com os compostos em uma resposta à dose para a 4d. A viabilidade celular foi avaliada utilizando um ensaio celular Titer-Glo (Promega) para o metabolismo de ATP. ensaios de viabilidade celular foram realizados em duplicado em pelo menos 3 experiências independentes. Os dados representativos a partir de uma tal experiência são apresentados.

Fase de contraste para imagiologia de células durante as experiências de proliferação foi realizada utilizando um IncuCyte com uma objectiva de 20x (Essen Bioscience).

formadoras de colónias ensaios também foram utilizados para testar a viabilidade das células após o tratamento composto. As células cultivadas na ausência ou na presença de doxiciclina foram plaqueadas a 500-2000 células por poço de uma placa de 6 poços e deixou-se incubar durante a noite. As células foram tratadas com compostos em uma resposta à dose para 24 horas (h), e, em seguida, o meio foi aspirado e substituído por meio fresco que não continham o composto. As colónias foram visualizada com corante de violeta de cristal em 10-12d

senescência associada beta-galactosidase (SA – gal). Produção foi avaliada usando um corante histoquímica para a actividade de beta-galactosidase a pH 6,0 (Sigma-Aldrich) . As células foram tratadas ou tratadas com compostos como indicado para 3D, em seguida, as células foram fixadas, coradas para SA -. Gal e fotografada usando um microscópio invertido Zeiss Axio equipado com uma câmera de cor

A análise estatística

para os ensaios de viabilidade celular, testes t emparelhados foram utilizados para comparar inibitória máxima metade (IC

50) ou a dose letal mediana (LD

50) a partir de valores de vários experimentos e determinar os valores de p. Os valores de P igual ou inferior a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. A análise estatística foi feita com o software Graph Pad Prism.

Microarray Analysis

O ARN total foi preparado a partir de amostras em duplicado de células em fase logarítmica de crescimento, utilizando um mini-kit RNeasy (Qiagen). a integridade da amostra foi avaliada em um Bioanalyzer. Cy3- e RNA marcado com Cy5 foi preparado a partir de 200 ng de RNA total por amostra, e então hibridizado a Whole Human Genome Arrays (Agilent Technologies) de acordo com a expressão gênica Agilent duas cores Microarray-Based Análise de Protocolo. Os dados foram analisados ​​no Rosetta Resolver.

Os compostos químicos

Síntese de [Rh (HDPA)

2chrysi]

3+ e [Rh (DIP)

2chrysi]

3+ foram descritos [19,20]. A síntese de [Rh (PED) (fen) (Chrysi)]

3+ foi recentemente relatada [21]. A cisplatina, doxorrubicina, etoposido, 6-tioguanina e de temozolomida foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich e dissolveu-se em DMSO ou água. A CDK4 /inibidor 6 PD-0332991 [22], utilizado como um controlo positivo para os ensaios de senescência, foi sintetizado de acordo com os métodos publicados.

Resultados

Inibição de MLH1 por shRNA reduz os níveis de proteína MLH1

A linha de células de adenocarcinoma de pulmão NCI-H23 é proficiente para reparo incompatível e contém níveis relativamente elevados de proteínas MMR MLH1 e MSH2 [23]. Com o objetivo de gerar um sistema combinado que induz deficiência de MMR e permite comparação direta com células MMR-proficientes, testamos se a expressão destas proteínas MMR poderia ser reprimidos por shRNA. as células NCI-H23 foram transduzidas com foram seleccionados e expandidos lentivírus contendo shRNA induzível para MLH1 ou MSH2, e que as células estavelmente integrado a construção no genoma. Sob condições normais de crescimento, o shRNA integrado não foi activa e as proteínas MMR continuou a ser expressa. Expressão do shRNA foi regulada por tratamento das células com doxiciclina. Quando foi induzida a shRNA, os lisados ​​de proteína a partir de células que continham qualquer dos quatro shRNA constrói contra MLH1 demonstrado quase completa ( 90%) de inibição da proteína MLH1 (Figura S1). Em contraste, a proteína MSH2 foi apenas parcialmente diminuída após a indução de qualquer um dos quatro MSH2 shRNA construções em células NCI-H23 (Figura S1) e estas células não foram caracterizados adicionalmente.

Devido ao potencial para a variabilidade de expressão shRNA dentro de uma população de células, foram isoladas e caracterizadas subclones de células únicas de células NCI-H23 transduzidas com uma das construções de shRNA, MLH1 928. As células foram cultivadas na presença de doxiciclina para induzir a MLH1 shRNA durante pelo menos um mês, e depois plaqueadas em células individuais, que foram expandidas em colónias que foram mantidas em condições de indução. Os níveis de proteína MMR foram então re-avaliada por immunoblotting. Os subclones NCI-H23 que expressam MLH1 shRNA reduziu consistentemente os níveis de proteína MLH1 90%, sem afectar os níveis de proteína MSH2 (Figura 1).

Os níveis de proteína MLH1 em subclones NCI-H23 induzidas pela MLH1 928 shRNA foram comparados com os níveis de proteínas MLH1 nas células parentais NCI-H23 (H23). Os lisados ​​de proteína foram analisados ​​por SDS-PAGE e imunotransferência para os níveis de proteínas MSH2 e MLH1. GAPDH foi usada como um controlo para a carga de proteína.

regulação negativa do MLH1 induz microsatélites instabilidade

Foram selecionados pelo menos 20 subclones a partir de células NCI-H23 que expressavam MLH1 shRNA para testar a MSI. Foi preparado ADN genómico a partir de células NCI-H23 parentais e a partir de cada sub-clone e PCR, em seguida, em multiplex foi realizada para amplificar um painel padrão de marcadores microssatélites (BAT-26, BAT-25, mono-27, NR-21 e NR-24 ). O tamanho dos fragmentos dos produtos de PCR foram em seguida analisadas num sequenciador de ADN. Todos os subclones NCI-H23 mostrou MSI na mononucleótido repetição BAT-26 [24], indicado por uma mudança de 1-3 nucleótidos no locus (Figura S2). deficiência de MLH1 é, portanto, suficiente para induzir MSI. Uma série de subclones também exibida MSI possível no outro marcador, com subclones independentes demonstrando alteração de diferentes marcadores (Figura S2). Subclones 4-10 e 4-13, que foram obtidos por transdução de células NCI-H23 com o construto shRNA MLH1 928, foram escolhidos para análise fenotípica adicional.

desativação de genes MMR por shRNA é reversível

Os subclones celulares única NCI-H23 foram mantidas sob condições de crescimento que continuamente induzidas expressão shRNA. Para testar se a regulação negativa shRNA-mediada de MLH1 foi reversível, as células a partir de cada subclone foram divididos em duas culturas separadas, com uma cultura mantida na presença de doxiciclina para manter a deficiência MLH1, e a outra cultura que cresceu na ausência de doxiciclina para permitir expressão MLH1. Após uma semana, os lisados ​​de proteína foram preparados a partir das células, e o nível de proteína MLH1 foi avaliada por imunotransf erência. Na ausência de doxiciclina, as células de 4-10 e 4-13 subclones foram capazes de re-expressam níveis de tipo selvagem de proteínas MLH1 (Figura 2). Nem todas as sub-clones testados foram capazes de expressar a proteína re-MLH1 depois do crescimento na ausência de doxiciclina (dados não apresentados), sugerindo que o shRNA naqueles subclones pode ser expressa constitutivamente.

subclones NCI-H23 4 -10 e 4-13 que foram induzidas para MLH1 shRNA foram divididos em duas culturas, um mantida em condições de indução (+ doxiciclina) e o outro crescidas na ausência de doxiciclina (-) para permitir a re-expressão de MLH1. Os lisados ​​de proteína foram preparados e analisados ​​por SDS-PAGE seguido por imunotransf erência para a expressão da proteína de MLH1. Tubulina foi utilizada como um controlo para a carga de proteína igual entre amostras.

MLH1 deficiente subclones NCI-H23 não exibem mudanças globais na expressão gênica

análise Microarray foi levada a cabo sobre os subclones de célula única NCI-H23 para testar se a regulação baixa de MLH1 por shRNA afecta a expressão de outros genes. As células a partir dos subclones 4-10 e 4-13 ou foram mantidas na presença de doxiciclina para induzir MLH1 shRNA, ou cultivada na ausência de doxiciclina durante pelo menos uma semana para permitir a re-expressão de MLH1. A linha celular parental NCI-H23, quer não tratadas ou tratadas com doxiciclina, foi incluído como um controlo. O ARN total foi isolado a partir de amostras em duplicado de células, marcado de forma fluorescente, e hibridado com Agilent matrizes totalidade do seu genoma. padrões de expressão de genes em subclones não induzidas foram semelhantes aos das células NCI-H23 parentais, quer não tratadas ou tratadas com doxiciclina (dados não apresentados). Os níveis de transcrito do gene MLH1 foram diminuiu aproximadamente três vezes nas 4-10 e 4-13, onde subclones MLH1 shRNA foram induzidos (Figura S3). Uma assinatura mais difundida expressão do gene associado com a indução MLH1 shRNA não surgiu a partir dos dados (Figura S3).

MLH1 deficiente NCI-H23 subclones apresentam maior resistência a drogas quimioterápicas

Estamos próximos testaram se a deficiência de MMR induzida poderia causar resistência aos agentes que danificam o DNA. Nós comparados directamente os MMR deficientes em subclones NCI-H23 para células MMR-proficientes do mesmo subclone que foram obtidos por permitindo que as células re-express MLH1. Os subclones MMR-deficientes e MMR-proficientes foram tratados com o inibidor da topoisomerase etoposido ou o agente de alquilação a temozolomida e a viabilidade das células foi avaliada após 4d (Figura 3A, D). Os subclones MMR-proficientes, em que o shRNA foi não induzidas, não mostram uma diferença significativa na sensibilidade para os compostos em comparação com as células NCI-H23 parentais que foram ou não tratados ou tratados com doxiciclina (p = 0,34) (Figura S4). Para cada par correspondente de células (por exemplo, 4-10 subclone não induzidas em comparação com 4-10 induzida), as células deficientes em MLH1 foram consistentemente, pelo menos, duas vezes mais resistentes a estes compostos do que as células MLH1-proficientes isogénicas, um achado que é estatisticamente significativa (p = 0,04 para as células tratadas com etopósido, e p = 0,01 para as células tratadas com temozolomida) (Figura 3A, D). Os subclones MLH1 deficientes também foram mais resistentes à cisplatina agente de reticulação (p = 0,02), o análogo de purina 6-tioguanina (p = 0,05), e de outro inibidor de topoisomerase, a doxorrubicina (p = 0,04) (Figura S5). A diferença de aproximadamente duas vezes na viabilidade das células deficientes em MMR contra células MMR-proficientes in vitro em resposta a agentes quimioterapêuticos tenha sido relatado anteriormente e mostrado para traduzir a resistência a drogas in vivo (revisto em 4,10). Para confirmar que o efeito diferencial na viabilidade é devido à presença ou ausência de MLH1, utilizou-se diferentes sequências shRNA, 362 e 2239, para inibir a expressão de MLH1 e, em seguida, caracterizada sensibilidade celular a fármacos quimioterapêuticos. Observou-se que o MLH1-deficiência resultante da indução destes gatilhos shRNA independente conduziu a uma aumento semelhante na resistência a drogas quimioterapêuticas em relação às células NCI-H23 que expressam MLH1 (p = 0,01) (Figura S6).

subclones NCI-H23 que foram não induzidas ou induzidas por MLH1 shRNA foram tratados com etoposido (A-C) ou temozolomida (D-F). (A, D) As células foram tratadas com o composto nas concentrações indicadas, e a viabilidade celular foi avaliada em 4D utilizando um ensaio celular Titer-Glo. Os gráficos indicam a sobrevivência relativa para amostras duplicadas de uma única experiência. testes t para comparar IC

50 valores em vários experimentos determinados valores de p de p = 0,04 para células tratadas com etoposídeo, e p = 0,01 para células tratadas com temozolomida. (B, E) imagens de contraste de fase de células às 0h e hora 96h pontos durante o experimento viabilidade celular são mostradas. As células foram tratadas com 390 uM de etoposido (B) ou 500 uM de temozolomida (E). (C, F) As células foram tratadas com o composto durante 24 h nas concentrações indicadas, e capacidade de formação de colónias após composto de lavagem foi avaliada. Os gráficos mostram a percentagem de sobrevivência 10d para amostras em duplicado de células tratadas com etopósido (C) ou temozolomida (F). Comparação do LD

50 valores através de múltiplas experiências por teste t de determinados os valores de p de p = 0,03 para as células tratadas com etopósido, e p = 0,04 para as células tratadas com temozolomida.

Para explorar a sensibilidade diferencial aos compostos com mais pormenor, que trabalhada células durante o período de tratamento 4d do ensaio de viabilidade celular e examinaram contagem celular e morfologia. No ponto de tempo 0h, as células estão na fase de crescimento e parecem saudáveis ​​por imagem de contraste de fase. No entanto por 96h, as diferenças entre os subclones não induzidas e induzidas foram evidentes: a maior parte das células MLH1-proficientes tinham sido submetidos a morte celular após o tratamento com os agentes que danificam o ADN, enquanto que as células MLH1 deficientes continuaram a proliferar (Figura 3B, E). O tratamento com os agentes que danificam o ADN não afectou a expressão MLH1 nos subclones não induzidas, mas teve como resultado um aumento da expressão de H2AX histona fosforilada, um marcador para a fragmentação de ADN [25], o que sugere que as células MLH1-expressam tinham sido submetidos a apoptose (Figura S7).

Nós investigado mais a sobrevivência das células após o tratamento composto utilizando ensaios clonog�icas. As células foram tratadas com etopósido ou temozolomida durante 24 h, e a recuperação a partir de composto de tratamento foi avaliada pela formação de colónias depois de 10d. Os MLH1 deficientes em subclones NCI-H23 foram mais resistentes ao composto de tratamento do que as células isogénicas proficiente para MLH1 (Figura 3C, F), que mostra uma diferença significativa na LD

50 valores (p = 0,03 para etoposido, e p = 0,04 para a temozolomida). Juntos, estes resultados demonstram uma resposta diferencial a danos no DNA que se baseia unicamente na presença ou ausência de MLH1.

exibição MLH1 deficiente NCI-H23 subclones aumento da sensibilidade a compostos metalloinsertor ródio

complexos metálicos que se ligam de forma não covalente desemparelhamentos de ADN com afinidade moderada e de alta especificidade, devido à desestabilização termodinâmica dos pares de bases desemparelhadas (revisto em 26) anteriormente descrito. Nós inicialmente demonstrado que esta classe de compostos, preferencialmente, inibe a proliferação de células deficientes em MMR, utilizando um sistema de linha celular de cancro colorrectal HCT-116 combinados e um sistema genético nocaute [16,19,21]. Este trabalho anterior foi a base e motivação para a criação de linhas celulares isog�nicas descritos no estudo atual e nos levou a testar se os compostos de ródio metalloinsertor também inibem preferencialmente a viabilidade dessas células quando foi induzida deficiência de MMR.

no nosso sistema de linha celular indutivel, o composto de ródio metalloinsertor [Rh (Chrysi) (fen) (PED)]

3+ preferencialmente inibidas a viabilidade dos subclones induzidas NCI-H23 MLH1-deficientes, com pelo menos um tripla alteração da IC celular

50 em um 4d celular Titer-Glo ensaio relativamente a subclones MLH1-proficientes (p = 0,01) (Figura 4A, B). Outro composto de ródio metalloinsertor, [Rh (HDPA)

2chrysi]

3+ também inibiu a proliferação de células, preferencialmente, MLH1-deficiente (Figura S8), com uma mudança de duas a três vezes na IC celular

50 valores (p = 0,02). Para confirmar que a diferença resultante da deficiência de MLH1, em vez de um efeito fora do alvo do shRNA, usamos adicional, independente MLH1 shRNA constrói de regular negativamente MLH1 nas células NCI-H23 e verificaram que as células MLH1 deficientes eram preferencialmente sensível a metalloinsertor ródio compostos (p = 0,01) (Figura S9). Em contraste, um composto relacionado que apresenta um fraco nível de ligação a DNA com desemparelhamentos, [Rh (DIP)

2chrysi]

3+ [21] não exibir um efeito diferencial na viabilidade celular não induzido do induzido e NCI-H23 clones (p = 0,90) (Figura S9). Em conjunto, os nossos dados suportam a hipótese de que a infra-regulação de genes MLH1 aumenta a sensibilidade das células aos compostos de ródio metalloinsertor.

subclones NCI-H23 que foram não induzidas ou induzidas por MLH1 shRNA foram tratados com o composto de ródio metalloinsertor [Rh (Chrysi) (fen) (DPE)]

3+. (A) células foram tratadas com concentrações indicadas, e a viabilidade das células foi avaliada após 4d utilizando um ensaio celular Titer-Glo. viabilidade por cento das amostras duplicadas de um único experimento é mostrado. O valor de p foi determinada como p = 0,01 por teste de t. imagens (B) contraste de fase de células tratadas com 5 uM [Rh (Chrysi) (fen) (DPE)]

3+ às 0h e 96h durante o ensaio de viabilidade celular são mostrados. (C) As células foram tratadas com [Rh (Chrysi) (fen) (PED)]

3+ durante 24 horas, e depois ensaiadas para a formação de colónias depois de 10d. Os gráficos mostram percentagem de sobrevivência de células amostras em duplicado de compostos tratado. O valor de p foi determinada como p = 0,01 por teste de t.

Foi examinada a morfologia celular de subclones NCI-H23 tratados com [Rh (Chrysi) (fen) (PED)]

3+ durante o curso de tempo dos ensaios de proliferação, utilizando fase Contrast imaging. As células a partir de subclones MLH1-proficientes e MLH1 deficientes pareciam saudáveis ​​e em fase de crescimento no ponto do tempo 0h. Por 96h, as células não induzidas MLH1-proficientes continuou a proliferar, mas menos células pareciam estar a sofrer mitose, sugerindo um atraso do ciclo celular ou paragem (Figura 4C). As células não pareceu ser senescentes, como evidenciado pela falta de produção de SA – Gal [26] (dados não mostrados). Em contraste, a maioria das células deficientes em MLH1 ou falhou a proliferar, ou tinham sido submetidos a morte celular por 96h (Figura 4C). Verificou-se que este efeito diferencial era devido à ausência ou presença de MMR nas células por avaliação dos níveis de proteína MLH1 em células tratadas com os compostos de ródio metalloinsertor (Figura S10). O efeito anteriormente demonstrado indução de expressão de proteína em shRNA MLH1 não foi alterada após o tratamento com os compostos de ródio (Figura S10).

também confirmaram o aumento da sensibilidade das MLH1 deficientes em subclones NCI-H23 à metalloinsertor ródio compostos utilizando ensaios clonogénicos. Após o tratamento com 24h [Rh (Chrysi) (fen) (DPE)]

3+, os subclones MLH1 deficiente NCI-H23 formados menos colónias do que os subclones MLH1-proficientes isogênicos, exibindo uma diferença significativa na LD

50 valores (p = 0,01) (Figura 4D). A sensibilidade diferencial dos subclones MLH1 deficientes para os compostos de ródio metalloinsertor é consistente com a hipótese de que estes compostos exercem os seus efeitos através da ligação a desfasamentos de ADN que estão presentes em células deficientes em MMR.

Discussão

a via de MMR mantém a estabilidade do genoma, fomentando o reconhecimento e reparação de incompatibilidades base individuais e loops de inserção-deleção pequenas no DNA que resultam de erros de replicação ou danos no DNA. A perda da função da via da MMR aumenta a prevalência de mutações celulares e pode causar ou contribuir para o cancro. O mecanismo da carcinogénese, resultante de deficiência de MMR herdado tem sido bem estudado, particularmente no cancro colo-rectal [4,27], e foi modelada em sistemas de linha de células, tais como 116 HCT-ó células, que são deficientes em MLH1, mas contêm uma cópia extra do cromossoma 2, e as células HCT-116 N, em que a deficiência MLH1 é complementado por uma cópia extra do cromossoma 3 que contém MLH1 tipo selvagem [28]. Em outros tipos de cancro, tal como no cancro do pulmão, a deficiência de MMR pode ser promovida pela exposição cancerígena [7-9]. tratamento de quimioterapia também pode promover a deficiência de MMR levando a leucemia secundária [6]. O sistema de linhas de células que descrevemos proporciona o primeiro exemplo de um modelo isogénico para a deficiência de MMR induzida que pode ser reversivelmente ligado ou desligado no nível de controlo da expressão da proteína. Ele fornece um modelo para estudar questões sobre a deficiência de MMR induzido e para permitir a identificação de moléculas que possam oferecer benefícios terapêuticos em cancros MMR-deficientes.

O NCI-H23 combinado sistema de linha de células aqui descrita permite a caracterização detalhada da calendarização e sequência de eventos que resultam quando a deficiência de MMR é induzida. Observou-se efeitos semelhantes com três sequências diferentes shRNA orientadas para MLH1, e em dois subclones de células únicas diferentes isolados a partir de células transduzidas com uma das construções de MLH1 shRNA.

Informações de Apoio

Figura S1.