Abstract
Fundo
Resveratrol (3, 4 ‘, 5 tri-hydroxystilbene), um que ocorre naturalmente polifenol, exibe actividades anti-inflamatória, anti-oxidante, cardioprotectores e antitumorais. Mostrámos recentemente que o resveratrol pode aumentar o potencial de indução de apoptose de TRAIL em células de cancro da próstata através de múltiplos mecanismos
in vitro
. Portanto, o presente estudo foi desenhado para validar se o resveratrol pode melhorar o potencial de indução de apoptose de TRAIL num modelo de xenoenxerto de cancro da próstata.
Metodologia /Principais Achados
Resveratrol e TRAIL sozinho inibiu o crescimento de xenoenxertos PC-3 em ratinhos nus por inibição da proliferação de células tumorais (PCNA e Ki67 coloração) e indução de apoptose (TUNEL coloração). A combinação de resveratrol e TRAIL foi mais eficaz na inibição do crescimento do tumor do que único agente sozinho. Nos tumores xenoenxerto, o resveratrol upregulated as expressões de TRAIL-R1 /DR4, TRAIL-R2 /DR5, Bax e p27
/K IP1, e inibiu a expressão de Bcl-2 e ciclina D1. Tratamento de ratinhos com resveratrol e TRAIL sozinho inibiu a angiogénese (como demonstrado pela redução do número de vasos sanguíneos e células VEGF e VEGFR2 positivos) e marcadores de metástases (MMP-2 e MMP-9). A combinação de resveratrol com TRAIL ainda mais o número inibido de vasos sanguíneos em tumores, e circulando receptor do factor de crescimento endotelial células endoteliais 2-positivos do que único agente sozinho. Além disso, o resveratrol inibiu a fosforilação citoplasmática de FKHRL1 resultando na sua activação aumentada, como demonstrado pelo aumento da actividade de ligação a ADN.
Conclusões /Significado
Estes dados sugerem que o resveratrol pode aumentar o potencial de indução de apoptose de TRAIL, activando FKHRL1 e os seus genes-alvo. A capacidade de resveratrol para inibir o crescimento tumoral, metástase e angiogénese, e aumentar o potencial terapêutico de TRAIL sugere que o resveratrol isoladamente ou em combinação com TRAIL pode ser utilizada para o tratamento do cancro da próstata
citação:. Ganapathy S, Chen Q, Singh KP, Shankar S, Srivastava RK (2010) Resveratrol Melhora antitumoral Atividade de TRAIL em Prostate Cancer xenoenxertos através da ativação de FOXO Fator de Transcrição. PLoS ONE 5 (12): e15627. doi: 10.1371 /journal.pone.0015627
editor: Hiranmoy Das, The Ohio State University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 19 de setembro de 2010; Aceito: 17 de novembro de 2010; Publicação: 28 de dezembro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Ganapathy et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Resveratrol (3, 4 ‘, 5 tri- hydroxystilbene), um polifenol que ocorre naturalmente, apresenta benefícios para a saúde pleiotrópicas, incluindo as actividades anti-inflamatória, anti-oxidante, cardioprotectores e antitumorais [1], [2], [3], [4]. Actualmente, numerosas resultados pré-clínicos sugerem que o resveratrol como um agente promissor para a prevenção e /ou tratamento do cancro. Como um potencial agente anti-cancro, o resveratrol foi mostrado para inibir ou retardar o crescimento de várias células de cancro in
in vitro
e implantados tumores in vivo [5], [6], [7], [8] [9]. O resveratrol foi mostrado para inibir a activação de JAK2-STAT3, Src-STAT3, AKT e vias de IKK-NFkB e para induzir a apoptose de várias linhas celulares de cancro [10], [11], [12], [13]. Nós demonstramos recentemente que o resveratrol regulada negativamente a expressão de Bcl-2, Bcl-X
L e survivina e regulada positivamente a expressão da Bax, Bak, Puma, Noxas, e Bim e receptores de morte (TRAIL-R1 /DR4 e TRAIL- R2 /DR5) [1], [14], [15]. Além disso, o tratamento da próstata células cancerosas com resveratrol resultou na geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), a translocação de Bax para a mitocôndria e subsequente queda no potencial de membrana mitocondrial, liberação de proteínas mitocondriais (citocromo c, Smac /DIABLO, e AIF) para citosol , a activação de caspase-3 efectora e caspase-9, e a indução de apoptose [1], [14], [15]. produção de ROS induzida pelo resveratrol, caspase-3, a actividade e a apoptose foi inibida pela N-acetilcisteína, sugerindo que a produção de ROS, pelo menos em parte, desempenha um papel na mediação da actividade anti-cancro do resveratrol [1], [14], [15]. Resveratrol aumentaram o potencial de indução de apoptose de TRAIL em células PC-3 e LNCaP do cancro da próstata TRAIL-resistente sensibilizados
in vitro
[1], [14], [15]. No geral, estes dados sugerem que o resveratrol pode regular a múltiplas vias de sinalização e possui vários benefícios terapêuticos.
Sinalização
PI3K desempenha um papel central em vias de transdução de sinal intracelulares envolvidos na transformação celular, crescimento celular, e a tumorigénese [16], [ ,,,0],17]. A inactivação dos resultados AKT em desfosforilação e activação de factores de transcrição FOXO, relatado para mediar a detenção do ciclo celular, a reparação do ADN, e a apoptose [18], [19]. Estes fatores de transcrição, pertence ao subgrupo ‘O’ da alado-hélice /forkhead-fator de transcrição da família, consistem principalmente de quatro membros FoxO1, FOXO3a, FOXO4 e FOXO6 [20]. FOXO proteínas são evolutivamente conservada factores de transcrição envolvidos em vários processos celulares fundamentais, funcionando como ponto final para os programas de transcrição envolvidos na apoptose, resposta ao stress e longevidade [21], [22]. Desde revogação da função FOXO é frequentemente observada no cancro humano, a reativação de proteínas FOXO será uma estratégia atraente para a terapia e prevenção do câncer. As proteínas reguladoras FOXO integrar entradas a partir de uma variedade de vias de sinalização a montante, mais importante ainda, em resposta ao factor de crescimento e stress sinalização [23]. Recentemente, factores FOXO foram estabelecidas como supressores tumorais, promovendo a transcrição de moléculas pró-apoptóticos tais como Bim FasL e quando a via PI3K /AKT é regulada negativamente por esgotamento de nutrientes ou de soro e stress celular [24], [25]. modelos triplos rato knockout provaram as propriedades supressores de tumor de Foxos, como ratos, simultaneamente, faltando os principais membros da subfamília FOXO mamíferos, FOXO1, FOXO3a e FOXO4, são propensas a desenvolver hemangiomas e doenças linfoproliferativas [26]. Por outro lado, o indivíduo ou inactivação de FOXO1 emparelhado, ou FOXO3a FOXO4 resultou num fenótipo menos grave, apoiando a ideia de redundância funcional destes factores FOXO [26]. Além disso, a expressão forçada de FOXO foi demonstrado inibir a tumorigénese em modelos de xenoenxerto em ratinhos nus [27], [28]. Portanto, a reactivação de FOXO com base nas suas propriedades supressoras de tumores é considerada como uma estratégia muito atraente anti-cancro. Desde proteínas FOXO foram relatados para ser mediadores críticos de apoptose induzida por fármacos anti-cancerígenos, postulamos que a expressão ou actividade de transcrição FOXO poderia ser evento importante na mediação dos efeitos do resveratrol.
ligando indutor de apoptose relacionado com TNF (TRAIL ) foi demonstrado que TRAIL-R1 /DR4 e TRAIL-R2 /DR5 [29]. Nós e outros autores mostraram que TRAIL pode induzir a apoptose em diversos tipos de células de cancro [29], [30], [31], [32], [33]. Com base em dados pré-clínicos, parece que TRAIL tem uma grande promessa como um agente anti-cancro selectivo [31], [32]. O resveratrol foi mostrada para aumentar o potencial terapêutico de TRAIL
In vitro
[14], [34]. As interações de resveratrol e TRAIL foram bloqueados por qualquer FADD negativo dominante ou caspase-8 siRNA [14], [15]. A combinação de resveratrol e TRAIL aumentou as disfunções mitocondriais durante a apoptose. o tratamento com resveratrol pode activar a via de morte TRAIL-receptor mediada extrínseca, aumentando assim a sensibilidade a TRAIL em células de cancro da próstata. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais o resveratrol pode melhorar o potencial terapêutico da TRAIL
in vivo
não foi examinado.
O objetivo do nosso estudo foi investigar os mecanismos moleculares pelos quais o resveratrol aumenta a potencial terapêutico de TRAIL em xenoenxertos de cancro da próstata em ratinhos nus. Os nossos resultados indicam que o resveratrol inibiu PC-3 e o crescimento de xenoenxerto de marcadores de metástase, e a angiogénese através da activação dos factores de transcrição FOXO. Assim, os nossos dados sugerem que o resveratrol pode ser usado sozinho ou em combinação com TRAIL para a gestão de de cancro da próstata.
Resultados
resveratrol aumenta a actividade anti-tumoral de tumores de TRAIL em xenoenxertos PC-3
in vivo
Temos demonstrado recentemente que o resveratrol pode melhorar o potencial de indução de apoptose de TRAIL
in vitro
. Portanto, no presente estudo, examinamos se o resveratrol pode melhorar a atividade antitumoral do TRAIL
in vivo
. As células de PC-3 foram xenoenxertado em ratinhos Balb C ratinhos nus. Após a formação do tumor, estes ratinhos foram tratados com resveratrol, TRAIL, ou mais resveratrol TRAIL durante 6 semanas e foram examinados os efeitos desses agentes sobre o crescimento do tumor. O resveratrol e TRAIL sozinho inibiu o crescimento de xenoenxertos PC-3 (Fig. 1). Em comparação, a combinação do resveratrol e TRAIL foi mais eficaz na inibição do crescimento do tumor do que o único agente sozinho.
(A), as células PC-3 foram injectados nos flancos direitos de ratinhos nus Balb C. Após a formação de tumor (cerca de 100 milímetros
3), os ratinhos foram tratados com solução salina, o resveratrol (30 mg /kg, três dias por semana), TRAIL (15 mg /kg, quatro vezes, durante as primeiras três semanas) ou resveratrol mais TRAIL . O volume do tumor foi medido semanalmente. Os dados representam a média ± SE. *, # E $ são significativamente diferentes do controle, P . 0,05)
Estes dados sugerem que o resveratrol pode melhorar a atividade antitumoral de TRAIL no cancro da próstata
Regulamento do tumor. proliferação celular e apoptose pelo resveratrol e /ou TRAIL em PC-3 xenoenxertos
proliferação celular e da apoptose pode regular o tamanho do tumor em qualquer momento dado. Portanto, foi realizada imuno-histoquímica em tecidos de tumor para medir a expressão de Ki67 e PCNA, e ensaio de TUNEL para medir a apoptose (Fig. 2A). proliferação de células de tumor foi medida por contagem de células Ki67 e PCNA positivos, e a apoptose foi medida por contagem de TUNEL de células positivas (Fig. 2B-D). Tratamento de ratinhos com resveratrol e TRAIL sozinho resultou na inibição da proliferação de células de tumor, e na indução de apoptose. A combinação de resveratrol e TRAIL foi mais eficaz na inibição da proliferação de células tumorais e induzir a apoptose do que um único agente sozinho. Estes dados sugerem que o resveratrol, embora eficazes por si só, pode aumentar a actividade antitumoral de TRAIL no cancro da próstata.
(A), A imuno-histoquímica foi realizada em tecidos de tumor derivadas de controlo, o resveratrol e /ou ratinhos tratados TRAIL na semana 6 para medir a proliferação celular por Ki67 e PCNA coloração e apoptose pelo ensaio de TUNEL. (B, C e D), Quantificação de Ki67, PCNA e células tumorais positivas TUNEL. lâminas de tumor de diferentes grupos de tratamento foram visualizadas ao microscópio, e as células positivas de Ki67, PCNA e TUNEL foram quantificados. Os dados representam a média ± SE. * E ** são significativamente diferentes dos seus respectivos controles, P . 0,05)
In vivo
regulação do receptor de morte TRAIL-R1 /DR4 e TRAIL-R2 /DR5 por resveratrol e /ou trilha
Uma vez que o resveratrol aumenta o potencial terapêutico de TRAIL através da indução de apoptose
in vivo
, procurou-se analisar os mecanismos moleculares pelos quais o resveratrol aumenta a atividade antitumoral de TRAIL em PC- 3 xenotransplantes. A seguir, examinou os efeitos do resveratrol e /ou TRAIL na expressão de receptores de morte (TRAIL-R1 /DR4 e TRAIL-R2 /DR5) por imuno-histoquímica em tecidos tumorais derivados de
in vivo
experimento (Fig. 3A painéis à direita, à esquerda e). Tratamento de ratinhos com resveratrol aumentou as expressões de DR4 e DR5. TRAIL induziu ligeiramente a expressão de DR4 e DR5. Por outro lado, o tratamento de ratinhos com uma combinação de resveratrol mais TRAIL mostrou significativamente melhoradas expressão das proteínas de DR4 e DR5 do que a de ratos tratados com resveratrol isoladamente ou TRAIL sozinho.
(A), A imuno-histoquímica foi realizada para medir as expressões de TRAIL-R1 /DR4 e TRAIL-R2 /DR5 em tecidos tumorais derivadas de controle e tratados ratos na semana 6. Quantificação de DR4 e DR5 células positivas também são mostrados no painel direito. (B), expressões de TRAIL-R1 /DR4, TRAIL-R2 /DR5 e β-actina nos tecidos tumorais derivados na semana 6. análise de Western blot foi realizada para medir a expressão de DRs (painel esquerdo). Quantificação de DR4 e DR5 células tumorais positivas para (painel direito). (C), Medição de DR4 e DR5 por ELISA. Proteínas extractos foram preparados e as expressões de DRs foram medidos de acordo com as instruções do fabricante.
confirmaram os dados de imuno-histoquímica, examinando a expressão destas proteínas por análise de Western blot (Fig. 3B). Tratamento de ratinhos com resveratrol e TRAIL sozinho resultou na supra-regulação de receptores de morte DR4 e DR5. Por comparação, o resveratrol mais tratamentos TRAIL teve mais efeitos sobre a indução de DR4 e DR5 em relação ao único agente sozinho. Estes dados estão de acordo com os dados de imuno-histoquímica onde as proteínas DR4 e DR5 proapoptotic foram regulados positivamente.
A seguir, confirmou a imunohistoquímica e dados western blot, examinando as expressões de DRs por ELISA (Fig. 3C, painel da direita). Tratamento de ratinhos com resveratrol e TRAIL sozinho regulada positivamente a expressão de receptores de morte (DR4 e DR5). Em comparação, a combinação de resveratrol mais TRAIL induzida mais expressões DR4 e DR5 do que único agente sozinho. Estes dados estão de acordo com imunohistoquímica e dados western blot onde as proteínas DR4 e DR5 proapoptotic foram regulada pelo resveratrol e TRAIL. -Regulação de DRs pode aumentar o potencial de indução de apoptose de TRAIL.
In vivo
regulação do Bcl-2 membros da família e proteínas reguladoras do ciclo celular pelo resveratrol e /ou TRAIL
uma vez que os membros da família Bcl-2 desempenham um papel importante na apoptose, procurou-se examinar a expressão de Bax e Bcl-2 em tecidos de tumor derivadas de resveratrol e /ou ratinhos tratados com TRAIL (Fig. 4A, painel da esquerda). Tratamento de ratinhos com resveratrol e TRAIL sozinho resultou na supra-regulação de Bax, e a inibição da expressão de Bcl-2. Em comparação, a combinação do resveratrol mais TRAIL foi mais eficaz em inibir a regulação positiva de Bax e Bcl-2. A seguir, confirmou os dados de Western blot, examinando as expressões dessas proteínas por imuno-histoquímica (Fig. 4A, médio e painéis da direita). O tratamento de ratinhos com resveratrol regulada positivamente a expressão do Bax e inibiu a expressão de Bcl-2. Por comparação, o tratamento de ratinhos com uma combinação de resveratrol mais TRAIL teve mais efeitos sobre a supra-regulação de Bax e inibição de Bcl-2 do que o único agente sozinho.
(A), a análise por Western blot foi realizada para medir a expressões de Bax e Bcl-2 em tecidos de tumor derivadas de controlo, o resveratrol e /ou ratinhos tratados trilha na semana 6 (painel esquerdo). A imuno-histoquímica foi realizada para medir as expressões de Bax e Bcl-2 em tecidos de tumor derivadas de ratinhos de controlo e tratados com fármaco na semana 6 (painel do meio). Quantificação de Bax e Bcl-2 de células positivas em células tumorais (painel da direita). (B), análise por Western blot foi realizada para medir as expressões de p27
/KIP1 e ciclina D1 em tecidos tumorais derivadas de ratinhos de controlo e tratados com fármaco na semana 6 (painel esquerdo). A imuno-histoquímica foi realizada para medir as expressões de p27
/KIP1 e ciclina D1 em tecidos tumorais derivadas de camundongos controle e drogas tratados na semana 6 (painel do meio). Quantificação de p27 células
/KIP1 e ciclina D1 positivas em tecidos tumorais (painel direito).
A seguir, examinou os efeitos do resveratrol e /ou TRAIL sobre a expressão da p27
/KIP1 e ciclina D1 em tecidos de tumor por transferência de Western e imuno-histoquímica (Fig. 4B). O tratamento de ratinhos com resveratrol resultou na indução de p27 inibidor do ciclo celular
/KIP1 e inibição da expressão de ciclina D1 (Fig. 4B). Por comparação, TRAIL teve nenhum efeito significativo sobre a expressão de p27, mas um pouco inibiu a expressão de ciclina D1 em relação ao grupo de controlo. No entanto, a combinação do resveratrol e TRAIL mostraram regulação positiva de p27, e a inibição da ciclina D1 em relação ao único agente sozinho. A seguir, confirmou os dados de Western blot com dados de imuno-histoquímica, examinando as expressões destas proteínas (Fig. 4B, médio e painéis da direita). TRAIL não tem efeito significativo sobre a expressão de p27, mas um pouco inibiu a expressão de ciclina D1. Por comparação, o resveratrol induzida a expressão de p27, e inibiu a expressão de ciclina D1. Estes dados sugerem que o resveratrol pode regular o ciclo celular por cima-regulação da expressão de P27 e inibição da expressão de ciclina D1.
In vivo
regulação da MMP-2 e MMP-9 por expressão resveratrol e /ou TRAIL
expressões elevados de metaloproteinases de matriz (MMPs) são associados com o aumento do potencial metastático em muitas células tumorais [35], [36], [37]. Por isso, procurou examinar os efeitos do resveratrol sobre a MMP-2 e MMP-9 expressões em tecidos tumorais derivadas de ratinhos nu xenoenxertado por imuno-histoquímica e análise de Western blot. O tratamento de ratinhos xenogrfated com resveratrol resultou numa inibição de MMP-2 e MMP-9 expressões do que as de controlo ou TRAIL grupo tratado (Fig. 5A e B). A combinação de resveratrol e TRAIL foi mais eficaz na inibição da MMP-2 e MMP-9 expressões do que único agente sozinho. A seguir, os dados de imuno-histoquímica confirmou examinando as expressões de estas proteínas por análise de Western blot (Fig. 5C). TRAIL não tem nenhum efeito significativo sobre as expressões de MMP-2 e MMP-9. Por comparação, o resveratrol ou mais resveratrol TRAIL inibiram a expressão de MMP-2 e MMP-9. Estes dados sugerem que o resveratrol e /ou TRAIL pode inibir metástases de cancro da próstata através da inibição de MMP-2 e MMP-9.
(A), A imuno-histoquímica foi realizada para medir as expressões de MMP-2 e MMP-9 em tecidos tumorais derivadas de controlo, o resveratrol e /ou ratinhos TRAILtreated na semana 6. (B), Quantificação de MMP-2 e MMP-9 de células positivas em tecidos tumorais. (C), expressões de MMP-2, MMP-9 e β-actina nos tecidos tumorais foram medidos na semana 6 pela análise de Western blot.
In vivo
regulação da angiogénese pelo resveratrol e /ou TRAIL
se regressão no crescimento do tumor pelo resveratrol e /ou TRAIL foi devido à inibição da angiogénese, foram analisados os marcadores de angiogénese por imuno-histoquímica em tecidos de tumor derivadas de controlo e os ratos tratados (Fig . 6). Em primeiro lugar, examinou os efeitos do resveratrol e /ou tratamento de TRAIL no número de vasos sanguíneos em tecidos tumorais, utilizando três abordagens diferentes (Fig. 6A). Os vasos sanguíneos foram examinados por coloração dos tecidos tumorais por H E, anticorpo anti-CD31, e anticorpo anti-vWF. O tratamento de ratinhos com resveratrol ou TRAIL causou uma inibição no número de vasos sanguíneos. Por comparação, o tratamento de ratinhos com uma combinação de resveratrol mais TRAIL inibiram ainda mais o número de vasos sanguíneos.
, ratos painel esquerdo, secções de tecido de tumor derivadas de controlo, o resveratrol e /ou TRAIL tratados (A) nas semana 6 foram coradas com H E eo número de vasos sanguíneos foram contados em 400 X ampliação. Cada coluna representa a média ± DP. * Ou ** = significativamente diferente do controlo, P 0,05. Painel central, a quantificação de vasos sanguíneos em tumores derivados na semana 6. As secções de tumor de controlo e ratos tratados com o fármaco foram coradas com anticorpo anti-CD31, e o número de vasos sanguíneos CD31-positivas foram contadas. Os resultados são apresentados como a média ± DP. * Ou ** = significativamente diferente do controlo, P 0,05. Painel da direita, a partir de secções de tumor de controlo e ratos tratados com o fármaco obtidos na semana 6 foram coradas com anticorpo anti-factor de von Willebrand (vWF) para avaliar os vasos sanguíneos. Os resultados são apresentados como a média ± DP. * Ou ** = significativamente diferente do controlo, P 0,05. (B), painel esquerdo, imuno-histoquímica foi realizada para medir a expressão de VEGF em tecidos tumorais derivadas de ratinhos de controlo e tratados com fármaco na semana 6. Painel da direita, a quantificação de células positivas de VEGF em tecidos tumorais. painel da direita, a quantificação de células positivas VEGF. Os resultados são apresentados como a média ± DP. * Ou ** = significativamente diferente do controlo, P 0,05. Painel inferior, expressões de VEGF e β-actina em tecidos de tumores em seis semanas foram medidos por análise de Western blot. (C), do receptor de VEGF 2 (VEGF-R2) -positivo células endoteliais circulantes em ratinhos na semana 6. As células de sangue periférico a partir de sangue ligado à corrediça foram coradas com anticorpo anti-VEGF-R2, e o número de VEGF-R2 As células positivas foram contadas sob um microscópio. Os resultados são apresentados como a média ± DP. * Ou ** = significativamente diferente do controle, P . 0,05
A seguir, examinou a expressão de VEGF por imuno-histoquímica e análise Western blot (Fig 6). O exame de tecidos de tumores por imuno-histoquímica mostrou que os ratinhos de controlo tinham aumentado células endoteliais VEGF-positiva em comparação com o resveratrol ou TRAIL ratinhos tratados (Fig. 6B, os painéis esquerdo e direito). A combinação de resveratrol mais TRAIL mostraram significativamente menos coloração VEGF do que o único agente sozinho. A seguir, confirmou os dados de imuno-histoquímica da expressão de VEGF através da análise dos níveis de proteína por análise de Western blot (Fig. 6B, painel inferior). Tratamento de ratinhos com resveratrol e TRAIL sozinho inibiu a expressão de VEGF. Por comparação, o resveratrol mais TRAIL inibiram a expressão de VEGF.
Demonstrámos que os números circulantes de vascular do receptor do factor de crescimento endotelial 2 (VEGF-R2), as células endoteliais -positivas directamente correlacionadas com o aumento da angiogénese tumoral e pode servir como
in vivo
indicadores de angiogênese do tumor [31], [38]. Como esperado, os ratinhos de controlo tinham aumentado células endoteliais circulantes de VEGF-R2-positivos em comparação com ratinhos tratados com o resveratrol (Fig. 6C). Resveratrol além grupo tratado com TRAIL demonstraram significativamente menos células VEGFR2 positivo do que o de grupo resveratrol ou TRAIL tratada. Estes dados demonstram fortemente que o resveratrol pode inibir o crescimento do tumor através da inibição da angiogênese, e também pode promover a atividade antitumoral do TRAIL
in vivo
.
In vivo
regulação do fator de transcrição FKHRL1
AKT tem sido demonstrado que fosforila FKHRL1, e a inibição da fosforilação FKHRL1 faz com que a sua translocação nuclear, ligação de ADN e a actividade de transcrição reforçada [39]. A seguir, analisou se as atividades antitumorais de resveratrol e /ou TRAIL são exercidas através da ativação de FKHRL1 (Fig. 7). Resveratrol e TRAIL inibiram a fosforilação de FKHRL1; No entanto, o resveratrol era mais eficaz do que TRAIL. A combinação de resveratrol e TRAIL teve mais efeito na inibição da fosforilação de FKHRL1 de agente único sozinho. A seguir, examinou a fosforilação de FKHRL1 em tecidos de tumores por imuno-histoquímica (Fig. 7B e C). O resveratrol e TRAIL inibiram os níveis citoplasmáticos de FKHRL1 fosforilado como mostrado na Fig. 7B e quantificados na Fig. 7C. A combinação de resveratrol mais TRAIL teve mais efeito na inibição níveis cytoplamic de FKHRL1 fosforilada do que único agente sozinho. Estes dados sugerem que o resveratrol e TRAIL podem inibir a fosforilação de FKHRL1, o que pode resultar em sua translocação nuclear e activação.
(A), a inibição da fosforilação FKHRL1 pelo resveratrol. A análise por Western blot foi realizada para medir a expressão de fosfo-FKHRL1 em tecidos tumorais derivadas de controlo e /ou de ratinhos tratados com fármaco na semana 6. (B), imuno-histoquímica exame de fosfo-FKHRL1. A imuno-histoquímica foi realizada para medir a expressão de fosfo-FKHRL1 em tecidos tumorais derivadas de controlo, o resveratrol e /ou ratinhos tratados trilha na semana 6. (C), A quantificação de células positivas FKHRL-em tecidos tumorais. , Actividade de ligação FKHRL1-ADN (D). Os extractos nucleares foram preparados a partir de tecidos tumorais derivadas de ratinhos de controlo e tratados com droga. Gelshift ensaio foi realizado para medir a actividade de ligação FKHRL1-DNA como descrito em Materiais e Métodos.
próxima examinada a actividade de ligação por ensaio gelshift (Fig. 7D) FKHRL1-ADN. Os extractos nucleares foram preparados a partir de tecidos tumorais derivadas de resveratrol e /ou ratinhos tratados TRAIL. dados Gelshift revelou que TRAIL e actividades de ligação com DNA FKHRL1 resveratrol reforçada. A combinação de resveratrol e TRAIL teve uma actividade de ligação significativamente mais FKHRL1-DNA do que o único agente sozinho. No geral, estes dados sugerem que o resveratrol e TRAIL podem inibir a fosforilação de FKHRL1 que conduz à sua translocação nuclear aumentada e actividades de ligação ao ADN.
Discussão
Demonstrámos recentemente que o resveratrol induz apoptose em TRAIL- células LNCaP TRAIL-resistentes sensíveis células PC-3, e sensibiliza
in vitro
através da ativação de múltiplas vias de sinalização [14], [15]. induzida pelo resveratrol apoptose envolve mitocôndrias, como foi mostrado por uma queda no potencial de membrana mitocondrial e activação de caspase-3 e caspase-9, em ambos cancro da próstata PC-3 e LNCaP de células [14], [15]. Resveratrol expressão induzida de proteínas pró-apoptóticos (Bax, Bak, Puma, Noxa e BIM), receptores de morte (TRAIL-R1 /DR4 e TRAIL-R2 /DR5) e expressão inibida de proteínas anti-apoptóticos (Bcl-2 e Bcl-X
L) e IAP (XIAP e survivina). Em nosso estudo recente, o resveratrol regulada a expressão de TRAIL, DR4, DR5, Bim, p27
/KIP1 e ciclina D1 através FOXO fatores de transcrição
in vitro
e inibição da FKHRL1, FKHR e AFX por RNAi bloqueadas esses efeitos do resveratrol [40]. No presente estudo, temos validado nossos
in vitro
resultados e demonstraram que o resveratrol e TRAIL sozinho inibiu o crescimento de PC-3 xenotransplantes, metástase e angiogênese por meio da ativação de fatores de transcrição FOXO. Curiosamente, a combinação do resveratrol e TRAIL teve um maior efeito sobre a inibição do crescimento do tumor, metástase e angiogénese do que qualquer agente isolado.
In vitro
resveratrol regulada negativamente as expressões de Bcl-2 e Bcl -X
L e regulada a expressão de p53, Bax, Bak, PUMA, Noxa e Bim em mRNA e os níveis de proteína em células cancerosas da próstata [41]. Nós também têm demonstrado que o resveratrol regulada positivamente a expressão, fosforilação, e acetilação de p53 em células LNCaP dependente de androgénios [41]. A capacidade de resveratrol para regular a transcrição de gene também foi evidente, uma vez que causou acetilação da histona H3 e H4 em células LNCaP [41]. Além disso, o tratamento de células LNCaP com resveratrol resultou em translocação de Bax e p53 para a mitocôndria, a produção de espécies reativas de oxigênio, queda de potencial de membrana mitocondrial, liberação de proteínas mitocondriais (citocromo c, Smac /Diablo e Omi /HtrA2), e ativação de caspase-3 conduz a apoptose [41]. Além disso, a supressão dos genes Bax e Bak completamente inibida induzida pelo resveratrol citocromo c e liberação Smac /DIABLO em fibroblastos de rato embrionárias [42]. No presente estudo, o tratamento de ratinhos xenoenxertados com resveratrol resultou numa regulação negativa da proteína Bcl-2 e sobre-regulação de Bax. A combinação de resveratrol mais TRAIL foi mais eficaz na regulação do Bcl-2 membros da família do que único agente sozinho. Nossos
in vitro
dados publicados anteriormente estão de acordo com os actuais
In vivo
estudos que demonstram que o resveratrol pode participar via celular intrínseca da apoptose através da regulação da expressão de Bcl-2 família de proteínas.
FOXO factores de transcrição são supressores tumorais inactivados que são na maioria dos cancros humanos, em virtude da sobreactivação da via PI3K /AKT [43]. proteínas FOXO pode regular uma variedade de genes que influenciam a proliferação das células, a sobrevivência, o metabolismo e a resposta ao stress [19], [20], [44]. factores de transcrição FOXO são regulados por síntese, acetilação, fosforilação e ubiquitinação em três níveis diferentes: a localização subcelular, de estabilidade e de actividade de transcrição [19], [20], [44]. Após a ativação da sinalização PI3K /AKT, Foxos sofrer fosforilação mediada por AKT, que promove a ligação de 14-3-3, a exportação nuclear através CRM1 e sequestro citoplasmático. Sob condições de stress ou na ausência de factores de crescimento ou de sobrevivência, quando a via PI3K /AKT é inibida, proteínas FOXO translocar para o núcleo da célula, onde as suas funções de transcrição pode ser executado [45]. Uma segunda camada de regulamentação é FOXO acetilação por p300, o CBP (proteína de ligação CREB) e PCAF (P300 /factores CBP-associados) em resposta ao estresse oxidativo ou DNA de ligação [46], [47], [48], seguida por desacetilação por classe I e II histona desacetilases [48], [49], [50], incluindo Sirt1, o NAD
+ – desacetilase dependente codificada pelo gene de levedura ortólogo de longevidade Sir2 [51]. Demonstrámos recentemente que a inibição da via /AKT reforçada FOXO-ADN de ligação PI3K e actividade de transcrição [40], [52]. Além disso, a fosforilação mutante deficiente de FOXO melhorada actividade de transcrição induzida FOXO-resveratrol e apoptose. modificação pós-traducional de proteínas FOXO é um mecanismo importante que regula a capacidade de factores de transcrição diferentes para activar conjuntos de genes distintas, envolvido na inibição do ciclo celular [53], a apoptose [54], a defesa contra o stress oxidativo e de reparação do ADN [55]. A actividade de ligação de ADN aumentada também serve para limitar a disponibilidade de proteínas FOXO para a fosforilação por AKT [46]. No presente estudo, demonstrámos que o resveratrol apoptose induzida em células de cancro da próstata através da activação dos factores de transcrição FOXO. Da mesma forma, em outro estudo, demonstramos que a inibição de fatores FOXO transcrição por shRNA bloqueada regulação positiva induzida pelo resveratrol de Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27
/KIP1 e apoptose e inibição induzida pelo resveratrol da ciclina D1 no cancro da próstata células
in vitro
[40]. Os nossos dados sugerem que o resveratrol induz a paragem do ciclo celular e a apoptose através da regulação dos factores de transcrição FOXO em células de cancro da próstata.
O FOXO factores de transcrição têm sido mostrados para ser constitutivamente activado em várias malignidades humanas, incluindo cancro da próstata [39] , [56]. Foxos são mostrados para contribuir para o desenvolvimento e /ou a progressão da doença maligna através da regulação da expressão de genes envolvidos no crescimento celular, diferenciação, apoptose, angiogénese e metástase [39], [56].