Sumário

Cdc37 é uma chaperona molecular 50 kDa que tem como alvo proteínas quinases intrinsecamente instáveis ​​para a chaperona molecular HSP90. É também uma oncoproteína sobre-expresso que medeia a carcinogénese e na manutenção do fenótipo maligno, estabilizando as estruturas comprometidas de quinases oncogénicas mutante e /ou sobre-expressas. Aqui mostramos que Cdc37 não se restringe intracelularmente, mas em vez disso, está também presente na superfície de células MDA-MB-231 de cancro da mama humano MDA-MB-453 e, onde é mostrada a participar em processos de motilidade das células cancerosas. Além disso, demonstramos utilizando um anticorpo impermeável de células anti-Cdc37, que de forma semelhante ao seu homólogo intracelular, esta piscina superfície de Cdc37 interage especificamente com a Hsp90, bem como os receptores de quinase HER2 e EGFR na superfície da célula, provavelmente actuando como um co-factor em actividades chaperoning extracelulares de HSP90. Finalmente, mostra-se que a inibição funcional de HSP90 superfície utilizando mAb 4C5, um anticorpo monoclonal impermeável célula contra esta proteína, conduz não só à interrupção do Cdc37 /HSP90 complexo, mas também à inibição dos complexos receptores Cdc37 /ErbB. Estes resultados suportam um papel essencial para a superfície Cdc37 em concerto com HSP90 na superfície celular durante os processos de invasão de células de cancro e reforçar o potencial terapêutico de mAb 4C5 para o tratamento de cancro

citação:. Hamidieh El A, N Grammatikakis , Patsavoudi E (2012) Superfície celular Cdc37 Participa celular extracelular HSP90 Cancer Mediated Invasion. PLoS ONE 7 (8): e42722. doi: 10.1371 /journal.pone.0042722

editor: Wanjin Hong, do Instituto de Biologia Molecular e Celular, Singapura

Recebido: 29 de março de 2012; Aceite: 10 de julho de 2012; Publicação: 17 de agosto de 2012

Direitos de autor: © El Hamidieh et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. AEH recebeu uma bolsa do Instituto Pasteur helênico. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

HSP90 é uma chaperona molecular que funciona em associação com uma coorte de co-chaperonas para guiar a estabilização e a activação de uma matriz de proteínas de sinalização, incluindo quinases oncogénicas, factores de transcrição e receptores de hormonas [1], [2 ]. Cdc37 (divisão celular proteína ciclo 37) é considerada como um componente essencial da presente máquinas chaperona multimérica, que joga um papel especializado e indispensável para a maturação e /ou estabilização de um grande subconjunto de proteínas quinases, implicada na transdução de sinal, proliferação e sobrevivência [ ,,,0],3]. Ao bloquear o fecho do N-terminal de HSP90 local de ligação de ATP, Cdc37 inibe a actividade de ATPase de HSP90 [4] e auxilia o carregamento de proteínas cinase de cliente para a maquinaria chaperona [4], [5]. Ιn particular, Cdc37 atua como um adaptador ou andaime, facilitando a interação quinase cliente com HSP90 [6] e, posteriormente, através do recrutamento destes cliente quinases no complexo HSP90, estabiliza e /ou mantém-los em uma conformação dobrar-competente [7]. Além disso, Cdc37 promove a montagem de complexos HSP90-proteína-quinase [8] e expressão de uma forma dominante negativa que não possui o domínio de ligação a HSP90 inibe a activação da cinase em células de mamíferos [9]. Muitas proteínas cliente interagir directamente com ambos Cdc37 e HSP90 e a sua dobragem, maturação e estabilidade dependem da actividade de ambas as chaperonas. Daí Cdc37 medeia a formação de complexos HSP90 a CDK4 [10] e estas interacções são necessárias para a estabilidade e função das proteínas quinase HSP90-RAF1 [9] e. A relação entre o complexo de Cdc37 e HSP90 é ilustrado pela verificação de que a sua interacção é estabilizada pela proteína cliente [11]. Nos últimos anos, tem havido cada vez mais provas demonstrando que a HSP90 intracelular desempenha um papel fundamental na aquisição e manutenção do fenótipo maligno [12], [13], [14], [15]. Por conseguinte, existe um interesse crescente em Cdc37 no contexto de malignidade [16], [17] uma vez que Cdc37 também regula vários clientes quinase oncogénicos. De facto os níveis de Cdc37 são encontrados aumentado em muitos cancros clínicos [17]. Em particular, Cdc37, é aumentada em tecidos em proliferação, e é fortemente expressa em certos cancros incluindo linfoma anaplásico de células grandes [18] leucemia mielocítica aguda [19], o carcinoma hepatocelular [20] e do mieloma múltiplo [21]. Além disso, os dados foram apresentados indicando que Cdc37 pode funcionar como um oncogene, como ratos geneticamente modificados para sobre-expressa Cdc37 desenvolver tumores com uma frequência elevada [22], o que sugere que a criação das vias de proteína-cinase mediada por HSP90 /Cdc37 pode ser uma taxa -limiting evento na transformação de células epiteliais [22]. Mais recentemente, tem sido demonstrado que a Cdc37 é essencial para a manutenção do crescimento de células de tumor da próstata [23]. Além disso, o receptor alfa do factor de crescimento derivado de plaquetas, que é sobre-regulada e activada em muitos tumores malignos forma um complexo com HSP90, co-chaperonas Cdc37 no ovário, glioblastoma, e cancro do pulmão células [24]. Em conjunto, estes resultados suportam a segmentação de Cdc37 para a terapia do cancro.

e outros identificaram previamente uma piscina extracelular de HSP90, tanto em células normais e cancerosas, que foi mostrado estar envolvidas em processos de migração e invasão, respectivamente [ ,,,0],25], [26], [27], [28], [29], [30]. Além disso, e através da exploração da função de propriedades de um anticorpo monoclonal de células impermeável ao chamado mAb 4C5, dirigida especificamente contra a HSP90 de bloqueio que têm demonstrado que a HSP90 extracelular interage com HER-2 na superfície da célula [28], bem como metaloproteinases MMP-2 e MMP-9 [29]. Apesar de um número cada vez maior de co-chaperonas de HSP90 como HSP70, lúpulo e p23 foram também encontradas na superfície da célula [31], [32], [33], a sua acção e mecanismos subjacentes não foram ainda elucidados. Levando isto em consideração, no presente trabalho, exploramos a localização na superfície celular de Cdc37 e analisar o seu eventual envolvimento em processos de invasão de células de câncer, bem como os seus potenciais parceiros de interação durante este processo, usando o MDA-MB-453 e MDA linhas celulares de cancro da mama humano MB-231 e um anticorpo policlonal contra a Cdc37 comercialmente disponível. Além disso, e tendo em conta dados previamente relatados mostrando que mAb 4C5 inibe a invasão de células cancerosas por perturbar associação de HSP90 extracelular com HER2 [28] e metaloproteinases MMP2 e MMP9 [29] neste trabalho investigar o possível efeito dessa célula impermeável anti-HSP90 anticorpo sobre as interações de superfície Cdc37 com HSP90 e os receptores ErbB.

Materiais e Métodos

anticorpos e reagentes

MAb 4C5 foi produzido no nosso laboratório, como descrito anteriormente [ ,,,0],34]. No presente estudo, o mAb 4C5 foi utilizado como sobrenadante isento de soro concentrado em todas as experiências realizadas. Os anticorpos policlonais contra o EGFR, HER-2 e anticorpo monoclonal contra ciclina D1 foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Utilizaram-se dois anticorpos anti-Cdc37, a partir de Santa Cruz Biotechnology e Abcam que reconhecem epitopos diferentes. Os anticorpos policlonais contra a HSP90 eram da Chemicon International. DMEM, RPMI e soro fetal de bovino (FBS), foram de Invitrogen. Todos os outros materiais foram de fontes descritas anteriormente [25].

As culturas de células e imunofluorescência

HER-2 que sobre-expressam MDA-MB-453, o EGFR sobre-expressam-MDA-MB- 231 linhas celulares de cancro da mama e mama células epiteliais não cancerosas MCF-12A foram adquiridos da American Type Culture Collection. MDA-MB-453 e células MDA-MB-231 foram mantidas em meio RPMI e DMEM, respectivamente, suplementado com 10% de FBS. As células MCF-12A foram mantidas em meio F12 de DMEM-Ham suplementado com 20 ng /ml de EGF humano, 100 ng /ml de hidrocortisona, 0,01 mg /ml de insulina bovina e 10% de FBS.

Para estudos de imunof luorescência, as células foram plaqueadas em poli-L-lisina-revestidas, lamelas a uma densidade de 5 x 10

4 células /poço numa placa de 48 poços e cultivadas no meio adequado suplementado com FBS a 10%. Após 24 h, as células foram mudadas para meio isento de soro durante 18 h. Jogos de MDA-MB-453, MDA-MB-231 e MCF-12A células foram marcadas por imunofluorescência indirecta como relatado anteriormente [28]. Resumidamente, as células não fixadas foram incubadas com anticorpo de 2 ug /mL de anti-Cdc37 durante 2 h. As células foram então lavadas, fixadas em acetona arrefecida em gelo e marcada com anticorpo secundário conjugado com Alexa488-.

Preparação de lisados ​​de células, análises de mancha de Western e Co-imunoprecipitação

As células foram cultivadas em 25 cm

2 frascos em meio de cultura suplementado com 10% FBS até sub-confluência, deslocado em meio isento de soro durante 24 h e, em seguida, expostas a anti-Cdc37 e /ou o mAb 4C5 durante 16 h. As culturas de controlo foram cultivadas em meio de cultura, quer sozinho ou em meio de cultura contendo 200 ug /ml de um anticorpo monoclonal de IgG2a contra a proteína não relacionada BM88 [35]. anticorpo não ligado em excesso foi então removido por lavagem com meio fresco. As culturas foram imediatamente lavadas duas vezes com PBS gelado e lisadas, como descrito anteriormente [28].

fraccionamento celular foi realizado em culturas de células preparadas e tratadas como descrito acima, utilizando o kit de extracção de proteína por compartimentos (Chemicon), de acordo com as instruções do fabricante.

total e /ou lisados ​​de proteína compartimentados foram quantificadas, e quantidades iguais de proteína total foram submetidos a SDS-PAGE seguido por Western blot com os anticorpos apropriados. bandas imunorreactivas foram detectadas utilizando um reagente de quimioluminescência ECL (Amersham Biosciences) e a película X-Omat AR (Eastman Kodak Co.), como descrito pelos fabricantes.

Co-imunoprecipitação foi realizada como previamente descrito [25]. Em resumo, quantidades iguais de lisados ​​celulares pré- afastada foram incubadas com os anticorpos apropriados durante 18 h a 4 ° C. Os imunocomplexos foram então incubadas durante 2 h à temperatura ambiente com proteína G-Sepharose ‘e lavou-se três vezes com tampão de lise. As proteínas ligadas foram analisadas por electroforese em gel seguido por Western blot como descrito acima. Para todas as experiências de imunoprecipitação, controlos negativos foram realizados utilizando IgG irrelevante.

Anticorpo Internalização Ensaio

experiências de internalização de anticorpo foram realizados como previamente descrito [28]. Resumidamente, as células foram incubadas em cultura, enquanto com 200 ug /mL de anticorpo anti-Cdc37 durante 16 h. As células foram então lavadas e fixadas em acetona fria durante 3 min. Para a detecção de possível internalização do anticorpo, as células foram permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 em PBS e subsequentemente incubadas com anticorpo secundário conjugado com Alexa488-(Molecular Probes). Para todos os experimentos, os controles foram realizados utilizando mAb 4C5 que é célula impermeável e o comercial anti-HSP90 que é internalizado [27].

RNA de interferência

O plasmídeo pLL3.7 com uma inserção alvo Cdc37 foi usado. Cdc37 foi derrubado usando hairpin RNAs curtos. Para o efeito, o “Programa de Seleção siRNA WI” do Instituto Whitehead de Pesquisa Biomédica foi utilizado, para projetar e selecionar o siRNA segmentação Cdc37. A fim de criar uma estrutura de haste-laço, um espaçador (TTCAAGAGA) foi inserido nas sequências de sentido e anti- sentido. oligómeros de DNA foram recozidos e clonados no plasmídeo pLL3.7. A inserção foi confirmada por sequenciação. MDA-MB 453 e MDA-MB células 231 foram cultivadas a uma densidade de 70% e, em seguida, transfectadas com 3 ug de ADN plasmídico com as sequências inseridas ou não (controlo), utilizando o reagente de Xfect Transfecção de Clontech, de acordo com o protocolo do fabricante. 72 horas após a transfecção, as células foram recolhidas, lisadas e sujeitas a análise de Western blot. Para a detecção de imunofluorescência de Cdc37, as células foram plaqueadas em lamelas revestidas com poli-L-lisina e transfectadas com ADN de plasmídeo como acima. 72 horas após a transfecção, as células vivas foram lavadas com PBS, incubadas com anticorpo anti-Cdc37 durante 2 horas, fixadas com acetona arrefecida em gelo e marcada com anticorpo secundário-Alexa647.

Cicatrização de Feridas A motilidade Ensaio

O ensaio foi realizado como anteriormente descrito [28]. Resumidamente, MDA-MB-453 e células MDA-MB-231 foram plaqueadas numa placa de 48 poços a uma densidade de 1,5 x 10

5 células /poço e de 5 x 10

4 células /poço, respectivamente, e foram deixadas durante 24 horas em meio contendo soro, sem tratamento adicional. O meio foi em seguida mudado para isento de soro, e 16 horas mais tarde, uma área livre de células foi gerado por raspagem suave da monocamada de células com um amarelo ponta Gilson-pipeta estéril, resultando assim na formação de uma mistura 1 mm de largura célula área livre de. Imediatamente depois de coçar, o meio foi substituído com meio fresco, ou meio contendo o anticorpo anti-Cdc37. As culturas de controlo foram cultivadas em meio de cultura, quer sozinho ou em meio de cultura contendo 200 ug /ml de um anticorpo monoclonal de IgG2a contra a proteína não relacionada BM88 [35].

A migração de células de cancro da mama dentro do fosso foi monitorado microscopicamente em intervalos de tempo determinados, utilizando um microscópio invertido Leica DM IL, equipado com uma câmara de vídeo LEICA DM300 ligado a um computador. A inibição da migração foi calculada pela aquisição e análise de imagens digitais, utilizando o software de análise Pro Plus [36] e avaliados com duas formas diferentes, dependendo da linha celular estudada Imagem. Mais especificamente, para as células MDA-MB-453 foi expressa como a percentagem da distância percorrida pelas células nas culturas de controlo, ao passo que para as células MDA-MB-231 foi expressa como a percentagem de células observadas no interior do espaço da ferida em culturas de controlo análise estatística foi realizada usando

t

teste de Student.

Resultados

Cdc37 é expressa na superfície das células de MDA-MB-453 e MDA-MB-231 células de cancro da mama

de modo a examinar a localização na superfície celular de Cdc37, não fixadas MDA-MB-231 de cancro da mama humano MDA-MB-453 e foram incubadas com o anticorpo anti-Cdc37. As células foram então lavadas, fixadas e marcada com anticorpo secundário conjugado com Alexa488-. Assim, o anticorpo primário tinha acesso apenas à superfície externa da célula. A imunocoloração observado confirmou a localização na superfície celular de Cdc37 em ambas as linhas celulares de cancro da mama humano estudado (Fig. 1). Como controlo positivo, o mAb 4C5, que se liga especificamente à superfície de HSP90, cuja presença tem sido previamente demonstrado em ambas as linhas de células [28] [26] foi usado. Neste ponto, é de interesse notar que os ensaios de imunofluorescência mostrou, como esperado, não só ausência de Cdc37, mas também de HSP90 na superfície de células cancerosas adultos MCF-12A (Fig. S1). controlos positivos adicionais foram aplicadas, usando anticorpos contra a HER-2 e EGFR para as células MDA-MB-453 e MDA-MB-231, respectivamente. Finalmente os anticorpos contra o EGFR e HER2 foram utilizados como controlos negativos em MDA-MB-453 e células MDA-MB-231, respectivamente (Fig. 1A e B). Os resultados acima foram confirmados por transferência de Western utilizando fracções de membrana derivadas das duas linhas de células (Fig. 1C e D). foram usadas (FIG. 1D) anticorpos, como controlo positivo anti-HER2 (Fig. 1C) e anti-EGFR, em lisados ​​celulares de membrana MDA-MB-231 MDA-MB-453 e, respectivamente. Nas fracções citosólicas e como esperado anti-Cdc37 deu imunocoloração positiva ao passo que os anticorpos contra os receptores ErbB foram negativos. Além disso, as fracções citosólicas de ambas as linhas celulares deu imunocoloração positiva quando immunobloted com anticorpo contra a proteína intracelular Ciclina D1, enquanto que as fracções de membrana foram negativos (Fig. 1C e D), confirmando assim a pureza das fracções usado aqui e no immunoprecipitaion experiências descritas abaixo.

A, imunofluorescência indireta de células vivas MDA-MB 453 utilizando anticorpo anti-Cdc37. A imunomarcação revela a localização na superfície da Cdc37. Anti-HER2 e o mAb 4C5 Foram utilizadas como controlos positivos. O anticorpo anti -EGFR foi usado como controlo negativo. B, A imunofluorescência indirecta de células vivas MDA-MB 231 utilizando anticorpo anti-Cdc37. Anti-EGFR mAb 4C5 e foram utilizados como controlos positivos. Os anticorpos anti -HER2 foi usado como controlo negativo. C, fracionamento celular de MDA-MB 453 células, seguido por análise de Western blot confirmou a presença de Cdc37 em fracções da membrana celular. Os anticorpos anti-HER2 foram utilizados como controlos positivos e negativos na membrana e fracções citosólicas respectivamente. D, fracionamento celular de MDA-MB 231, seguido por análise de Western blot confirmou a presença de Cdc37 em fracções da membrana celular. Os anticorpos anti-EGFR foram utilizados como controlos positivos e negativos na membrana e fracções citosólicas respectivamente. Em C e D de anticorpo contra a proteína intracelular Ciclina D1 deu imunocoloração positiva e negativa nas fracções citosólica e membrana de ambas as linhas celulares, respectivamente. CF, fracção citosólico; MF, fracção de membrana. Barra de escala = 20 uM.

De modo a confirmar a especificidade do anticorpo comercial anti-Cdc37 usadas nos nossos estudos, a tecnologia siARN foi aplicado. Mais especificamente, quando MDA-MB-453 e MDA-MB-231cells transfectadas com ARNsi de segmentação Cdc37 foram imunocoradas, conforme descrito acima, com o anticorpo anti-Cdc37, uma rotulagem extremamente fraco foi observada quando em comparação com células transfectadas com o vector de controlo (Fig. 2 A e B). Da mesma forma, quando a análise Western blot utilizando o anticorpo anti-Cdc37 foi realizada em lisados ​​celulares totais derivados de células acima, uma diminuição significativa imunocoloração foi obtido nos lisados ​​da transfectadas com siARN dirigido contra Cdc37 quando comparado com contols (Fig. 2C e D ).

A, B, imunofluorescência da vivo MDA-MB 453 e MDA-MB 231, respectivamente, utilizando o anticorpo anti-Cdc37. As células foram transfectadas com ARNsi de segmentação Cdc37 (shRNA Cdc37) ou com ADN de plasmídeo sem qualquer inserção (controlo). ShRNA Cdc37 células transfectadas exibem níveis extremamente baixos de coloração por imunofluorescência de superfície, em comparação com os controlos. Barra de escala = 20 mm. C, D, análise de transferência de Western de lisados ​​de células totais derivados de MDA-MB 453 e MDA-MB 231, respectivamente, utilizando o anticorpo anti-Cdc37, em células transfectadas com ARNsi de segmentação Cdc37 e células de controlo. O nível de Cdc37 detectado é significativamente mais baixo em ambas as linhas celulares transfectadas com siRNA segmentação Cdc37, quando comparado com transfecções de controlo.

O anticorpo anti-Cdc37 é célula-impermeável

A célula natureza impermeável do anti-Cdc37 utilizado foi examinada por incubação das células MDA-MB-453 e MDA-MB-231, enquanto em cultura com o anticorpo durante 16 h. As células foram então cuidadosamente lavadas, e a ligação do anticorpo foi analisada após fixação e permeabilização de células, utilizando um anticorpo secundário conjugado com Alexa488-. Observou-se que para ambas as linhas celulares, os anticorpos anti-Cdc37 não foi internalizado e manteve-se ligada à superfície da célula (Fig. 3). MAb 4C5 e o policlonal anti-HSP90 que tenham sido anteriormente demonstrado que permanecem sobre a superfície e ser internalizada, respectivamente [27], foram utilizados como controlos (Fig. 3). Deve notar-se que, quando as células acima mencionadas foram incubadas com meio de cultura por si só como controlo negativo, não foi obtida qualquer imunocoloração (dados não mostrados).

Anti-Cdc37 internalização de anticorpo foi testado em ambos MDA-MB 453 e MDA-MB 231 células. As células vivas a partir de duas linhas celulares foram cultivadas em lamelas e incubou-se a 37 ° C durante 16 horas com anti-Cdc37. O mAb 4C5 anti-HSP90 e foram utilizados como controlos positivos e negativos, respectivamente. Para a detecção da internalização de anticorpo, as células foram fixadas e permeabilizadas como descrito em materiais e métodos e os anticorpos foram detectados por microscopia confocal utilizando um anticorpo secundário Alexa 488. Não foi observada a internalização do anticorpo anti-Cdc37 mesmo em ambas as linhas celulares. Barra de escala = 20 uM.

Superfície Cdc37 está envolvido na motilidade celular do cancro da mama

Tendo estabelecido que o anticorpo anti-Cdc37 não é internalizada mas em vez disso permanece ligada especificamente ao cell- superfície quando incubadas com vivo MDA-MB-453 e células MDA-MB-231, que em seguida examinado o possível envolvimento da superfície Cdc37 na mobilidade destas células de cancro da mama, utilizando o ensaio de cicatrização da ferida. As culturas de controlo foram cultivadas em meio de cultura, quer sozinho ou em meio de cultura contendo 200 ug /ml de um anticorpo contra a proteína não relacionada BM88 [35]. É importante observar que não houve diferença estatisticamente significativa entre os dois tipos de controles usados. O valor de controlo ilustrado é o valor médio dos dois tipos de controlo. Como mostrado na Fig. 4A, e A fig. 5A presença do anticorpo anti-Cdc37 no meio de cultura de tanto o MDA-MB-453 e células MDA-MB-231, resultou em uma taxa significativamente mais lenta do fechamento da ferida, quando comparados com controlos culturas são crescidas em meio de cultura por si só. Mais especificamente, obteve-se uma inibição de 57,7% e 35,8% da motilidade celular de cancro quando 200 ug /ml de anti-Cdc37 foi incluído no meio de cultura de células MDA-MB-453 e MDA MB-231, respectivamente (Figs. 4C e 5C). Azul tripano a coloração levada a cabo no ponto final do ensaio de cicatrização da ferida, mostraram que a taxa de morte de células tratadas com o anticorpo foi semelhante à observada nas culturas de controlo em ambas as linhas celulares (Fig. 4B e 5B). Este resultado suporta mais que a motilidade celular diminuída observada na presença do anticorpo anti-Cdc37, que não é internalizado não é causada pela morte da célula, mas em vez disso por meio da inibição da piscina superfície de Cdc37. Neste ponto, é importante notar que neste ensaio, o efeito do anticorpo anti-Cdc37 é dirigida para a invasão de células e não no sentido da proliferação de células, desde muito baixo ( 7%) incorporação de BrdU foi observada em ambos cancro da mama humano culturas de células tratadas tal como acima, sem diferenças aparentes entre as diferentes condições experimentais (dados não apresentados).

a, Wound healing ensaio. As imagens obtidas às 0 horas e 24 horas após a formação do zero. As células foram deixadas migrar em condições de controlo ou na presença de 200 ug /ml de anticorpo anti-Cdc37. B, No final das células de pontos de tempo foram coradas com Azul de Tripano. Nenhuma morte celular significativa é observada em ambos os casos. C, efeito quantitativo de Cdc37 na migração de células. A adição de 200 ug /ml de anticorpo anti-Cdc37 no meio de cultura de células resultou numa inibição de 57,7% de fecho da ferida, quando comparados com o controlo que foi considerado como 100% de encerramento da ferida (P 0,005). Coluna é a média de três experiências independentes ± SE. Dentro de uma única experiência cada condição foi testada em triplicado. Barras de escala A = 165 mm, B = 80 mm.

A, ensaio cicatrização de feridas. As imagens obtidas às 0 horas e 24 horas após a formação do zero. As células foram deixadas migrar em condições de controlo, tal como descrito em Materiais e Métodos, ou na presença de 200 ug /ml de anticorpo anti-Cdc37. B, No final das células de pontos de tempo foram coradas com Azul de Tripano. Nenhuma morte celular significativa é observada em ambos os casos. C, efeito quantitativo de Cdc37 na migração de células. A adição de 200 ug /ml de anticorpo anti-Cdc37 no meio de cultura de células resultou numa inibição de 35,8% de células invasoras a sua desvantagem quando comparado com o controlo que foi considerado como 100% de encerramento da ferida (P 0,005). Coluna é a média de três experiências independentes ± SE. Dentro de uma única experiência cada condição foi testada em triplicado. Barras de escala A = 165 mm, B = 80 mm.

Superfície Cdc37 interage com HSP90 em ambas as linhas celulares de cancro da mama e com HER-2 e EGFR em MDA-MB-453 e MDA-MB- 231cells respectivamente

Tendo em conta o envolvimento acima da superfície mostrado Cdc37 em processos de invasão de células cancerosas nós próxima analisou as possíveis interações dessa molécula com HSP90 e os receptores ErbB quinase. Para esta finalidade foi realizada experiências de co-imunoprecipitação utilizando fracções de membrana derivadas das células MDA-MB-453 e MDA-MB-231, quer em cultura em meio de controlo tal como mencionado em Materiais e Métodos, ou na presença de 200 ug /ml de anti- Cdc37 anticorpo durante 16 h, e imunoprecipitados com o anticorpo anti-Cdc37. A análise Western blot utilizando anticorpos anti-HSP90, anti-HER2 e anticorpos anti-EGFR, respectivamente, revelou que o anticorpo anti-Cdc37 perturba especificamente a interacção de superfície de Cdc37 com HSP90 e ambos os receptores nas duas linhas de células testadas (Fig. 6A) desde um observou quantidade reduzida destas moléculas nas culturas tratadas, quando comparados com os controlos. Neste ponto, é importante notar que a perturbação observado confirma a localização na superfície celular das interacções moleculares estudados, uma vez que, como mostrado acima, o anticorpo anti-Cdc37 não é internalizado e permanece ligada à superfície da célula, quando incluídos no meio de cultura.

A, fracções de proteína de membrana a partir de células MDA-MB 453 e MDA-MB 231 (controlo) foram immunoprecipitaded com anticorpo anti-Cdc37. Análise de proteínas ligadas por Western blot com o anticorpo anti HSP90 e anticorpos anti-HER-2 e anti -EGFR respectivamente, revelou que Cdc37 interage não só com a HSP90, mas também com os dois receptores ErbB estudados. Presença de 200 ug /ml de a célula impermeável anti-Cdc37 durante 16 h em meio de cultura de duas linhas celulares, seguido por imunoprecipitação e análise de Western blot, conforme acima revelado que o anticorpo anti-Cdc37 interrompe a associação de Cdc37 com a Hsp90 e a ErbB receptores nas duas linhas celulares. B, MDA-MB 453 e MDA-MB 231 células foram tratadas ou não com o mAb 200 ug /ml de 4C5 durante 16 horas. As fracções de proteína de membrana derivadas a partir destas culturas foram immunoprecipitaded com anti-Cdc37 seguido por análise de transferência de Western utilizando anticorpos anti-HSP90 e anti-HER2 e anti anticorpos de EGFR, respectivamente. C, fracções de proteína de membrana de MDA-MB 231 células cultivadas na ausência ou na presença de 200 ug /ml de mAb 4C5 durante 16 h foram imunoprecipitados com o anticorpo anti-EGFR. Análise de proteínas ligadas por western blot com o anticorpo anti-HSP90 revelou que HSP90 superfície interage com o EGFR e que essa interação é interrompido por mAb 4C5. IgG irrelevante serviu como controlo negativo para todas as experiências acima. D, Densitometria quantificação das interacções observadas reduzida na presença de anti-Cdc37 no meio de cultura de células MDA-MB 453 e MDA-MB 231 resultou numa diminuição de 33% e 59% com a HSP90 e HER-2, respectivamente, em relação ao MDA -MB 453 células e num decréscimo de 56% e 47% com o EGFR e HSP90, respectivamente, em relação às células MDA-MB 231. A presença de mAb 4C5 no meio de cultura de células MDA-MB 453 e MDA-MB 231 resultou numa diminuição de 60% e 58% com a HSP90 e HER-2, respectivamente, em relação às células MDA-MB 453 e em 88% e 70 um% diminuir com a HSP90 e EGFR, respectivamente, em relação às células MDA-MB 231.

MAb 4C5 perturba especificamente a interacção superfície da Cdc37 com HSP90 e os receptores ErbB

Tendo estabelecido que de forma semelhante ao seu intracelular homólogo, Cdc37 superfície está fisicamente associada com a HSP90 superfície, o próximo procurado para investigar o efeito da função de anticorpo monoclonal bloqueador anti-HSP90, o mAb 4C5, nesta interacção. Para este fim, as fracções de membranas derivadas de células MDA-MB-453 e MDA-MB-231 culturas que foram tratadas com 200 ug /ml de mAb 4C5 durante 16 h foram imunoprecipitados com o anticorpo anti-Cdc37. análise de mancha de Western utilizando anti-HSP90 revelaram que o mAb 4C5 perturba especificamente a interacção de superfície com Cdc37 HSP90 em ambas as linhas celulares de cancro utilizadas (Fig. 6B). Mais especificamente, o anticorpo anti-Cdc37 co-imunoprecipitada níveis mais baixos de HSP90 nos mAb 4C5 culturas tratadas quando comparado com os controlos.

Temos anteriormente demonstrado utilizando mAb 4C5 que a superfície de HSP90 interage especificamente com o domínio extracelular de HER -2 em células MDA-MB-453 [28] .Em o presente trabalho e, a fim de analisar melhor o modo de ação da superfície Cdc37 nas duas linhagens de células estudadas, foi necessário primeiro investigar a possível interação da piscina superfície de HSP90 com o EGFR. Para este fim, as fracções de membrana a partir de derivados de MDA-MB-231 tratadas culturas na ausência ou na presença de 200 ug de mAb /ml de 4C5 durante 16 h, foram imunoprecipitadas com o anticorpo anti-HSP90 e imunomarcados com anti-EGFR. Como mostrado na Fig. 6C EGFR interage especificamente com a HSP90. A redução observada na presença do mAb impermeável células 4C5 indica Tendo mostrado a localização na superfície celular desta interacção da associação de superfície HSP90 e EGFR e, adicionalmente, que Cdc37 interage não só com HSP90, mas também com HER2 e EGFR que próxima procurado para investigar o possível efeito de mAb 4C5 em interacção do co-chaperona com os receptores ErbB. Assim fracção de membrana derivada de células MDA-MB-453 e MDA-MB-231 culturas tratadas e não tratadas com 200 ug de mAb /ml de 4C5 durante 16 horas foram imunoprecipitados com o anticorpo anti-Cdc37. A análise Western blot utilizando anticorpo anti-HER2 e anticorpos anti-EGFR, respectivamente, revelou que o mAb 4C5 perturba especificamente a interacção de superfície de Cdc37 com ambas as moléculas de receptor uma vez que níveis inferiores dos receptores ErbB foram observados nos mAb 4C5 culturas tratadas (Fig. 6B).

Discussão

no presente trabalho demonstramos que a co-chaperona Cdc37 é localizada na superfície dos-231 MDA-MB células de cancro da mama MDA-MB-453 e, quando é necessário para a mobilidade destas células e de forma semelhante ao seu homólogo intracelular que interage especificamente com a chaperona molecular HSP90. Além disso os nossos resultados mostram que esta piscina superfície de Cdc37 interage directamente com os membros da família ErbB de receptores do factor de crescimento, possivelmente actuando como um co-factor de HSP90 actividades chaperoning extracelular implicados em processos de invasão de células de cancro e que o mAb de anticorpos anti-HSP90 4C5 perturba estas interacções.

localização na superfície celular de Cdc37 foi demonstrada tanto em imunocitoquímica vivo MDA-MB-453 e MDA-MB-231 de cancro da mama e western blot usando lisados ​​de fracção de membrana derivadas destas linhas celulares.

a inibição de MDA-MB-453 e MDA-MB-231 motilidade das células do cancro da mama, pelo anticorpo anti-Cdc37 foi demonstrado utilizando o ensaio de cicatrização da ferida. A presença deste anticorpo no meio de cultura reduziu significativamente a taxa de motilidade de ambas as linhas celulares estudadas. Neste ponto, é interessante notar que quando o anticorpo anti-HSP90 mAb 4C5 e o anticorpo anti-Cdc37 foram incluídos separadamente ou combinados no meio de cultura das células acima não foram observadas diferenças estatisticamente significativas nas fechamento de feridas.