Abstract
cancro do pulmão de pequenas células Downstream (SCLC) é agressivo, com crescimento rápido e osso frequentes metástase; no entanto, seu mecanismo molecular detalhada ainda pouco compreendida. Aqui, nós relatamos o papel crítico do fator de crescimento inicial 4 (EGR4), um fator de transcrição zinc-finger de ligação de DNA, na proliferação de células de SCLC. EGR4 sobreexpressão em células HEK293T conferida regulação positiva significativa das variantes de splicing específicos da proteína relacionada com a hormona paratiróide (
PTHrP) gene, resultando em aumento da secreção de proteína PTHrP, um mediador conhecido de metástases ósseas osteolíticas. Mais importante ainda, a depleção de
EGR4
expressão por siARN crescimento significativamente suprimido de as linhas de células de SCLC, SBC-5, SBC-3 e NCI-H1048. Por outro lado, a introdução de
EGR4
em células NIH3T3 aumentados de forma significativa o crescimento das células. Foram identificados quatro
EGR4
genes-alvo,
SAMD5
,
RAB15
,
SYNPO
e
Dlx5
, que foram os mais significativamente genes regulados negativamente sobre esgotamento de
expressão EGR4
em todas as células SCLC examinados, e demonstraram o recrutamento directo de EGR4 aos seus promotores pelo chip e análise repórter luciferase. Notavelmente, o knockdown da expressão destes genes por siARN notavelmente suprimidos o crescimento de todas as células SCLC. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que EGR4 provável regula a metástase óssea e a proliferação de células SCLC através de regulação da transcrição de vários genes alvo, e pode, portanto, ser um alvo promissor para o desenvolvimento de drogas anti-cancro para os doentes SCLC.
Citation : Matsuo T, LT Dat, Komatsu H, Yoshimaru t, Daizumoto K, Sone S, et al. Response (2014) Crescimento Precoce 4 está envolvido na proliferação celular de pequenas células do cancro do pulmão através da transcrição de ativação de seus genes a jusante. PLoS ONE 9 (11): e113606. doi: 10.1371 /journal.pone.0113606
Autor: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center em Dallas, Estados Unidos da América
Recebido: 04 de agosto de 2014; Aceito: 27 de outubro de 2014; Publicação: 20 de novembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Matsuo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma futura investigação avançada da Universidade de Tokushima. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de pulmão é um dos cânceres mais comuns, e sua incidência está a aumentar em todo o mundo [1]. A alta mortalidade e mau prognóstico de câncer de pulmão resultar de dificuldades no diagnóstico precoce e seu elevado potencial metastático. O cancro do pulmão é classificada em dois tipos principais, o cancro das células pequenas do pulmão (SCLC) e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), que representam cerca de 25% e 75% dos casos, respectivamente. presentes SCLC com comportamento clínico agressivo, caracterizado pelo rápido crescimento e as metástases frequentes para o cérebro, pulmão, fígado e ossos [2]. Em particular, metástase óssea provoca complicações graves no CPPC e pode levar a dor óssea, fraturas patológicas, hipercalcemia, compressão da medula espinhal e outras síndromes de compressão do nervo [3], [4], e é frequentemente associados com alta morbidade e de prognóstico reservado. Os tratamentos atuais são geralmente paliativo. Portanto, é muito importante para prevenir e tratar metástases ósseas osteolíticas
metástase óssea tem sido geralmente classificados como osteolítico, levando à destruição óssea.; osteoblástica, levando à formação de novo osso; ou misturadas com base no mecanismo principal de interferência com a remodelação óssea normal. A actividade equilibrada de factores osteolíticas e osteoblásticas é pensado para regular a metástase óssea [4], [5]. Recentemente, várias moléculas foram relatados para desempenhar papéis importantes como factores envolvidos na osteoblásticas osteoformation [4] – [6]. No entanto, os mecanismos precisos responsáveis pelo crescimento do tumor nos ossos permanecem inexplorados.
transcriptomics abrangentes conferir uma caracterização precisa dos cânceres individuais que devem ajudar a melhorar as estratégias clínicas para doenças neoplásicas, através do desenvolvimento de novos medicamentos. Assim, “genómica” abordagens de tecnologia são eficazes para a identificação de moléculas alvo envolvidas nas vias cancerígenas e metastáticos, incluindo metástase óssea. Para este fim, os transcriptómica do genoma de SCLC humano envolvida na metástase de órgãos preferencial em ratinhos foi analisada, e vários genes potencialmente envolvidos em metástase óssea foram encontrados [7]. Neste estudo, nós nos concentramos em resposta de crescimento precoce 4 (
EGR4
), que é significativamente regulada em tumores metastáticos osso em comparação com outras metástases de órgãos (pulmão, rim e fígado) derivadas de células SCLC humanos [7].
o
gene EGR4
pertence à família resposta de crescimento precoce de genes precoces imediatos que codificam quatro fatores de transcrição zinc-finger, se ligam ao DNA (
EGR1
para
EGR4
) [8]. Este gene (
pAT133
,
C-NGFI
) foi identificado pela primeira vez como uma proteína de dedo de zinco imediatamente induzida por estimulação mitogénica em linfócitos T e de fibroblastos [9], [10]. Tem sido relatado que
ratinhos -null EGR4
têm infertilidade masculina por causa da espermatogénese preso, mas não é observada infertilidade feminina [11], [12], sugerindo que EGR4 desempenha um papel crítico em alguns tipos de macho humano idiopática infertilidade. Além disso, EGR4 é conhecida por ter um padrão de expressão específico de neurónios em ratos [13] e regular o factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) mediada específica para neurónios cloreto de potássio co-transportador 2 (KCC2) transcrição através da via de sinalização de ERK1 /2 em imaturo neurónios [14]. No entanto, o papel fisiopatológico da EGR4 na carcinogênese em SCLC, ainda não foi elucidado. Neste estudo, nós relatamos que EGR4 age como um ativador de transcrição através da regulação de genes a jusante específicas na proliferação de células SCLC.
Materiais e Métodos
As linhas celulares
O SCLC humana linhas celulares SBC-3 e SBC-5 foram gentilmente cedidas pelos Drs. M. Tanimoto e K. Kiura da Universidade de Okayama [15]. A linha de células NSCLC PC14PE6 foi gentilmente cedido pelo Dr. I. J. Fidler da M.D. Anderson Cancer Center [16]. A linha de células SCLC humano NCI-H1048 e linhas de células humanas NSCLC A549 e NCI-H1048 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EUA). A linha de células /bone2 ACC-LC319 humano foi estabelecida como previamente descrito [17]. A linha de células MC3T3-E1 osteoblásticas murino 4 subclone foi gentilmente fornecida pela Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. (Tóquio, Japão). A linha de células epiteliais das vias aéreas pequenas humano (SAEC) foi adquirido a partir de Lonza (Walkersville, MD, EUA). Todas as células foram cultivadas sob condições apropriadas.
O plasmídeo constrói
A sequência de codificação inteira de Toyobo humano
EGR4
(NM_001965) foi amplificado por PCR usando polimerase KOD além de ADN (, Osaka, Japão). O produto da PCR foi inserido no
Eco
RI e
Xho
locais I do vector pCAGGSn3FH que contém uma tag FLAG N-terminal. Para os plasmídeos repórter da luciferase, os fragmentos de ADN do 5′-regiões flanqueadoras de
PTHrP-V3
e
V4
(NM_198964.1 e NM_198966.1, respectivamente),
SAMD5
(NM_001030060.2),
RAB15
(NM_198686.2),
SYNPO
(NM_007286.5) e
Dlx5
(NM_005221.5), que incluem o potencial EGR locais de ligação, como previsto pelo programa MatInspector (Genomatix, https://www.genomatix.de/matinspector.html), foram amplificados por PCR e inserido nos locais de enzimas de restrição adequados no vector pGL3-enhancer (Promega, Madison, WI , EUA). Os conjuntos de iniciadores de PCR utilizados neste estudo estão apresentados na Tabela S1. As sequências de DNA de todas as construções foram confirmadas por sequenciação de ADN (ABI 3500xL sequenciador; Life Technologies, Foster City, CA, EUA).
extracção de ARN, transcrição reversa, PCR semi-quantitativa e PCR em tempo real
extracção de ARN total, a transcrição reversa, em tempo real experiências de PCR semi-quantitativo de RT-PCR e foram realizados como previamente descrito [18]. Os níveis de expressão em cada amostra foram normalizados para o
β
actina conteúdo mRNA. As sequências de cada conjunto de iniciadores estão listados na Tabela S2.
análise Western blot
análise de Western blot foi realizada tal como anteriormente descrito [18]. Após SDS-PAGE, as membranas manchadas com proteínas foram incubadas com anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA, F3165) ou anti-β-actina (AC-15, Sigma-Aldrich, A-5441) Os anticorpos monoclonais de ratinho diluído a 1:5000. As membranas foram então incubadas com uma peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo secundário durante 1 h, e as bandas de proteína foram visualizadas com quimioluminescência aumentada (ECL) reagentes de detecção (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA).
Medição da secreção de PTHrP
células HEK293T (1,5 × 10
5 células /placa de 12 poços) foram transfectadas com o (sem inserto) plasmídeos simulados utilizando FuGENE 6 (Promega) pCAGGSn3FH-EGR4 ou. Às 48 horas após a transfecção, o meio de cultura foi recolhido e centrifugado a 4 ° C a 15000 rpm. A concentração de proteína PTHrP no meio condicionado foi determinada por um imuno-radiométrico (IRMA) de ensaio (SRL Inc., Tóquio, Japão).
Efeito de meio condicionado derivado de células HEK293T EGR4 que sobre-expressam em
RANLK
,
IL-6
e
IL-8
expressão
células HEK293T (2,6 × 10
6 células /placa de 10 cm) foram transitoriamente transfectadas com o pCAGGSn3FH-EGR4 ou vector simulado durante 48 h, e o meio de cultura foi então substituído com DMEM mais FBS a 0,1% durante um adicional de 48 h. O meio de cultura foi subsequentemente recolhido, e o meio condicionado foi transferido para murino células osteoblásticas MC3T3-E1 que foram pré-cultivadas com meio de diferenciação contendo ácido ascórbico (100 ug /ml) durante 5 dias. Após 48 h, os níveis de expressão de murino
RANKL
,
IL-6
, e
IL-8
foi analisada por PCR em tempo real como descrito acima.
cromatina imunoprecipitação (CHIP) ensaio
células HEK293T (2,5 × 10
6 células /placa de 10 cm) foram transfectadas com 8 ug do pCAGGSn3FH-EGR4 ou vector simulado durante 48 horas e em seguida chIP ensaios foram realizados utilizando o kit EZ-chip (Millipore, Billerica, MA, EUA) como previamente descrito [19]. O iniciador de PCR para detectar define os sítios de ligação de EGR-utilizados são listados na Tabela S3.
ensaio da luciferase
células HEK293T (2,5 × 10
4 células /prato de 48 poços) foram co-transfectadas com 100 ng do promotor vector pGL3-enhancer, tal como descrito acima ou o vector simulado em combinação com 100 ng do pCAGGSn3FH-EGR4 ou vector simulado (100 ng). pRL-TK foi usada como um controlo interno. Após 48 h, as células foram colhidas e analisadas para
Firefly luciferase e
Renilla
actividade da luciferase utilizando o ensaio de repórter de luciferase duplo (Promega) tal como previamente descrito [19]. Os dados foram expressos como o aumento vezes sobre células transfectadas por simulação (fixado em 1,0) e representados como a média ± SE de dois experimentos independentes.
NIH3T3 proliferação celular ensaio
células NIH3T3 (0,5 × 10
5 células /placa de 6 poços) foram transfectadas transitoriamente com 3 ug de pCAGGSn3FH-EGR4 ou vector simulado utilizando FuGENE 6 (Promega). Os ensaios de proliferação celular foram realizadas a 48, 72 e 96 h após a transfecção, respectivamente, utilizando contagem celular Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japão) tal como previamente descrito [18]. Estas experiências foram realizadas em triplicado. análise de Western blot foi realizada tal como descrito acima.
silenciamento gênico efeitos de tratamento siRNA
Foram utilizados oligonucleótidos siRNA (Sigma-Aldrich Japan KK, Japão) para derrubar
EGR4
,
Dlx5, SYNPO SAMD5
e
RAB15
expressão em SBC-5, SBC-3, NCI-H1048 ou PC14PE6. As sequências de direccionamento cada gene estão listados na Tabela S4. As células foram plaqueadas em placas de 12 poços (SBC-5 e PC14PE6; 1,5 × 10
4 células /poço, SBC-3; 2,5 × 10
4 células /poço, NCI-H1048; 5,0 × 10
4 células /cavidade). A transfecção de 100 nM de ARNsi para SBC-5 e células PC14PE6 foi efectuada utilizando Lipofectamina 2000 reagente (Life Technologies) tal como previamente descrito [20]. células SBC-3 e NCI-H1048 foram transfectadas com 50 nM de ARNsi utilizando Lipofectamina ARNi Max reagente de transfecção (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. Aos 48, 96 ou 120 h após a transfecção, a extracção de ARN total, em tempo real Os ensaios de PCR e a proliferação celular foram realizadas como descrito acima.
Identificação de genes a jusante EGR4 por DNA microarrays
SBC- 5 células (1 × 10
6 células /35 mm prato para 24 h) foram transfectadas com 10 nM siRNA dirigido contra EGR4 (EGR4-2) ou EGFP (siEGFP, um controle) usando o reagente de transfecção Lipofectamine RNAi Max (Life Technologies ). O ARN total foi extraído a partir de cada uma das amostras às 48 e 72 h após transfecção de siRNA. As análises de ADN e microarranjos de dados foram realizadas utilizando o Agilent Total Humano Genoma Microarray (4 × 44K, G4110F; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) e software GeneSpring (versão 11.5; Agilent Technologies) tal como previamente descrito [21]. Um corrigido
P valor
foi calculado com a análise Benjamini Hochberg taxa de descoberta de falsas (FDR), e
P Art 0,05 foi considerado significativo. A extensão ea direção da expressão diferencial entre os pontos de tempo (48 e 72 h) foram determinados pelo cálculo dos valores de mudança de dobra. Os dados da análise de DNA microarray foram submetidos ao Omnibus (GEO) do banco de dados Expressão Gênica NCBI como a série GSE40558.
análise dos cancros do pulmão RNA-Seq dados
publicamente disponíveis dados de expressão gênica (valores normalizados de Illumina RNA-Seq v2, nível 3, LUAD e LUSC) a partir do Cancer Genome Atlas (TCGA; https://cancergenome.nih.gov/) foram baixados da matriz TCGA. A expressão diferencial (por valor mudança vezes) entre os tecidos de câncer e pulmão normal adjacente foi calculado de acordo com o valor da expressão do gene normalizado de cada amostra.
A análise estatística
A análise estatística foi realizada utilizando Student
t
-teste.
P Art 0,05 foi considerado significativo
Resultados
EGR4 regula diretamente a atividade transcricional da Análise
PTHrP
gene
. do perfil de expressão do gene do genoma da metástase órgão preferencial da linha de células SCLC humano SBC-5 em ratinhos identificaram resposta de crescimento precoce 4 (
EGR4
), que foi significativamente regulada positivamente em tumores com metástases ósseas (
p Art 0,001, razão; 2,22) em comparação com outras metástases de órgãos (pulmão, rim e fígado) [7]. Em primeiro lugar, para esclarecer o papel da EGR4 como um fator de transcrição envolvido na metástase óssea, enfocamos a proteína relacionada ao hormônio da paratireóide (
PTHrP
) gene como um alvo a jusante candidato do EGR4 porque o
PTHrP
gene é conhecida para ser um activador potente da reabsorção óssea osteoclástica [4] e codifica uma proteína secretada a partir de células SBC-5 [22], [23]. Além disso, tem sido relatado que o tratamento com um anticorpo neutralizante anti-PTHrP inibe a produção de células SBC5 metástase óssea no modelo de ratinho SCID [22], [23].
o National Center for Biotechnology Information ( NCBI) do banco de dados, o
gene PTHrP
é relatada a possuir quatro variantes de transcrição, designado
PTHrP
variante 1 (adesão PTHrP-V1, GenBank não. NM_198965.1), variante 2 (PTHrP- V2, NM_002820.2), variante 3 (PTHrP-V3, NM_198964.1) ea variante 4 (PTHrP-V4, NM_198966.1). Os cDNAs de comprimento total de
PTHrP-V1
,
V2
,
V3
e
V4
consistem em 1331, 1881, 1862 e 1312 nucleotídeos que codificar 177, 175, 175 e 177 aminoácidos, respectivamente, e consistem em 5, 4, 3, e 4 exons, respectivamente. A variante V1 não tem o exão 3 e na variante V2 não tem o exão 3 e o exão possui 5b, que é 1027 pb mais longa na extremidade 3 ‘do exão 5a. O V3 e V4 variantes geralmente carecem de exões 1 e 2 e possuem o exão 3, que está localizada dentro do intrão 2 com um comprimento de 281 pb. A variante V3 carece ainda mais o exão 6, e possui 5b exão e variante V2. A variante V4 possui 5a exão e exão 6, indicando que o
PTHrP-V1 /V2
e
V3 /V4
variantes têm diferentes regiões promotoras (Figura 1A). Análise em tempo real de RT-PCR subsequente confirmou que o
PTHrP-V3
e
V4
variantes de splicing foram predominantemente regulada ao nível da transcrição em células HEK293T EGR4 que sobre-expressam em comparação com células transfectadas por simulação ( A Figura 1B). Assim, para obter provas directas para a regulação positiva de
PTHrP-V3
e
V4
por EGR4, primeiro procurou motivos putativos de ligação ao DNA EGR com o programa MatInspector (descrito acima), porque tem foi relatado que a família EGR, incluindo a proteína EGR4, liga-se preferencialmente a um motivo de consenso EGR (5′-GCGG /TGGGCG-3 ‘) [24] – [27]. Encontramos um motivo potencial DNA EGR vinculativo dentro do
PTHrP-V3
e
V4 e região promotora (-515 a -499). Subsequentemente, foi examinada a actividade de transcrição de EGR4 por um ensaio de repórter de luciferase usando um plasmídeo de luciferase pGL3 contendo o motivo de ligação EGR4
PTHrP-V3 /V4
promotor. Um aumento significativo na atividade de luciferase foi observada com FLAG-EGR4 transfecção em comparação com o vetor de controle simulado em células HEK293T (Figura 1C). Para investigar se EGR4 poderia ligar-se a um potencial
PTHrP-V3
e
V4
EGR motivo de ligação, foi realizado um ensaio ChIP. O fragmento genómico incluindo a potencial motivo de ligação EGR (-515 a -499) de
PTHrP-V3
e
V4
foi especificamente ligada pela proteína EGR4 em produtos imunoprecipitados com um anticorpo anti-FLAG, sugerindo que EGR4 diretamente ligado à região promotora do
PTHrP-V3
e
V4
variantes (Figura 1D). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a EGR4 pode upregulate diretamente o
PTHrP-V3
e
V4
variantes nas células SCLC
A:. Estruturas genômicas das quatro variantes de splicing de
PTHrP
. As caixas cinzentas e brancas indicam regiões de codificação e não codificantes, respectivamente. As setas indicam os conjuntos de iniciadores utilizados para realizar RT-PCR para cada transcrito. Os números entre parênteses indicam o comprimento de cada exão. B: Painel superior: análise Western blot de células HEK293T que expressam FLAG-exógeno etiquetado EGR4 (FLAG-EGR4) ou células transfectadas com o vector simulado. painel inferior: análise em tempo real RT-PCR de
PTHrP
variantes de splicing (
V1 /V2
e
V3 /V4
) em células HEK293T EGR4-superexpressão. C: ensaio de luciferase do
PTHrP-V3
e
-v4
(
V3 /V4
) regiões promotoras (n = 2, *
P
0,05). Esta experiência foi realizada utilizando uma parte dos lisados a partir de células que expressam a FLAG-EGR4 exógeno ou as transfectadas com o vector simulado utilizado em B. D: Ensaio ChIP de o
região promotora PTHrP-V3 /V4
. ChIP ensaios foram utilizados para determinar EGR4 a ligação directa ao promotor de
PTHrP-V3 /V4
. O produto de PCR foi de -620 a -318 da região a montante da extremidade 5 ‘do exão 3 de
PTHrP-V3 /V4
, que foi designado como a posição 1.
efeitos parácrinos de PTHrP secretadas a partir de células-superexpressão EGR4
tem sido relatado que a proteína PTHrP segregado a partir de células cancerosas regula a expressão do
RANKL
,
IL-6
e
IL-8
genes, que têm sido implicados como factores que aumentam a formação de osteoclastos e a destruição do osso em doenças malignas [28] – [30] em células de osteoblastos. De acordo com estes dados e os nossos resultados, como mostrado na Figura 1, temos a hipótese de que a proteína é secretada PTHrP a partir de células que sobre-expressam EGR4. Os nossos resultados mostraram que a concentração de proteína PTHrP foi significativamente aumentado em meio condicionado a partir de células HEK293T EGR4 que sobre-expressam (14,43 ± 1,04 pmol /L) em comparação com meio condicionado de células transfectadas por simulação (11,83 ± 0,15 pmol /L,
P
0,05; Figura 2A)
a:. a secreção da proteína a partir de células HEK293T PTHrP EGR4 que sobre-expressam (n = 3, *
P
0,05). B: Esquema de Medição para os efeitos parácrinos de meios condicionados de células-superexpressão EGR4. C: Real-time PCR análise dos efeitos parácrinos sobre a expressão do
RANKL, IL-6 e
IL-8
genes quando o meio a partir de células que sobre-expressam HEK293T EGR4 foi cultivada com rato osteoblastos MC3T3-E1 (n = 2, *,
P Art 0,05, **,
P Art 0,01).
em seguida, avaliaram os efeitos parácrinos de meio condicionado de células HEK293T EGR4 que sobre-expressam sobre os osteoblastos. Tal como mostrado na Figura 2B, transferimos meio condicionado a partir de células HEK293T transfectadas com o FLAG-EGR4 construir células osteoblásticas murina MC3T3-E1 e, em seguida, realizada PCR em tempo real para analisar os efeitos do meio condicionado do nível do
RANKL
,
IL-6 Comprar e
IL-8
genes. Todos os três genes foram significativamente regulada positivamente em células osteoblásticas tratadas com meio condicionado derivado de células HEK293T ectopicamente que expressam FLAG-EGR4 em comparação com células falsamente transfectadas (Figura 2C). Colectivamente, estes resultados sugerem que o aumento na secreção de PTHrP a partir de células-superexpressão EGR4 pode aumentar a expressão do
RANKL
,
IL-6 Comprar e
IL-8
genes em osteoblastos.
Efeito da
EGR4
no crescimento celular
em primeiro lugar, examinou
expressão EGR4
em células SCLC por semi-quantitativa RT-PCR e descobriram que
EGR4
foi altamente expressa em SBC-3, 5-SBC e células NCI-H1048, mas não na linha celular epitelial das vias aéreas pequenas SAEC (Figura 3A). Em seguida, para avaliar se EGR4 é essencial para o crescimento de células SBC-5, foi utilizada uma abordagem de interferência de ARN com dois oligonucleótidos diferentes de ARNip. a análise por PCR em tempo real mostraram que
EGR4
siRNAs espec�icos (siEGR4-1 e siEGR4-2) suprimiu significativamente a expressão de EGR4 comparação com siEGFP como um controlo (Figura 3B). ensaio MTT mostrou que a introdução de siEGR4s (siEGR4-1 e siEGR4-2) suprimiu significativamente o crescimento de células SBC-5 (Figura 3C), que está de acordo com os resultados EGR4 knockdown. Nós também confirmou crescimento significativo efeito inibitório de
EGR4
knockdown em outras linhas de células SCLC SBC-3 e NCI-H1048 superexpressão
EGR4
(Figura S1). Para confirmar ainda mais o efeito de promoção de crescimento de
EGR4
, FLAG-EGR4 construir ou simulada vector foi transitoriamente transfectado em células NIH3T3, e o ensaio de MTT foi realizado como descrito acima. Tal como mostrado na Figura 3D, as células de FLAG-EGR4-transfectadas cresceram significativamente mais rápido do que as transfectadas com vector simulado. Estes resultados sugerem que a superexpressão de
EGR4
pode estar envolvido no crescimento de células SCLC
A:. A expressão de
EGR4
em linhas de células SCLC e NSCLC foi determinada pela semi Quantitativas RT-PCR. B: Efeitos da
EGR4
knockdown na proliferação celular em células SBC-5. PCR em tempo real de
EGR4
em siEGFP- ou siEGR4 (siEGR4-1, siEGR4-2) células tenha sido tratada com a 5 dias após o tratamento siRNA (n = 2, *
P Art 0,05).
ACTB
foi utilizado como um controlo quantitativo em tempo real de RT-PCR. C: A proliferação celular foi determinada pelo ensaio de MTT a 5 dias após o tratamento com ARNsi (n = 3, ***
P
0,005). (Si-1; siEGR4-1, si-2; siEGR4-2). D: Crescimento de promoção do efeito da EGR4 exógeno sobre células NIH3T3 (*
P Art 0,05, **
P Art 0,01,
NS
, nenhum significado). A análise Western blot foi realizada a 96 h após transfecção (painel da esquerda). MTT foi realizada em 48, 72 e 96 h após a transfecção com FLAG-EGR4 (preto) ou vector simulado (branco) (painel da direita). Estas experiências foram realizadas em triplicado.
Identificação
EGR4
genes alvo
Para obter mais conhecimentos sobre o papel biológico de
EGR4
em o crescimento celular, buscou-se identificar genes a jusante especificamente reguladas por EGR4 em células SCLC. siEGR4 ou siEGFP (ARNsi de controlo) foi transfectado em células SBC-5 em que
EGR4
foi altamente expresso (Figura 3A), e alterações na expressão genética em dois pontos de tempo foram monitorados por análise de DNA microarray. Para identificar os genes putativamente regulados por EGR4, foram selecionados os genes com os dois critérios seguintes: nível de (i) expressão foi diminuída em mais de duas vezes a 48 e 72 h em células transfectadas com siEGR4 em comparação com células transfectadas com o controlo siEGFP, e (ii) um motivo de ligação EGR putativo foi prevista para existir dentro de 500 bp do sítio de iniciação da transcrição pelo programa MatInspector (descrito acima). Foram identificados 13 genes que foram reprimidos após knockdown de expressão EGR4 (Tabela S5). a análise por PCR em tempo real confirmou que sete transcrições foram significativamente regulada negativamente em ambos os pontos de tempo em células knockdown-EGR4 (Figura 4A). Posteriormente, também avaliamos a regulação positiva destes genes após expressão EGR4 exógena em células HEK293T e, finalmente, selecionou quatro EGR4 genes alvo candidato, incluindo homeobox distal-menos 5 (
Dlx5
), synaptopodin (
SYNPO
), domínio alfa motivo estéril contendo 5 (
SAMD5
) e RAB15, um membro da família RAS oncogene (
RAB15
), que foram significativamente regulada pelo
EGR4
superexpressão (Figura 4B). Nós confirmamos regulação baixa significativa de
Dlx5
,
SYNPO
e
SAMD5
genes por
EGR4
knockdown no SBC-3 células (Figura S2).
A: PCR em tempo real de
EGR4 Comprar e sete genes a jusante (
Dlx5, SYNPO, SAMD5
,
MREG, AHNAK, RAB15
, e
PTPN23
) em siEGFP- ou siEGR4 tratados SBC-5 células (n = 2, *,
P Art 0,05, **,
P Art 0,01, * **,
P Art 0,005). B: Real-time PCR do
Dlx5
,
SYNPO
,
SAMD5
, e
RAB15
genes em células HEK293T mock- ou EGR4-superexpressão (n = 2, *,
P Art 0,05, ***,
P Art 0,005). Esta experiência foi realizada usando o RNA total a partir de células que expressam EGR4 exógeno marcado com FLAG (FLAG-EGR4) ou as transfectadas com o vector simulado utilizado na Figura 1B. C: ensaio de luciferase do
SAMD5
,
RAB15
,
SYNPO
e
Dlx5
genes. (N = 2, *,
P Art 0,05, **,
P Art 0,01). D: ensaios ChIP foram usadas para determinar a ligação direta de EGR4 aos promotores do
SAMD5
,
RAB15
,
SYNPO
e
Dlx5
genes .
para obter provas directas para a transativação de quatro EGR4 genes alvo candidato, medimos a atividade transcricional de EGR4 por um ensaio de repórter luciferase. FLAG-EGR4-transfectadas células tinham significativamente mais elevada do que a actividade da luciferase células simuladamente transfectadas (Figura 4C). Em seguida, investigámos o recrutamento de EGR4 para cada local de ligação EGR4 por ensaio de chip. EGR4 mostrou ligar-se ao motivo de ligação de EGR previsto dentro das regiões promotoras de todos os genes alvo (Figura 4D). Estes resultados sugerem que EGR4 transactiva diretamente
SAMD5
,
RAB15,
SYNPO
e
Dlx5
. Posteriormente, foi investigado o papel biológico dos quatro genes alvo EGR4 na proliferação de células SCLC. Introdução dos ARNic em SBC-5, SBC-3 e as células NCI-H1048 resultou numa redução significativa na expressão dos genes alvo acompanhado pela supressão significativa da proliferação celular (Figura 5A-D, a Figura S3), sugerindo que estes genes também são susceptíveis de desempenhar um papel crucial na proliferação de células SCLC através da activação transcricional EGR4.
Efeitos da
EGR4
genes a jusante
SAMD5
(a),
RAB15
(B),
SYNPO
(C) e
Dlx5
(D) sobre a proliferação de células foram determinados por siRNA knockdown em células SBC-5. O painel esquerdo mostra o tempo real resulta de PCR para genes alvo em células tratadas com siRNA (n = 2). O painel da direita mostra os resultados de proliferação celular análises medida pelo ensaio de MTT (
SAMD5
e
RAB15
: n = 2,
Dlx5
e
SYNPO
:. n = 3, *,
P Art 0,05, **,
P Art 0,01, ***,
P Art 0,005)
Discussão
neste estudo, o nosso objectivo foi identificar e caracterizar moléculas ou vias potencialmente envolvidos na metástase do cancro, particularmente metástase óssea. Através de uma análise do transcriptoma do genoma da metástase órgão preferencial das células SCLC humanas em ratos, verificou-se que
EGR4
, um membro de uma família de quatro zinc-finger relacionada Cys
2-Sua
2 tipo (
EGR1
para
EGR4
), é significativamente regulada em tumores metastáticos osso em comparação com outros órgãos, ou seja, o pulmão, rim e fígado [7]. EGR4 foi inicialmente identificado como um factor de transcrição dedo de zinco imediatamente induzida por estimulação mitogénica em linfócitos e fibroblastos [31] t. Direccionamento de genes estudos em ratinhos demonstraram que EGR4 regula diversos genes críticos envolvidos nas fases iniciais da meiose e desempenha um papel indispensável na fertilidade masculina murino [11], [12]. Além disso, tem sido relatado que EGR4 se liga a células factor nuclear T activadas (NFAT) ou factor nuclear kappa B (NFkB) para melhorar a transcrição dos genes a jusante que codificam citocinas inflamatórias, tais como IL-2, TNF-α e ICAM-1 , [33] [32]. Um relatório anterior descrito que o nível de
expressão PTHrP
, um activador potente da reabsorção óssea osteoclástica, em metástases ósseas tende a ser mais elevada do que em metástases para os rins, fígado e pulmões utilizando um transcriptómica genome-wide de células SCLC humanas em ratinhos [7]. Assim, neste estudo, nós nos concentramos em
PTHrP
, um activador potente da reabsorção óssea osteoclástica, como um gene EGR4-jusante para esclarecer o papel fisiopatológico da EGR4 como um fator de transcrição em metástases ósseas SCLC.
PTHrP é conhecido por ser um mediador chave de malignidades hipercalcemia humoral e osteolíticas metástases de cancro do pulmão [22], [23], [34]. Aproximadamente 80% dos pacientes com tumores sólidos e hipercalcemia aumentaram as concentrações PTHrP no seu plasma [35]. Tem sido relatado que a proteína secretada a partir de células PTHrP cancerosas regula a expressão do
RANKL
,
IL-6
e
IL-8
genes, que têm sido implicados como fatores que aumentam a formação de osteoclastos e destruição óssea em doenças malignas [28] – [30] em osteoblastos células. Descobrimos que EGR4 transactiva diretamente variantes específicas (
V3
e
V4
) do
gene PTHrP
, podendo assim promover a secreção da proteína PTHrP em células-superexpressão EGR4 , resultando em transativação subsequente do
RANKL
,
IL-6
e
IL-8
genes através de ação parácrina de PTHrP. RANKL é conhecido por se ligar ao receptor RANK em precursores de osteoclastos e induzir a formação de osteoclastos. IL-6 e IL-8 também têm sido relatados como sendo importantes para a activação de osteoclasto e osteoclastogénese, respectivamente [30]. Portanto, estes resultados sugerem que a indução de PTHrP EGR4 por sobre-expressão pode ser responsável pela metástase do osso de células cancerosas de pulmão SCLC.