Abstract

Introdução

O prognóstico dos pacientes com câncer de laringe operável é altamente variável e, portanto, biomarcadores de prognóstico potentes são garantidos. O receptor do fator de crescimento semelhante à insulina (IGFR) via de sinalização desempenha um papel crítico na carcinogênese da laringe e progressão.

Pacientes e Métodos

Foram identificados todos os pacientes com estágio TNM localizada câncer de laringe I-III com cirurgia potencialmente curativa, entre 1985 e 2008. imuno-expressão (IHC) de IGF1R-alfa, IGF1R-beta e IGF2R foi avaliada pelo escore imunorreativa (IRS) e níveis de mRNA de efetores importantes da via IGFR foram avaliados, incluindo IGF1R, proteína de ligação IGF 3 (IGFBP3), supressor de citocina sinalização 2 (SOCS2) e membros da MAP-quinase (MAP2K1, MAPK9) e quinase (PIK3CA, PIK3R1) famílias de 3 fosfatidil-inositol. modelos de Cox-regressão foram aplicados para avaliar o valor preditivo dos biomarcadores na sobrevida livre de doença (DFS) e sobrevida global (OS).

Resultados

Entre 289 pacientes elegíveis, 95,2% foram atual ou ex-fumantes, 75,4% eram abusadores de álcool, 15,6% tinham doença do nó-positivos e 32,2% tinha recebido irradiação pós-operatória. Após um acompanhamento médio de 74,5 meses, mediana DFS foi de 94,5 meses e OS mediana foi de 106,3 meses. Usando o IRS mediana como ponto de corte pré-definidos, os pacientes cujos tumores tinham aumentado IGF1R-alfa citoplasma ou expressão membrana experimentou DFS marginalmente mais curtos e OS significativamente menor em comparação com aqueles cujos tumores tinham baixa expressão IGF1R-alfa (91,1 vs 106,2 meses, p = 0,0538 vs 100,3 e 118,6 meses, p = 0,0157, respectivamente). Aumento dos níveis de mRNA de MAPK9 foram associados com prolongado DFS (p = 0,0655) e OS (p = 0,0344). Na análise multivariada, IGF1R-alfa sobre-expressão foi associada com um aumento de 46,6% na probabilidade de recaída (p = 0,0374). preditores independentes para pobres OS incluído doença do nó-positivos (HR = 2,569, p 0,0001)., subglótica /localização transglótico (HR = 1,756, p = 0,0438) e superexpressão da proteína IGF1R-alfa (HR = 1,475, p = 0,0504)

Conclusão

IGF1R-alfa superexpressão da proteína pode servir como um preditor independente de recidiva e sobrevida no câncer de laringe operável. avaliação prospectiva do utilitário IGF1R-alfa prognóstico é justificada

Citation:. Mountzios G, Kostopoulos I, Kotoula V, Sfakianaki I, Fountzilas E, Markou K, et al. (2013) Insulin-like growth factor 1 Receptor (IGF1R) Expressão e Sobrevivência em Operable escamosas-Cell câncer de laringe. PLoS ONE 8 (1): e54048. doi: 10.1371 /journal.pone.0054048

editor: Rodrigo Alexandre Panepucci, Hemocentro de Ribeirão Preto, HC-FMRP-USP, Brasil

Recebido: 30 de julho de 2012; Aceito: 05 de dezembro de 2012; Publicação: 24 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Mountzios et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi em parte financiado pelo Cooperative Oncology Group Helénica (bolsa de pesquisa HE R_5G). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de laringe representa a forma mais comum de carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (SCCHN) em populações com alta prevalência de tabagismo. Sendo responsável por aproximadamente 160.000 novos casos por ano e para 2,5% de todos os tumores nos homens, o câncer de laringe continua sendo um grande fardo da doença em todo o mundo [1]. Apesar dos recentes avanços na gestão multidisciplinar dos primeiros estágios da doença, incluindo protocolos extirpação ou laringe-preservação cirúrgicos execução quimioradioterapia, uma proporção substancial de pacientes com doença localizada ou localmente avançado irá eventualmente recaída e morrer [2]. Mesmo para os pacientes que se submetem ao processo de mutilação de laringectomia total, o prognóstico é altamente variável e unpredictible, tornando a necessidade de identificar potentes marcadores prognósticos uma prioridade médica. estimativa precisa e reprodutível de prognóstico em pacientes com câncer de laringe precoce permitiria o tratamento agressivo das pessoas em alto risco de recaída e evitaria overtreatment potencialmente perigosa no grupo com um resultado favorável presumido.

A insulina e insulin-like receptor do factor de crescimento (IGFR) – mediada vias moleculares que surgiram recentemente efectores como importantes de transformação neoplásica em várias malignidades do tracto aerodigestivo, incluindo o cancro do pulmão de não-pequenas células [3], [4], o cancro [5], [6 tiróide ], câncer de esôfago [7] e SCCHN [8]. A via IGFR compreende dois ligantes (IGF1 e IGF2), suas proteínas de ligação (sendo os mais abundantes-3 IGFBP) e dois receptores (IGF1R e IGF2R), [2]. Ao contrário da insulina, que actua como uma hormona típico, IGF1 e IGF2 têm credenciais tanto como hormonas com propriedades autócrinos e como factores de crescimento de tecidos circulante; IGF1R tem a capacidade de transdução de sinal através de tirosina-quinase intracelular ligado a RAS /RAF /MAP quinase (MAPK) e a quinase (PI3K) vias -Akt 3-fosfatidil-inositol [9]. Precursor de clivagem polipéptido conduz à presença de duas isoformas IGF1R: alfa isoformas (IGF1R-alfa), que é preferencialmente expressa em muitos tipos de cancro e é capaz de se ligar a insulina, IGF-1 e IGF2, e isoforma beta (IGF1R-beta), que liga-se exclusivamente à insulina [10]. IGF2R, por outro lado, se liga apenas a IGF2, é estruturalmente distinto no sentido de que lhe falta um domínio de tirosina-quinase intracelular, e é, portanto, desprovida da capacidade de transdução de sinais mitogénicos, agindo principalmente como um “buffer” para bioactividade IGF2 [ ,,,0],10]. O supressor de citoquina de sinalização (SOCS) da família de proteínas são inibidores das vias de sinalização através de um circuito de realimentação negativo envolvendo principalmente a inibição da actividade de Janus quinase [11], [12]. Dados mais recentes, no entanto, sugerem que as proteínas SOCS e especialmente SOCS2 também podem modular a sinalização mediada pelo IGF1R [13], [14]. Importante, estudos pré-clínicos e traducionais mostram que os componentes da via mediada por IGFR estão implicados em SCCHN risco [15], a angiogénese [16], farmacogenética [17], [18], a quimiossensibilidade [19], a imunoterapia [20] e radiação resposta [21].

em um recente trabalho seminal no campo [22] um preditor multigênica de recorrência no câncer de laringe no início foi desenvolvido e validado. Nesse estudo, um painel de genes que codificam para membros da via IGFR surgiu como uma ferramenta de prognóstico potente capaz de discriminar pacientes com prognóstico pobre e favorável (p 0,0001 no conjunto de treinamento e p = 0,0001 no primeiro conjunto de validação) [22 ]. Estes resultados gerados a hipótese de que a expressão da proteína e os níveis de mRNA dos efectores mais importantes da via IGFR pode ser associado com o resultado clínico em pacientes com cancro da laringe precoce e podem assim servir como marcadores biológicos preditivos de recidiva e sobrevivência neste ambiente. Para testar esta hipótese, retrospectivamente examinada a transcrição gênica tumoral de elementos importantes da via IGFR e avaliamos a expressão da proteína das mesmas moléculas nas células tumorais de pacientes com câncer de laringe cirurgicamente ressecado.

características do paciente e Métodos

coorte paciente

O estudo foi realizado retrospectivamente em uma coorte de pacientes com estágio localizada câncer de laringe I-III (TNM de classificação 6ª, disponível em: https://www.uicc.org/node/7735), gerido entre maio de 1985 e Junho de 2008, o Departamento de otorrinolaringologia do “AHEPA” Hospital em Thessaloniki, Grécia, com ressecção potencialmente curativa, com ou sem irradiação externa. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Bioética da Universidade Aristóteles de Salónica, School of Medicine. Dispensa de consentimento foi obtido a partir desta comissão para todos os pacientes incluídos no estudo antes de 2003. Todos os pacientes incluídos no estudo após 2003 desde que o seu consentimento informado por escrito para o fornecimento de material biológico para futuros estudos. O estudo respeitou as recomendações OBSERVA para estudos prognósticos marcadores tumorais usando material biológico (disponível em https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2361579).

Os pacientes foram avaliados clinicamente pelo visitas mensais regulares para o primeiro ano após a cirurgia e a cada dois meses depois e encenado com a radiografia de tórax, cervical, tórax e tomografia computadorizada abdominal superior verifica a cada seis meses durante os primeiros dois anos após a cirurgia e anualmente ou antes, se clinicamente indicado. Outros procedimentos de diagnóstico ou de teste foram realizadas em indicações clínicas ou alerta sintoma. avaliação do efeito do tratamento foi realizada de acordo com os critérios RECIST para tumores sólidos (www.eortc.be/recist/documents/RECISTGuidelines.pdf~~number=plural).

histológica Avaliação

Um hematoxilina-eosina patologista experiente avaliação (H e) a partir de lâminas coradas blocos de tecido para a adequação do material e cálculo da percentagem de células de tumor em cada caso. Duzentos e oitenta e nove blocos de tecido embebidos em parafina fixadas em formalina foram histologicamente avaliadas para o tipo de tumor e 285 deles com tecido tumoral suficientes foram marcados para dissecção manual. Esta última foi realizada em secções desparafinadas de rotina, a fim de aumentar o conteúdo celular de tumor nos modelos moleculares extraídos, que continham 50% de células de tumor em 64,2% dos casos, e de 30-50% no restante. O fluxograma do estudo, incluindo os números de amostragem correspondentes é apresentada na Figura 1 (diagrama REMARK).

extração de RNA e metodologia de RT-qPCR

Um total de 230 contendo tumor blocos de parafina estavam disponíveis para os estudos moleculares (Figura 1). Macrodissection foi realizada nos casos com 50% de células tumorais, a fim de aumentar o teor de células de tumor em amostras moleculares. Após a lise durante a noite e desparafinização fragmento de tecido com proteinase K a 56 ° C, o ARN foi extraído com TRIzol ® LS Reagente e transcrito de forma inversa com iniciadores aleatórios (cat. 48190-011 nenhum) e o SuperScript® III transcriptase reversa (todos os reagentes da Invitrogen /Life Technologies, Paisley, UK), de acordo com as instruções do fabricante. Após medições UV, 0,5-3 ug de RNA total foram sujeitas a transcrição reversa, os ADNc foram normalizadas a 25 Molde ng /ul e mantidos a -20 ° C até à sua utilização. expressão de mRNA relativo foi avaliado com sondas qPCR e hidrólise usando premade tubo único gene TaqMan® Ensaios de Expressão (Applied Biosystems /Life Technologies) em um sistema ABI7900HT sob condições padrão para os seguintes objectivos (entre parênteses: Ensaio de ID; referência Genbank; localização amplicon ; tamanho): IGF1R (Hs00609566_m1; NM_000875.3; exons 10-11; 64 pb), IGFBP3 (Hs00426289_m1; NM_000598.4, NM_001013398.1; exons 4-5; 84 pb), MAP2K1 (Hs00983247_g1; NM_002755.3; exons 10-11; 68 pb), MAPK9 (Hs00177102_m1; NM_001135044.1, NM_002752.4, NM_139068.2, NM_139069.2, NM_139070.2; exons 2-3; 102 pb), PIK3CA (Hs00180679_m1; M_006218.2; exons 6-7; 104 pb), PIK3R1 (Hs00933163_m1; NM_001242466.1, NM_181504.3, NM_181523.2, NM_181524.1; exons 8-9, 9-10, 15-16; 82 pb), e, SOCS2 ( Hs00919620_m1; NM_003877.3; exons 2-3; 91 pb). As amostras foram testadas em 10 ul reacções molde (50 ng /reacção), com TaqMan® Universal PCR Master Mix e foram corridas em duplicado em placas de 384 poços. Um ARN de referência comercialmente disponível (TaqMan ® Controlo ARN total, Cat. 4307281 não, Applied Biosystems /Life Technologies) foi usado como um controlo positivo em cada corrida. Como um controlo endógena e para a normalização de Cq (ciclo de quantificação, o que é sinónimo de ciclo [Limite] CT) valores, um ensaio de direccionamento de ARNm GUSB (beta-glucuronidase [4333767F #]) foi usado. GUSB foi preferido sobre controles endógenos usualmente aplicados, porque (a) não pseudogenes tenham sido ainda relatados para este gene, e (b) que tenha sido identificado como um dos alvos de mRNA mais bem preservados em tecidos FFPE [23]. A quantificação relativa (RQ) foi avaliada em um modo linear, tal como (40 – DCT) [24], em que DCT = (médio alvo CT) – (AVG GUSB CT). PCR estabilidade ensaio foi avaliada entre corridas com o RNA de referência (deltaRQs inter-funcionamento: IGF1R 0,78; IGFBP3 0,72; MAP2K1 0,39; MAPK9 0,92; PIK3CA 0,62; PIK3R1 0,59; SOCS2 0,92). Os critérios de exclusão para a análise da amostra RQ foram GUSB CT valores superiores a 36 para cada duplicado; e, deltaRQ valores superiores a 0,85 por par duplicado. Com os critérios acima referidos, os resultados informativos foram obtidos em 191 (83%) das 230 amostras FFPE RNA. No entanto, o número de amostras informativos variou entre 175 (75%) do IGF1R para a 138 (59%) para SOCS2 resultando em apenas 118 (51%) amostras informativas para todos os alvos. Assim, o agrupamento de valores RQ para a avaliação dos perfis de expressão gênica correspondentes não puderam ser avaliados.

TMA construção, imunohistoquímica e o sistema de pontuação

construção TMA foi realizada como descrito anteriormente [25] . Resumidamente, seriados de 3 mm de espessura formar os blocos originais ou os blocos de TMA, montadas em lâminas de microscópio de adesão, foram cortados no Laboratório de Oncologia Molecular da Fundação Helénica da Cancer Research, Universidade Aristóteles de Salónica School of Medicine. A rotulagem (IHC) imuno-histoquímica foi realizada, utilizando autostainers bond Max ™ (Leica Microsystems, Wezlar, Alemanha) e i6000 (Biogenex, San Ramon, CA). Os cortes foram corados com anticorpo anti-IGF1R-alfa (clone 24-31, Lab Vision, Fremont, CA, na diluição 1:50 durante 1 h), anti-IGF1R-beta (C-20, SC-713, um anticorpo policlonal, criado contra um mapeamento peptídico na extremidade C-terminal da molécula de IGF-I a, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, em 1:250 diluição de 1 h) e IGF-2R (C-15, SC-14410, o anticorpo policlonal de cabra, Santa Cruz, em 1:250 diluição de 1 h). O complexo antigénio-anticorpo foi visualizada utilizando diaminobenzidina (DAB) como um cromogénio. As lâminas foram contrastadas com hematoxilina de Mayer, lavada em água fresca, desidratados, e montado. Como controlos externos, utilizou-se os núcleos (12 no total para cada TMA) a partir de vários tecidos não-neoplásicas e neoplásicas, incluindo placenda, endométrio, rim, amígdalas, glândula mamária, nódulo linfático, cancro da próstata e carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço. Como controlos internos, utilizou-se o epitélio vizinha de glândulas mucosas e o normal, hiperplásico e epitélio colunar displásico.

Para a avaliação do IGF1R-alfa, o IGF-1R-beta e IGF2R foi utilizada uma abordagem com base em semi-quantitativo intensidade da coloração (SI) e a percentagem de células positivas (PP), para criar o marcador imunorreactivo (IRS) como se segue: IRS = SIxPP, para cada amostra, como descrito anteriormente [26], [27]. A intensidade foi pontuado como se segue: 0 = nenhuma coloração, 1 = fracamente positivo, 2 = moderadamente positiva, e 3 = fortemente positiva. A pontuação do padrão de coloração foi baseada na percentagem de células tumorais positivas: 0 = 0-5%, 6-25% 1 =, 2 = 26-50%, 3 = 51-100%). O IRS pontuação, assim, variou de 0 a 9. A localização de coloração para cada proteína também foi indicada quer como citoplasmática ou citoplasmática /membranoso membranoso ou.

Todos os casos discordantes foram resolvidos dentro de reuniões de consenso. A fim de evitar resultados falso-positivos decorrentes de múltiplos cálculos de corte, foi utilizado o valor mediano do IRS como o pré-definida de corte para cada marcador, como anteriormente sugerido [25]. Uma amostra do tumor foi considerado “alto-expressão” se o IRS estava acima ou igual à mediana e “low-expressão” outra forma.

Considerações Estatísticas

Em relação à expressão IHC de IGF1R e IGF2R o mediano IRS foi pré-definido como o candidato de corte para avaliar o papel prognóstico do IGFR na sobrevida livre de doença (DFS) e sobrevida global (oS). No que diz respeito biomarcadores cuja expressão foi medida no ARNm nivelar a sua distribuição foi examinada para cut-off naturais. Em caso de não identificação de um ponto de corte natural, os primeiro, segundo e terceiro quartis foram examinadas por meio de análise de regressão univariada de Cox como possíveis limiares. Se um corte mostrou significância prognóstica foi usado para dicotomizar as amostras em tumores de baixo e alto expressam. candidatos pontos de corte adicionais foram exploradas com a utilização de Curvas ROC (ROC) utilizando a taxa de 3 anos observou DFS como resultado binário validado com a análise de bootstrap. No caso em que nenhum de corte foi identificada a mediana foi usada. Em significado análise multivariada foi determinada ao nível de 15% e, em univariada em 5% (frente e verso).

DFS foi medido a partir do momento do diagnóstico até verificada a progressão da doença, a morte ou o último contato e OS de diagnóstico até a morte por qualquer causa ou a data do último contato. distribuições tempo-a-evento foram estimadas usando curvas de Kaplan-Meier. As associações entre biomarcadores e com o paciente e do tumor características básicas foram examinadas usando o teste exato de Fisher para variáveis ​​categóricas e Mann-Whitney ou o teste de Kruskall-Wallis quando apropriado para variáveis ​​contínuas. Para a expressão de mRNA contínua as correlações foram calculadas por meio do teste de correlação de Pearson. A análise estatística cumprido as recomendações de relatórios de estudos prognósticos marcadores tumorais [28].

Resultados

características clínicas e evolução

Duzentos e oitenta e nove pacientes, em sua maioria do sexo masculino (95,8%), os fumantes atuais ou ex (95,2%) e etilistas (75,4%), com uma idade mediana de 63 anos no momento do diagnóstico, foram incluídos na presente análise. Como mostrado na Tabela 1, de diagnóstico work-up levou ao diagnóstico do carcinoma de células escamosas da laringe predominantemente supraglótica (46,7%) ou glótica (43,3% dos casos), na maior parte fase T3-4 (77,8% dos casos) e mais frequentemente do nó -negative ao exame clínico /radiológico (84,1%). gestão inicial consistiu de ressecção cirúrgica do tumor por meio de laringectomia total (84,1%) ou por procedimentos mais conservadores (15,9%). Um esvaziamento cervical foi realizado em 29,1% dos casos, enquanto no pós-operatório radioterapia externa foi administrada em 32,2%.

em um tempo médio de acompanhamento de 74,5 meses, 135 (46,7%) pacientes

recaíram e 117 (40,5%) tinham morrido. A mediana e cinco anos foram DFS 94,5 meses (CI de 95%: 80.9-108 meses) e 60,8%, respectivamente, enquanto que a mediana e cinco anos foram SO 106,3 meses (CI de 95%: 89.3-123.3 meses) e 66,1% , respectivamente. Como esperado, OS médio foi significativamente menor para os pacientes com doença positiva do nó de linfa, em comparação com aqueles com negativo do nó de linfa (28,7 vs 106,5 meses, p 0,001), para pacientes com mais de 63 anos de idade no momento do diagnóstico, em comparação com mais jovens queridos (87,3 vs 139,1 meses, p = 0,006) e para os pacientes cujos tumores tinham uma subglótica ou localização transglótico em comparação com aqueles cujos tumores estavam localizados em região supraglótica (82,8 vs 117,5 meses, p = 0,01). Em comparação com os doentes que tinham inicialmente sido submetidos a laringectomia total, os pacientes que se submeteram a cirurgia mais conservadora experiente estatisticamente significativamente menor média DFS (55,9 vs 106,2 meses, p = 0,011), mas não OS (124,8 vs 106,3 meses, p = 0,671), provavelmente devido para o efeito de salvamento laringectomia.

IHC Expressão de IGFR e correlação com resultado

resultados da coloração IHC foram obtidos para 285 (98,6%) de amostras de tumor para todos os três marcadores (IGF1R-alfa , IGF1R-beta e IGF2R). O padrão de imunocoloração para IGF1R-alfa foi predominantemente citoplasmática e /ou membranoso e foi de moderada a forte (IRS≥3) em 56,1% dos casos (Figura 2A). Pelo contrário, o IGF1R-beta imunocoloração foi principalmente citoplasmático (Figura 2B). e estava ausente (IRS = 0) em 81,7% dos casos, apesar da existência de controles internos positivos (macrófagos e estroma). IGF2R imunocoloração era predominantemente citoplasmática e foi de moderada a forte (IRS≥2) em 53,6% dos casos (Figura 2C). De nota, observou-se uma co-expressão significativa entre citoplasmática IGF1R-alfa e do IGF1R-alfa imunocoloração membranosa (r = 0,28, p 0,0001), mas não entre IGF1R-alfa e do IGF1R-beta (r = -0,02, p = 0,779) , nem entre IGF1R-alfa e IGF2R (r = 0,09, p = 0,133). Esses achados nos pediu para explorar ainda mais o IGF1R-alfa expressão membranoso /citoplasmática IHC em relação às variáveis ​​clínico-patológicas.

A. IGF1R-alfa forte coloração membranosa em 100% de células cancerosas (IRS = 9); B. IGF1R-beta forte coloração citoplasmática em 80% de células cancerosas (IRS = 9); C. IGF2R forte coloração citoplasmática e membranosa em 80% de células cancerosas (IRS = 9). Todas as imagens: ampliação X 40.

Conforme apresentado na Tabela 2, alta expressão de IGF1R-alfa (IRS≥3) foi significativamente associada com características de doença avançada, incluindo estágio TNM III ou IV no momento do diagnóstico (p = 0,011) e laringectomia total como o procedimento cirúrgico inicial (p = 0,018). Pelo contrário, o IGF1R-beta e expressão IGF2R IHC não foi associada a qualquer uma das variáveis ​​estudadas clinicopatológicas (dados não mostrados). Na análise univariada, os pacientes cujos tumores sobre-expresso citoplasma /membrana IGF1R-alfa experimentou marginalmente menor DFS média, em comparação com aqueles cujos tumores não o fizeram (91,1 vs 106,2 meses, p = 0,0538), e estatisticamente significativamente menor OS mediana (100,3 vs 118,6 meses, p = 0,0157), (Figura 3). Nenhum dos outros marcadores IHC mostraram qualquer associação com os resultados de sobrevivência, nem a combinação de IGF1R-alfa expressão IHC com qualquer outro rendimento marcador mais informações sobre o resultado do paciente.

expressão de mRNA e correlação com o resultado

disponibilidade de amostras de tumor para a avaliação da expressão de ARNm para cada um dos biomarcadores é fornecida na Figura 1. a fim de avaliar a expressão de ARNm dos genes relacionados com a via de IGFR e para pesquisar a sua distribuição para corte naturais -offs, histogramas de valores RQ para cada biomarcador de frequência foram tabulados e as boxplots correspondentes foram construídas (Figura S1). operador receptor análise característica (ROC) utilizando a 3 anos DFS como análise de indicadores e quartil da distribuição identificados como pontos de corte a mediana para IGF1R, IGFBP3, MAP2K1, MAPK9, PI3KR1 e SOCS2 ea 61

st percentil para PIK3CA. Quando a associação dos marcadores foram avaliadas de forma contínua, a expressão do mRNA IGF1R foi significativamente associada com a expressão do mRNA de IGFBP3 (r = 0,22, p = 0,0032), MAP2K1 (r = 0,50, p 0,0001), MAPK9 (r = 0,51, p 0,0001), PIK3CA (r = 0,34, p 0,0001), PIK3R1 (r = 0,37, p 0,0001) e SOCS2 (r = 0,27, p = 0,0014), indicando que o IGF1R ARNm é co-expressa com todos os outros efectores importantes da via molecular IGF. As moléculas a jusante das duas principais cascatas de sinalização desencadeada por activação IGFR (MAPK9 com MAP2K1 e PIK3CA com PIK3R1) também estavam significativamente correlacionados uns com os outros em termos de expressão de ARNm. Finalmente, a expressão do mRNA IGFBP3 foi correlacionada com MAPK9, PIK3CA e expressão de mRNA SOCS2 (Tabela S1).

Nenhum de expressão de mRNA do biomarcador, avaliada como variável contínua, foi associado a qualquer uma das variáveis ​​clínico-patológicos estudados (dados não mostrando). Na análise univariada e usando os valores de corte identificados, os pacientes cujos tumores tinham alta MAPK9 expressão de mRNA experimentou marginalmente mais tempo mediano DFS (91,8 vs 81,0 meses, p = 0,0665) e estatisticamente significativamente maior média OS (117,5 vs 87,3 meses, p = 0,0344 ), em comparação com os pacientes cujos tumores tinham níveis baixos de mRNA MAPK9. Da mesma forma, os pacientes cujos tumores tinham alta PIK3CA expressão de mRNA experimentou mais -embora não significantly- mediana DFS (106,2 vs 80,5 meses, p = 0,0723) e OS mediana (141,8 vs 94,5 meses, p = 0,0726), quando comparados com pacientes cujos tumores tinham baixos níveis de mRNA PIK3CA (Tabela S2).

Correlação de expressão IGF1R IHC com níveis de mRNA

Foi observada uma tendência não significativa para a co-expressão de IGF1R-alfa membranoso ou coloração citoplasmática e IGF1R os níveis de ARNm -alfa, conforme avaliado com o teste de correlação de Spearman (r = 0,14, p = 0,0621), (Figura S2). No entanto, não houve correlação de IGF1R-alfa expressão IHC com níveis de mRNA de qualquer um dos outros biomarcadores avaliados (dados não mostrados).

Análise multivariada

Na análise multivariada, os preditores independentes para DFS eram o tipo de cirurgia (laringectomia vs cirurgia conservadora), status do nó de linfa (positivo vs negativo), sexo (masculino vs feminino), idade ao diagnóstico (acima ou abaixo da mediana de 63 anos), localização do tumor (subglótica /transglótico vs supraglótica /glótica) e IGF1R-alfa citoplasmático ou expressão IHC membranosa (alta vs baixa), (Figura 4A). preditores potente para DSF eram do sexo masculino, o qual foi associado com um aumento de mais de quatro vezes no risco de recaída (HR = 4,459, IC de 95% 1,079-18,436, p = 0,039) e a presença de infiltrados nódulos linfáticos positivos () , o que foi associado com um aumento de mais de duas vezes no mesmo risco (HR = 2,313, IC de 95% 1,477-3,622, p = 0,0002). É importante ressaltar que os pacientes cujos tumores sobre-expresso IGF1R-alfa teve um aumento de 46,6% no risco de recaída, após o ajuste para todos os fatores acima mencionados preditivos (HR = CI 1466, 95%: 1,022-2,102, p = 0,0374).

O modelo final para oS incluiu as mesmas variáveis ​​clínico-patológicas mais T-estágio (T3 /T4 vs T1 /T2). Os mais poderosos fatores prognósticos adversos para OS foram infiltradas linfonodos (HR = CI 2.569, 95%: 1,610-4,100, p 0,0001), com idade superior a 63 anos (HR = CI 1.785, 95%: 1,211-2,630, p = 0,0034) e subglótica /localização transglótico (HR = CI 1.756, 95%: 1,016-3,036, p = 0,0438). Como mostrado na Figura 4B, o aumento da citoplasmática ou a expressão da proteína do IGF1R-alfa membranosa, foi associado com um aumento de 47,5% absoluta no risco de morte após ajuste para todas as outras variáveis ​​clínicas e este resultado foi marginalmente significativa (HR = 1,475, IC de 95% : 1,000-2,178, p = 0,0504). Notavelmente, a incorporação de expressão IGF1R IHC no modelo multivariada permitiu a estratificação dos pacientes em três grupos com o prognóstico distintos, dependendo do número de fatores prognósticos adversos (1-2, 3 e 4 ou mais fatores adversos para a favorável, intermediário e desfavorável grupo prognóstico respectivamente). Por exemplo, OS mediana foi de 70,7 meses (95% CI: 35.4-100.3 meses) para os pacientes no grupo de prognóstico desfavorável e 106,3 meses (95% CI: 84.8-130.4 meses) no grupo de prognóstico intermediário, ao passo que não foi alcançado em o grupo favorável prognóstico (Figura 5).

Discussão

no presente estudo, o único a nosso conhecimento explorar o papel prognóstico do IGF1R no câncer de laringe precoce, mostrámos que o aumento citoplasmática IGF1R-alfa e /ou expressão membraneous, avaliada por imuno-histoquímica e quantificados com o sistema de IRS, é um fator prognóstico adverso independente para recorrência e sobrevivência em pacientes com (cirurgicamente ressecado) carcinoma precoce de células escamosas da laringe. expressão IGF1R-alfa permaneceu um importante fator prognóstico tanto para DFS e OS mesmo após o ajuste para as variáveis ​​clínico-patológicas bem definidas, tais como comprometimento de linfonodos cervicais, idade e localização do tumor. Estes resultados estão em linha com uma prova importante recentemente publicado em matrizes de genes [22] que destacam a importância do caminho molecular mediada por IGFR na carcinogênese da laringe e progressão; De nota, tratamentos atuais em estágios iniciais de câncer de laringe incluem a ressecção cirúrgica com ou sem radioterapia adjuvante, como usado em nossa coorte, tornando assim os nossos resultados em tempo útil e clinicamente relevante. Além disso, a viabilidade e reprodutibilidade da avaliação IRS em laboratórios de patologia independentes tornam a expressão da proteína IGF1R-alfa um biomarcador atraente para a prática clínica de rotina que podem servir como uma ferramenta de decisão para um tratamento mais agressivo no câncer de laringe cedo.

A via molecular IGFR mediada foi consistentemente implicadas na transformação neoplásica e progressão em um número de malignidades humanas, incluindo as do tracto aerodigestivo e tem assim uma longa atraído atenção tanto como um potencial biomarcador prognóstico [9], [10], e como um potencial alvo para intervenção terapêutica [11], [12]. Os dados referentes IGFR valor prognóstico em NSCLC são bastante divergentes [3], [4], [29], embora um estudo recente [5] demonstraram que a expressão da proteína do IGF1R é maior em histologias de células escamosas e concluíram que a proteína do IGF1R e expressão do gene eram não associadas com a sobrevivência, enquanto que

IGF1R

número de cópias do gene abrigava valor prognóstico. No câncer de laringe, a escassez de dados não permitem conclusões seguras a ser desenhado: IGF1R e os níveis séricos IGFBP3 não foram identificados como preditores significativos da evolução clínica na única grande coorte de 540 pacientes com SCCHN, incluindo 440 pacientes com câncer de laringe, publicados até à data [9]; Este estudo, no entanto, avaliaram os níveis exclusivamente séricos de IGF1R e IGFBP3 e não tumoral níveis de mRNA ou a expressão IHC, como no nosso grupo. Curiosamente, IGFBP3 foi reportado para actuar como um supressor do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) em SCCHN angiogénese [16] e para ser regulada negativamente nas fases iniciais da cabeça e pescoço carcinogénese [30]. No carcinoma de células escamosas oral, expressão de mRNA IGFBP3 tem sido correlacionada com um resultado mais favorável, apoiando ainda mais o seu papel como um inactivador IGF1 [31]. Em um estudo recentemente publicado [32], a combinação de IGF1R e IGFBP3 IHC superexpressão foi prognóstico para pior sobrevida em uma coorte de 131 pacientes com SCCHN. Em nossa coorte, composta exclusivamente por pacientes com câncer de laringe, a incorporação de expressão IGFBP3 IHC não melhorou a capacidade de prognóstico do IGF1R sozinho. Finalmente, o papel de IGF2R no cancro da laringe continua por ser elucidado [33], embora pareça provável que a falta de um domínio tirosina-quinase priva o receptor a partir da capacidade de transduzir sinais proliferativos e pode assim explicar a ausência de valor prognóstico do marcador observado em nossa coorte.

Um elemento importante na concepção do nosso estudo foi o uso de anticorpos monoclonais distintos orientados para as duas isoformas distintas da proteína IGF1R (alfa e beta). Esta discriminação é de particular importância uma vez que apenas IGF1R-alfa é capaz de se ligar com o IGF1 e IGF2 e é, portanto, essencial para a transdução de sinal mediada por IGFR [11].