Abstract
O papel dos microRNAs no carcinoma do pulmão de pequenas células (CPPC) é em grande parte desconhecido. miR-34a é conhecido como um supressor de tumor p53 regulada microARN em muitos tipos de cancro. No entanto, a sua implicação terapêutica nunca foi estudada em CPPC, um tipo de cancro com disfunção frequente de p53. Foi investigada a expressão de um painel de 7 microARNs (MIR-21, o miR-29b, o miR-34a /b /c, de miR-155, e deixa-7a) em 31 tumores SCLC, 14 linhas de células de SCLC, e 26 de células NSCLC linhas. Observou-se significativamente mais baixa de miR-21, o miR-29b, e expressão de miR-34a em linhas de células SCLC do que em linhas celulares de NSCLC. A expressão dos microRNAs 7 não estava relacionado com as características clínicas dos pacientes com CPPC e não era nem prognóstico em termos de sobrevivência global ou sobrevida livre de progressão, nem preditivos de resposta ao tratamento. Superexpressão ou downregulation de miR-34a não influenciou a viabilidade das células SCLC. A expressão destes 7 microRNAs também não prever
in vitro
sensibilidade a cisplatina ou etoposido em linhas de células SCLC. Superexpressão ou downregulation de miR-34a não influenciou sensibilidade a cisplatina ou etoposido em linhas de células SCLC. Em contraste com a regulação negativa dos genes alvo de miR-34a cMet e Axl por sobre-expressão de miR-34a em linhas celulares de NSCLC, a expressão intrínseca de cMET e Axl foi baixa em linhas de células SCLC e não foi influenciada por sobre-expressão de miR-34a. . Nossos resultados sugerem que a expressão dos microRNAs 7 selecionadas não estão prognóstico em pacientes com CPPC, e miR-34a não está relacionado com o comportamento maligno das células SCLC e é improvável que seja um alvo terapêutico
Citação: Lee JH , Voortman J, Dingemans A-MC, Voeller DM, Pham T, Wang Y, et al. Expressão (2011) MicroRNA e evolução clínica de pequenas células do câncer pulmonar. PLoS ONE 6 (6): e21300. doi: 10.1371 /journal.pone.0021300
editor: William C. S. Cho, a rainha Elizabeth Hospital, Hong Kong
Recebido: 08 de fevereiro de 2011; Aceite: 25 de maio de 2011; Publicado: 22 de junho, 2011 |
Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0
Financiamento:. O estudo foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, programa intramural National Cancer Institute. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) é responsável por cerca de 10-20% dos casos de cancro do pulmão e é notório por sua agressividade e taxa de sobrevivência pobres [1], [2]. Apesar de progressos moderados alcançado nas últimas duas décadas, a taxa de sobrevivência de doentes com CPPC ainda é muito pobre [2], [3]. Parcialmente devido à falta de biomarcadores moleculares adequadas para guiar o tratamento de SCLC, os resultados clínicos das terapias moleculares orientadas, tais como imatinib, gefitinib, bcl-2, inibidores e os inibidores de mTOR no tratamento de pacientes com SCLC são decepcionantes [4].
expressão MicroRNA se correlaciona com características biológicas de câncer, tais como diferenciação celular, a agressividade, a invasão, angiogénese e comportamento metastático [5], [6], [7]. Por exemplo, os membros da família de miR-34, o miR-34a, 34b-miR, e miR-34C, são alvos transcricionais directos de p53 e a sua expressão induz a paragem do ciclo celular em linhas celulares de cancro [8]. miR-29b atua como um supressor tumoral microRNA através da restauração de um padrão normal de metilação do DNA [9]. Clinicamente, microARN perfis tem sido mostrado para ajudar no diagnóstico de cancro, bem como a previsão do prognóstico e resposta ao tratamento [6], [10]. Os papéis de microRNAs em biologia do câncer e previsão prognóstico no câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) têm sido amplamente estudados. Aumento miR-34a foi associada com menos recaídas em um pequeno estudo retrospectivo de pacientes com NSCLC ressecados [11]. Superexpressão de deixá-7a, possivelmente através de supressão do oncogene RAS [12], foi mostrado estar relacionado ao aumento da sobrevida global em pacientes com NSCLC [13], e também estava entre os fatores prognósticos de protecção prevenção da recorrência em NSCLC cirurgicamente ressecado [14] . foi mostrado sobre-expressão de “oncomirs” miR-21 e miR-155 a ser relacionada à diminuição da sobrevida global em pacientes com NSCLC [13], [15]. Há apenas dados escassos sobre o papel da expressão microRNA no CPPC, ea função de vários microRNAs relacionados ao câncer bem documentados em outros tipos de câncer nunca foi abordada em SCLC. Por exemplo, embora SCLC é caracterizada por disfunção frequente p53 [16], o papel de miR-34a, um supressor de tumor p53 regulada microARN [8], [17], nunca foi estudado em CPPC.
recentemente demonstrado, utilizando uma reacção em tempo real em cadeia da polimerase (PCR) com base na plateform, que os perfis de um painel de sete microARNs associados ao cancro (mIR-21 de expressão, o miR-29b, o miR-34a /b /c, miR- 155, e deixe-7a) não são nem previsível nem prognóstico em pacientes com NSCLC recebendo quimioterapia adjuvante à base de platina [18]. No entanto, no cancro pancreático ressecado usando o mesmo painel de microARNs, que mostraram que a baixa expressão de miR-21 estava associada com o aumento da sobrevivência após o tratamento adjuvante em duas coortes independentes de doentes com adenocarcinoma ductal pancreático [19], sugerindo que a expressão de microRNAs e os seus implicações de prognóstico e de previsão são susceptíveis de ser específico de tumor. No presente estudo, nós exploramos o papel dos microRNAs para a previsão de ambos prognóstico e tratamento resultado em SCLC utilizando amostras de doentes e linhas de células SCLC. Nós ainda estudaram como expressão de miR-34a afeta o comportamento maligno das células SCLC.
Resultados
expressão microRNA em tumores SCLC e linhas celulares de cancro do pulmão
A tabela 1 resume o principais características dos pacientes e Tabela S1 retrata expressão microRNA em relação às variáveis clínicas. Tendências foram observadas em favor de maior expressão deixá-7a em mulheres e em pacientes mais jovens (p = 0,07 e 0,13, respectivamente, pelo teste de Wilcoxon Rank-Sum). Não foram observadas correlações significativas entre a expressão de microRNAs e características clínicas. Nós comparamos expressão dos 7 microARNs entre linhas de células SCLC e linhas celulares de NSCLC. menor expressão de miR-21, miR-29b, e miR-34a foi encontrada em linhas de células SCLC do que em linhas celulares de NSCLC (p 0,001 para todos os três microRNAs, figura S1), que está de acordo com um relatório anterior [20] . Nós ainda realizada
in situ
hibridação de miR-34b, em uma amostra de tumor SCLC e observou a expressão citoplasmática de miR-34b e expressão nuclear de U6 ARN nucleolar como esperado (Figura S2).
microRNA não está correlacionada com a sobrevivência dos pacientes SCLC
A sobrevida global mediana e sobrevida livre de progressão desta coorte estudo foram 49,1 e 35,7 semanas, respectivamente. Tal como esperado, mais sobrevivência global foi observada em pacientes com SCLC que tiveram doença limitada e doentes que atingiram uma resposta completa após o tratamento (Tabela 1 e Tabela S2). Entre as 7 microARNs estudada, não houve diferença de sobrevivência entre os pacientes com alta e baixa expressão microARN, definido pela expressão mediana de cada microARN em espécimes de tumor (Tabela 2). Isto era verdade em ambos os pacientes com doença limitada e extensas (Tabela S3).
expressão da proteína p53 não está relacionado com miR-34a expressão /b /c em tumores SCLC
Como miR- 34a, o miR-34b, e miR-34c são alvos transcricionais directos de p53 [8] e Bcl-2 é um alvo de miR-34a [21], exploramos se a expressão de p53 afecta a expressão de miR-34a /b /c e se a expressão de Bcl-2 está relacionada com miR-34a. Utilizando amostras a partir da mesma coorte de estudo, Dingemans
et ai demonstraram que a expressão de proteína de p53 não está relacionado com a sobrevivência de pacientes com SCLC e não está relacionada com a expressão da proteína de Bcl-2 bem como [22]. Observou-se que a expressão da proteína p53 em tumores de SCLC não estava relacionado com a expressão de miR-34a, 34b-miR, e miR-34c (Figura S3A, B, e C). Além disso, a expressão de miR-34a não estava relacionado com expressão de Bcl-2 em tumores SCLC (Figura S3D).
expressão de miR-34a não está relacionado com viabilidade de SCLC
in vitro
para explorar o papel da expressão microRNA no comportamento maligno da SCLC, nós nos concentramos em miR-34a porque miR-34a foi relatado para ser um marcador de sobrevivência prognóstico [11] e para ser um dos poucos candidatos para substituição microRNA terapia em NSCLC [23], [24]. Nós sobre-expressos ou sub-regulada miR-34a em células SCLC. Usando um precursor de miR-marcado com Cy3 ou inibidor para avaliar a eficácia de transfecção, verificou-se que 24 horas após a transfecção, a eficácia de transfecção de miR-percursor ou inibidor em células NCI-H82 SCLC era quase 100% (Figura S4). elevada eficácia de transfecção foi também observada em NCI-H146, NCI-N592, GLC4, A549, e as células NCI-H1299 (dados não mostrados). Observamos amadurecer maior expressão de miR-34a em células transfectadas com o precursor de miR-34a e amadurecer menor expressão de miR-34a em células transfectadas com o inibidor de miR-34a, em comparação com células transfectadas com o precursor de controlo e inibidor, respectivamente (Figura 1A). Considerando que a sobre-expressão de miR-34a induz a paragem em G1 em várias linhas celulares de cancro [8], a paragem em G1 não foi observado em células NCI-H82 SCLC transfectadas com precursor de miR-34a (Figura 1B). Regulação negativa de miR-34a em células NCI-H146, que expressa um nível mais elevado de miR-34a, em comparação com o nível de expressão média das 14 linhas de células SCLC (Tabela S4), e em células NCI-N592, que expressavam menor nível de miR -34a, não influenciou a viabilidade das células SCLC (Figura 1C e D). Em contraste com o efeito supressor de tumor geralmente aceite de miR-34a, a sobre-expressão de miR-34a em NCI-82 células não conseguiu atenuar o crescimento celular (Figura 1E), ao passo que a atenuação do crescimento celular foi observada em células NCI-H1299 NSCLC (Figura S5 ), tal como demonstrado em um relatório anterior [23]. Ao contrário de Wiggins
et al.
Que demonstrou que a transfecção repetitivo e de longo prazo de incubação de miR-34a diminui a viabilidade das células do câncer NCI-H226 NSCLC [23], não conseguimos observar o efeito de transfecção repetitivo de miR-34a em diminuir a viabilidade celular em células NCI-N592 (Figura 1F).
(a) a expressão de miR-34a em células NCI-N592 e células NCI-H82 transfectadas com precursor miR-34a ou inibidor. O valor Ct delta-delta foi calibrado com o valor Ct delta do miR34a em células transfectadas com o controlo de precursores ou inibidor de miR, respectivamente. (B) a distribuição do ciclo celular de células NCI-H82 transfectadas com o controlo de precursores de miR, precursor de miR-34a, controlar inibidor de miR e inibidor de miR-34a. (C e D) Ensaio de crescimento celular de NCI-H146 (C) e células transf ectadas com o inibidor de miR-34a ou controlar inibidor de miR NCI-N592 (D). (E) Ensaio de crescimento celular de células NCI-H82 transfectadas com precursor de miR-34a ou controlar o miR precursor. (F) A viabilidade celular das células NCI-N592 após transfecção repetitivo de controlo dos precursores miR ou precursor de miR-34a. As células foram contadas e transfectadas novamente de três em três dias. As barras de erro indicam o desvio padrão. Os valores de p foram calculados de acordo com a viabilidade das células 5 dias após a transfecção com a excepção de microARN precursor em células NCI-N592, que foi calculada de acordo com o número de células contadas 9 dias depois da primeira transfecção.
expressão microRNA não influencia sensibilidade às drogas de células SCLC
Em primeiro lugar, testou a correlação entre a expressão microRNA e sensibilidade das 14 linhas de células SCLC a cisplatina e etoposídeo. Não surpreendentemente, a sensibilidade das células SCLC para etoposido se correlaciona com a sensibilidade ao cisplatino (coeficiente de correlação = 0,74, p = 0,004). Observou-se que a expressão dos microRNAs 7 não foi associada com quimio-sensibilidade de células SCLC a qualquer agente (Tabela 3).
A seguir, avaliou se a sobre-expressão ou regulação baixa de miR-34a em células SCLC influenciaria sensibilidade quimioterapia, como a expressão de miR-34a foi relatado estar relacionada com a resistência à quimioterapia em uma linha de células de cancro da próstata [25]. células NCI-H82, que carregam uma mutação TP53 silenciosa (Tabela S4) foram transfectadas com o controlo de precursores de miR, precursor de miR-34a, controlar inibidor de miR e inibidor miR-34a, e, posteriormente, tratados com cisplatina ou etoposido. IC
50 valores mediante tratamento com cisplatina foram de 0,9 ± 0,02 fiM, 1,19 uM ± 0,3, 0,83 ± 0,15 ^ M, e 0,79 ± 0,13 pM, respectivamente (p = 0,1 por ANOVA de uma via) (Figura 2A e B). A IC
50 valores etoposido após tratamento foram de 0,28 ± 0,05 ^ M, 0,31 ± 0,04 ^ M, 0,54 ± 0,40 ^ M, e 0,58 ± 0,07 pM, respectivamente (p = 0,24) (Figura 2C e D). Para GLC4 células, que transportam a mutação K132E no gene TP53 (Tabela S4), o CI
50 valores mediante tratamento com cisplatina foram 3,03 ± 0,87 ^ M, 2,56 ± 0,85 ^ M, 1,87 ± 0,30 ^ M, e 1,92 ± 0,61 pM, respectivamente (p = 0,14) (Figura S6A); a IC
50 valores etoposido após tratamento foram de 0,19 ± 0,03 ^ M, 0,28 ± 0,01 ^ M, 0,20 ± 0,03 ^ M, e 0,19 ± 0,06 pM, respectivamente (p = 0,08) (Figura S6B). Em resumo, a sobre-expressão transitória ou a regulação negativa de miR-34a em células SCLC não afectou a sensibilidade a cisplatina ou etoposido, independentemente do seu estatuto TP53.
As células foram transfectadas com os oligonucleótidos indicados. As barras de erro indicam o desvio padrão de ensaios em triplicado.
Expressão de genes alvo miR-34a diferem entre linhas celulares de cancro
Nós avaliamos a expressão de miR-34a-alvo genes selecionados em linhas de células SCLC e NSCLC. Genes selecionados foram MET [8], MAP2K1 [26], BCL2 [21], e Axl [27]. Observou-se uma correlação inversa entre o miR-34a e c-MET, mas não Bcl-2 expressão em 5 linhas de células SCLC (Figura S7A e B). Apesar de relativamente menor expressão de miR-34a em linhas de células SCLC (Figura S1), não observamos comparativamente maior expressão de c-MET em linhas de células SCLC do que em linhas celulares de NSCLC (Figura S7A). Observou-se no entanto uma expressão de proteína diminuíram de cMET em A549 e linhas celulares NCI-H1299 transf ectadas com NSCLC precursor de miR-34a (Figura 3A). Uma vez que a expressão em cMET NCI-H82 não era detectável, a expressão ectópica de miR-34a ou precursores de controlo não teve nenhum efeito sobre a expressão cMET, como esperado. Uma diminuição da expressão da proteína Bcl-2 foi observada nas células NCI-N592 transfectadas com precursor de miR-34a (Figura 3A). Como apenas o MAP2K1 mas não o gene MAP2K2 é alvo de miR-34a, não detectamos a expressão da proteína reduzida de MEK1 /2 em células transfectadas com precursor miR-34a; esta é presumivelmente devido ao redundantes papéis de MAP2K1 e 2. Transfecção de miR-34a precursor regulada negativamente a expressão de mRNA do gene AXL em A549 e as células NCI-H1299 NSCLC por mais do que 70% (alteração de delta CT Por mais do que 1,7), enquanto a expressão de ARNm do gene AXL em células NCI-H82 e NCI-N592 SCLC era demasiado baixo para ser detectado em tempo real por ensaio de PCR (Figura 3B). Em resumo, demonstrou-se que a expressão ectópica de miR-34a pode regular negativamente o miR-34a-alvo genes em células que expressam os alvos.
(A), a expressão da proteína de alvos de miR-34a em linhas celulares de cancro com transfectadas precursor de controlo (C) ou o precursor de miR-34a (M). expressão (B) ARNm do gene AXL em células cancerosas de controlo transfectadas com o precursor ou o precursor de miR-34a. O ARN foi recolhido 24 h após a transfecção. A expressão do gene em células NCI-H82 e NCI-N592 foram indetectáveis (UD).
Discussão
Aqui nós mostramos a expressão de 7 microRNAs associados ao câncer conhecidas na SCLC tumores e linhas celulares, bem como em linhas celulares de NSCLC. Observou-se que a expressão destes microRNAs não estava relacionado com características clínicas e evolução de pacientes SCLC. A expressão destes microARNs não estava relacionado com a sensibilidade de células SCLC a cisplatina ou etoposido. Além disso, a sobre-expressão ou infra-regulação de miR-34a não influenciou a viabilidade das células SCLC ou sensibilidade à cisplatina e etoposido. Nós ainda observado que a expressão de genes alvo miR-34a podem diferir entre SCLC e celulares NSCLC linhas.
Apesar de microRNAs têm sido amplamente estudada em vários tipos de câncer, existem apenas algumas publicações que abordam o papel de microRNA em o comportamento maligno das SCLC [20], [28], [29], [30]. Miko
et ai.
Expressão microARN comparação entre as linhas de células SCLC e tecido pulmonar livre de tumor de pacientes com doença pulmonar obstrutiva crónica [28]. Du
et ai.
Comparado o padrão de expressão entre microARN 9 SCLC e 7 linhas celulares de NSCLC, e uma linha de células de mesotelioma [20], e Guo
et ai.
Comparação uma linha de células de SCLC, NCI-H69, com a sua sub-linha resistente a doxorrubicina-[30]. Ranade
et al
relatou o único estudo utilizando amostras tumorais SCLC [29].; 16 microRNAs foram estudados para análise de sobrevida em 25 pacientes, e miR-92a-2 * foi identificado como um potencial marcador de prognóstico pobre.
Embora a expressão dos microRNAs 7 em nosso estudo foi avaliada em muitos tipos de cancro
in vitro
,
in vivo
, e em amostras de tumor, eles não foram avaliados antes em relação à sobrevida do paciente em SCLC. Embora nosso estudo é retrospectivo e o grupo de pacientes é pequeno, este é de longe o maior grupo de pacientes SCLC e recolha de linhas de células SCLC investigando expressão microRNA neste tipo de tumor. Em linha com o nosso relatório anterior, um teste post-hoc de um grande estudo prospectivo randomizado em NSCLC [18], a expressão dos microRNAs 7 não era prognóstico nem se correlacionam-se com o resultado do tratamento em pacientes com SCLC. Não podemos excluir a possibilidade de que outros do que os 7 microRNAs aqui apresentados microRNAs podem ser importantes para SCLC e, portanto, mais estudos pode ocorrer em SCLC para avaliar o valor prognóstico dos microRNAs não incluídos neste estudo.
miR- 34a é um microRNA supressor de tumor amplamente estudada que medeia a apoptose, ciclo celular, inibição da proliferação, senescência e inibição de invasão e migração em vários tipos de câncer (revisão por Hermeking
et al
. [31]). O efeito supressor de tumor de miR-34a sobre as células cancerosas, no entanto, pode ser do tipo específico de tumor; Considerando miR-34a down-regula o crescimento de IMR-90 de fibroblastos [8], bem como várias linhas de células NSCLC [23], Li
et al.
mostrou que a sobre-expressão de miR-34a faz nem afetar a proliferação celular, distribuição do ciclo celular, nem a apoptose numa linha celular de carcinoma hepatocelular [32], e Pang
et ai.
demonstraram que a sobre-expressão de miR-34a não tem nenhum efeito sobre a proliferação de linhas celulares de cancro do colo do útero HeLa e SiHa, bem como coriocarcinoma linha de células JAR [33]. miR-34a é um alvo directo da transcrição de p53 [8], e as mutações do gene TP53 foram encontradas em mais de 75% dos espécimes SCLC [16]. Uma tendência favorecendo menor expressão de miR-34a em linhas de células de SCLC em comparação com o tecido pulmonar livre de tumor tem sido observado anteriormente [28]. De acordo com a nossa constatação de que ectópica expressão de miR-34a não down-regular o crescimento celular ou induzir a apreensão do G1, expressão de miR-34a não se correlacionam com o estado da doença (Tabela S1) e progressão (Tabela 2) dos pacientes SCLC. Curiosamente, todas as linhas de células SCLC testados neste estudo expressaram baixo nível de cMET e Axl, dois genes alvo miR-34a. É plausível que o efeito de supressão do crescimento de miR-34a pode ser tecido- e específica da doença, possivelmente ditada pelo nível de expressão de miR-34a-intrínseca do gene alvo, em que as células com baixos níveis de expressão do gene alvo-miR-34a, tais como as células SCLC, pode tornar miR-34a funcionalmente impotentes.
Em conclusão, a expressão de 7 microRNAs associados ao câncer não se correlacionou com os resultados clínicos de doentes com CPPC. expressão de miR-34a também não foi relacionada com comportamento maligno das células cancerosas SCLC e é, portanto, pouco provável que seja um alvo terapêutico candidato para esta doença.
Materiais e Métodos
Pacientes e ética declaração
Trinta e um formol fixa, (FFPE) amostras de tumores embebidos em parafina de pacientes que foram incluídos em um estudo de fase III do grupo norte-Holland Oncology [22] foram obtidos a partir do Centro Médico da Universidade VU, Amesterdão, Países Baixos , após a aprovação do Conselho de revisão Institucional [22]. consentimentos informados por escrito foram obtidas de todos os participantes.
As linhas celulares
Um painel de 14 CPPC e 26 linhagens de células NSCLC foram estudados e estão listados na Materiais S1. Todas as linhas celulares de cancro foram mantidas em RPMI-1640, suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS), com a excepção de NCI-H792, que foi mantida em DMEM suplementado com FBS a 10%. A mutação do gene TP53 em linhas celulares foi determinada através de pesquisa na web site p53 (https://p53.free.fr/), o banco de dados IARC TP53 (https://www-p53.iarc.fr/), eo COSMIC banco de dados (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/).
RNA extração
o RNA total foi extraído de amostras de FFPE utilizando o isolamento RECOVERALL total ácido nucleico kit (Ambion, Austin, TX) e o ARN total a partir de linhas de células foi extraído com Trizol reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA), em conformidade com as instruções do fabricante.
quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR)
a expressão de miRNAs maduros, incluindo miR-21, miR-29b, miR-34a /b /c, miR-155, e deixe-7A, foi avaliada por análise de qRT-PCR, como descrito anteriormente [18] . RNU6B snRNA foi usado como um controle endógeno. Cada ensaio microARN foi realizado em triplicado. Expressão de microRNAs foi relatado como delta valor Ct (valor de Ct de RNU6B – valor Ct da meta microRNA). Definiu-se os grupos de tumores ou células com expressão elevada ou baixa com base no valor mediano de cada expressão microARN.
Expressão do gene AXL foi realizada usando ensaio de expressão de genes Taqman (Applied Biosystems) e foi classificado como delta valor Ct. gene GAPDH foi usada como controlo endógena.
A transfecção de microRNA precursoras ou inibidores
precursor de miR-34a e do inibidor, bem como de controlo marcado com Cy3 miR precursor e inibidor foram adquiridos da Ambion. Transfecção de miR-precursor ou inibidor foi realizada utilizando siPORT ™
NeoFX
™ transfecção Agent (Ambion), seguindo recomendação do fabricante a uma concentração oligonucleotídeo final de 30 nM.
O crescimento celular análise
Para determinar o efeito da transfecção de células em crescimento, 5.000-10.000 células transfectadas com o precursor microARN indicado ou inibidor foram plaqueadas em placas de 96 poços. O crescimento celular foi determinado por CellTiter 96 AQueousOne solução de células Ensaio de Proliferação (Promega Corp. Madison, WI) a cada 24 horas, durante 5 dias consecutivos. Os resultados foram apresentados como a densidade óptica (valor de DO) a 490 nm de absorvância.
transfectin repetitiva de células
N592
100.000 células NCI-N592 SCLC foram plaqueadas em placas de 24 cavidades e foram transfectadas, com o miR -34a precursor ou o precursor de controlo. As células foram colhidas, contadas e novamente transfectados com os respectivos miARNs a cada 72 horas.
ensaios de inibição do crescimento
cisplatina e etopósido foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MI). 10.000 células foram semeadas em placas de 96 poços de fundo plano, transfectadas com percursor ou inibidor indicado microARNs, cultivadas durante 24 horas antes da adição de várias concentrações de cisplatina e etoposido, e incubou-se durante uma 72 horas adicionais. Os efeitos citotóxicos da cisplatina e etopósido foram determinados por CellTiter 96 AQueousOne solução de células Ensaio de Proliferação. As experiências foram realizadas em triplicado. Determinou-se a percentagem de viabilidade celular foi determinada dividindo-se os valores de absorvância de células tratadas com as das células não tratadas, e a concentração de cisplatina ou etoposido resultante na inibição de crescimento de 50% (IC
50).
imunohistoquímica estudo
estudo imuno-histoquímica de p53 e Bcl-2 em tumores SCLC foram realizados e relatado anteriormente [22].
Western blot
células NCI-N592 e A549 transfectada com o precursor de miR-34a ou o controlo de precursores foram incubadas durante 48 horas. As células foram colhidas, foram preparados lisados, e por Western blot foi realizada tal como descrito previamente [34]. Os anticorpos foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (actina), Santa Cruz Biotechnology Inc (c-Met), Cell tecnologia de sinalização (MEK1 /2), e da Dako (Bcl-2). As intensidades de c-Met e Bcl-2 foram avaliados usando o software GeneTools (SynGene), normalizados pela intensidade da actina, e calibrado para o nível de expressão em células A549 e NCI-H146, respectivamente.
ciclo celular a análise por citometria de fluxo
48 horas após a transfecção, as células foram recolhidas, lavadas com PBS frio, fixadas com etanol frio a 70% em PBS durante pelo menos 24 horas, e marcadas com iodeto de propidio antes da contagem de células. Após a coloração, as células foram contadas utilizando o software FACScalibur Pro Cellquest (Becton Dickinson and Company, Frankin Lakes, NJ). fracções do ciclo celular foram analisados utilizando o software v3.0 Modfit.
In situ
hibridação de microRNAs
In situ
hibridação de miR-34b foi realizada como descrito anteriormente [18]. U6 ARN Nucleolar foi utilizado como controle positivo.
A análise estatística
A análise estatística foi realizada usando SPSS versão 17.0 (SPSS, Chicago, IL). A sobrevida foi calculada pelo método de Kaplan-Meier. A comparação da sobrevivência entre os diferentes grupos foi determinada pelo teste de log-rank. As diferenças na expressão microARN entre os grupos foram analisadas pelo teste de Wilcoxon Rank-Sum. A correlação entre a sensibilidade de drogas e expressão microRNA foi analisada por Spearman. Comparação da sensibilidade ao fármaco das células transfectadas com vários oligonucleótidos foi efectuada por análise unidireccional de variâncias (ANOVA unidireccional). Todos os valores de p foram bi-laterais e valores de p inferior a 0,05 foi considerado significativo.
Informações de Apoio
Figura S1.
expressão de microRNAs em SCLC contra em linhas celulares de NSCLC. Um valor Ct delta de -15 indica que a expressão do microRNA na célula é demasiado baixa para ser detectada
doi:. 10.1371 /journal.pone.0021300.s001
(TIF)
Figura S2.
in situ
hibridação de microRNAs em um tumor SCLC. U6 ARN nucleolar e miR-34b foram detectadas utilizando um sistema baseado no tiramida biotinil com Vector NovaRed como substrato (castanho). As amostras para controlo negativo corrida e miR-34b foram co-coradas com hematoxilina de Mayer (azul)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0021300.s002
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Figura S3.
Correlação de expressão de p53 e (A) de miR-34a, (B) o miR-34b, e (C) o miR-34c, e (D) correlação da expressão de miR-34a e Bcl-2. Expressão de p53 e BCL-2 foram apresentados como percentagem de células coradas por imuno-histoquímica. coeficiente de correlação (r) e valor de p foram determinados pelo método Spearman
doi:. 10.1371 /journal.pone.0021300.s003
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Figura S4.
celular NCI-H82 transfectadas com inibidor microARN (A) etiquetado com Cy3 e (B) Cy3 marcado precursor microARN.
doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s004
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Figura S5. Ensaio de crescimento celular
de células NCI-H1299 NSCLC transfectadas com miR-34a ou o precursor de controlo. As barras de erro referem-se a desvios padrão
doi:. 10.1371 /journal.pone.0021300.s005
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Figura S6. ensaio de inibição
crescimento das células GLC4 tratados com (A) e cisplatina (B) de etoposido. As células foram transfectadas com os oligonucleótidos indicados. As barras de erro indicam o desvio padrão de ensaios em triplicado
doi:. 10.1371 /journal.pone.0021300.s006
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Figura S7. A expressão proteica
de c-Met e Bcl-2 em 5 SCLC e 3 linhas celulares de NSCLC. (B) A correlação entre o miR-34a e a expressão de c-MET, bem como a Bcl-2 em 5 linhas de células SCLC.
doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s007
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Tabela S1.
MicroRNAs e co-variáveis clínicas.
doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s008
(DOC)
Tabela S2.
Efeito da co-variáveis clínicas na sobrevivência livre de progressão (PFS).
doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s009
(DOC)
Tabela S3.
Efeito de expressão microRNA na sobrevivência livre de progressão (PFS, semanas) em doentes com CPPC estratificados por doença limitada ou doença extensa.
doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s010
(DOC)
Tabela S4. estatuto
TP53 e expressão de miR-34a em linhas de células SCLC.
doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s011
(DOC)
Materiais S1. linhas celulares
câncer.
doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s012
(DOC)