Abstract

Introdução

ROBO1 é uma proteína da membrana que contribui para a metástase do tumor e angiogênese. Nós relatado anteriormente que

anticorpo monoclonal anti-ROBO1 marcado com 90Y (

90Y-anti-IgG ROBO1) mostrou um efeito antitumoral contra tumores Robo1-positiva. Neste estudo, foi realizado um estudo de biodistribuição e radioimunoterapia (RIT) contra modelos Robo1-positivo câncer de pulmão de pequenas células (CPPC).

Métodos

Para o estudo biodistribuição,

111In- anticorpo monoclonal anti-ROBO1 marcado (

111In-anti-IgG ROBO1) foi injectada em ratinhos xenoenxerto SCLC Robo1-positiva através da veia da cauda. Para avaliar os efeitos antitumorais, um estudo RIT foi realizada, e os ratos de xenotransplante SCLC foram tratados com

90Y-anti-IgG ROBO1. O volume do tumor e peso corporal foram medidos periodicamente ao longo das experiências. Os tumores e órgãos de ratos foram então recolhidas, e uma análise patológica foi realizada.

Resultados

Como um resultado do estudo de biodistribuição, observou-se a absorção do tumor de

111In-anti -ROBO1 IgG. O fígado, rim, baço e pulmão mostraram comparativamente elevada acumulação de

111In marcado com anti-ROBO1. No estudo RIT,

90Y-anti-IgG ROBO1 reduziu significativamente o volume do tumor em comparação com os valores basais. análises patológicos de tumores revelou necrose de coagulação e degeneração fatal de células de tumor, redução significativa do número de células-Ki-67 positivo, e um aumento no número de células apoptóticas. Observou-se uma redução transitória de células hematopoiéticas no baço, esterno, e fêmur.

Conclusões

Estes resultados sugerem que RIT com

90Y-ROBO1 anti-IgG é um tratamento promissor para ROBO1 positivo SCLC

Citation:. Fujiwara K, Koyama K, Suga K, Ikemura M, Saito Y, Hino A, et al. (2015)

Anti-ROBO1 Anticorpo Monoclonal Exposições antitumoral Atividade contra pequenas células Lung Cancer xenoenxertos marcado com 90Y. PLoS ONE 10 (5): e0125468. doi: 10.1371 /journal.pone.0125468

Editor do Academic: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, United States |

Recebido: 06 de outubro de 2014; Aceito: 24 de março de 2015; Publicado em: 27 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Fujiwara et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) através do “Programa de Financiamento para o World-líder inovador R D de Ciência e Tecnologia (primeiro programa) “, iniciado pelo Conselho de política científica e Tecnológica (CSTP). Os co-autores Yasutaka Saito, Akihiro Hino e Hiroyuki Kasahara são empregados pela FUJIFILM RI Pharma Co., Ltd. FUJIFILM RI Pharma Co., Ltd. juntou a este estudo como uma empresa colaborando na Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência através do “Financiamento programa de Innovative amp líder Mundial I . D de Ciência e Tecnologia “foi responsável pela marcação radioactiva de anticorpos. Co-autor Kosuke Suga é empregado pela Sankyo LABO SERVICE Co., Ltd. SANKYO LABO SERVICE Co., Ltd. forneceu apoio sob a forma de salário por autor KS, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. O papel específico deste autor é articulada na seção “autor contribuições ‘

CONFLITO DE INTERESSES:. Os autores têm as seguintes participações: Co-autor Kosuke Suga é empregado pela Sankyo LABO SERVICE Co., Ltd. Co- autores Yasutaka Saito, Akihiro Hino e Hiroyuki Kasahara são empregados pela FUJIFILM RI Pharma Co., Ltd. FUJIFILM RI Pharma Co., Ltd. juntou a este estudo como uma empresa colaborando na sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência através do “Programa de Financiamento para -líder mundial inovadora R . D de Ciência e Tecnologia “foi responsável pela marcação radioactiva de anticorpos. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) constitui aproximadamente 15% de todos os casos de câncer de pulmão e apresenta uma alta taxa de crescimento e desenvolvimento precoce de metástases generalizadas. Assim, a maioria dos pacientes com CPPC têm metástases hematogênicas no diagnóstico inicial [1, 2]. Desde SCLC é altamente sensível à quimioterapia inicial e radioterapia, estes métodos são geralmente usados ​​para tratar SCLC [1, 3]; No entanto, o prognóstico de pacientes com SCLC é pobre. A taxa de sobrevivência de 2 anos para os pacientes com doença em estágio limitado é de 20-40%, enquanto a taxa de sobrevivência de 2 anos para pacientes com doença avançada é de apenas 5%, porque a doença avançada é normalmente tratada com quimioterapia sozinha [2]. Por conseguinte, é necessário o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes para SCLC tanto doença limitada e doença extensa-fase (e lesões primárias metástases).

radioimunoterapia (RIT) é um tipo de radioterapia utilizando anticorpos monoclonais específicos de tumor radiomarcado anticorpo [4-6]. Embora os tratamentos RIT Zevalin e Bexxar têm sido utilizados com sucesso para tratar linfomas não-Hodgkin recidiva ou refractário, o sucesso da RIT como tratamento para tumores sólidos tem sido limitada. Isto é devido tanto à radiorresistência de tumores sólidos e a incapacidade para administrar uma dose suficiente para tumores volumosos sem causar toxicidade da medula óssea [4, 7]. Recentemente, Yoshida et ai. relataram que RIT mostra a eficácia terapêutica significativa para xenoenxertos de SCLC [8]. O ensaio clínico de anticorpo anti-ACE em radioimunoterapia SCLC foi iniciado [3]. SCLC tem alta radiossensibilidade, embora seja provável que se torne metastático. RIT pode atacar ambos cancro primário e metastático porque RIT agente é entregue a todas as partes do corpo através da circulação sanguínea. Estes sugerem que RIT tem o potencial para se tornar um tratamento eficaz para a SCLC.

O homólogo humano do

Drosophila

gene Roundabout,

ROBO1

, é uma proteína de membrana e uma receptor de Slit2 [9]. interações Slit2-Robo1 mediar sugestões repulsivas em axônios e cones de crescimento durante o desenvolvimento neural [9, 10]. Tem sido relatado que ROBO1 contribui para a metástase tumoral e angiogénese [11-13]. Nós anteriormente realizado um estudo RIT no carcinoma hepatocelular (HCC) visando o antigénio ROBO1 [14]. A administração de

marcado com 90Y anti-IgG ROBO1 (

90Y-anti-IgG ROBO1) mostrou efeitos antitumorais significativos, tais como a supressão do crescimento de tumores em xenoenxertos de carcinoma hepatocelular Robo1-positiva. No entanto, não se observou diminuição do tumor, talvez devido à radiorresistência do HCC. Por isso, determinamos que um tumor mais radiossensíveis do que HCC seria um alvo terapêutico adequado para

90Y-ROBO1 anti-IgG. SCLC tem uma elevada sensibilidade à radiação em comparação com o HCC. Xian et ai. relataram a expressão de ROBO1 na linha de células SCLC humano NCI-H69 [15]. Por isso, selecionamos o modelo SCLC usando linha celular NCI-H69 como um alvo terapêutico mais eficaz para uso no presente estudo.

Neste estudo, nós investigamos a farmacocinética de um

111In marcado anti- ROBO1 IgG (

111In-anti-ROBO1 IgG) em um estudo de biodistribuição usando ratos de xenotransplante SCLC. Além disso, foi realizada utilizando um RIT

90Y-anti-IgG ROBO1, e o efeito antitumoral e danos aos órgãos foram avaliados por análise patológica.

Materiais e Métodos

cultura celular e modelos animais

A linha de células SCLC NCI-positivas ROBO1-H69 (ATCC HTB-119) foi obtido da American Type Culture Collection [15]. /c ratinhos nus macho BALB (5 semanas de idade) foram adquiridos a Clea Japan, Inc. (Tóquio, Japão). as células NCI-H69 foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 10% (v /v) de soro fetal de bovino a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2. Para os modelos animais portadores de tumor NCI-H69, NCI-H69 de células (2 x 10

6), num volume de 200 uL, foram inoculados subcutaneamente nos flancos direitos de ratinhos macho BALB /c nus. Os ratinhos foram depois analisados ​​4 semanas após a inoculação. Os ratinhos foram sacrificados por remoção de sangue sob anestesia com isoflurano. Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animal da Universidade de Tóquio (número aprovado: P10-017).

foi gerado anticorpos

O anticorpo monoclonal contra ROBO1 humana como descrito anteriormente [16] . Anti-IgG é um ROBO1 IgG2b murina. Ele reconhece ROBO1 humana e não reagem de forma cruzada com ROBO1 murino. Para a análise imuno-histoquímica (IHQ), utilizou-se anti-IgG ROBO1 A7241A (A7241A) [16]. Para a citometria de fluxo, foi usado o estudo de biodistribuição e o estudo RIT, anti-IgG ROBO1 B5209B (B5209B) [14]. Um controle negativo, IgG 3423 (Instituto de Imunologia, Tóquio, Japão), foi utilizado em citometria de fluxo. Este anticorpo monoclonal reage especificamente com o antigénio de superfície da hepatite B [17]. Além disso, ele não reage com as proteínas da membrana humanos.

A citometria de fluxo e IHC

A especificidade para o antigénio B5209B ROBO1 foi avaliada utilizando citometria de fluxo. as células NCI-H69 foram incubadas com B5209B ou uma IgG de controlo negativo 3423 durante 1 hora a uma concentração de 0,3 ug /ml em tampão de diluição (BSA a 1%, EDTA 0,1 mM em PBS). Simultaneamente, para demonstrar a especificidade da B5209B, experiências de bloqueio foram realizadas por adição de ROBO1 solúvel a uma concentração de 100 ug /ml. As células foram então lavadas duas vezes com tampão de diluição e feito reagir com R-ficoeritrina conjugada com anti-IgG de ratinho (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, EUA), diluída a 1: 200 com tampão de diluição. Finalmente, as células foram lavadas duas vezes com tampão de diluição e analisadas por citometria de fluxo (GOIABA EasyCyteTM Além disso System; Millipore, Billerica, MA, EUA).

A expressão de ROBO1 em xenoenxertos NCI-H69 foi avaliada utilizando IHC. amostras de tecido do tumor NCI-H69 foram fixadas em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 ° C. Eles foram embebidos em parafina e obtiveram-se secções de 3-5 um de espessura. As secções de tecido foram desparafinados e reidratadas. A recuperação de antígenos foi realizada em 10 mM de Tris-EDTA 1 mM (pH 9,0) numa panela de pressão durante 20 minutos. A peroxidase endógena foi extinta com 0,3% de peróxido de hidrogénio-metanol durante 30 min, e, em seguida, as amostras foram bloqueadas com soro de cabra normal a 5% durante 1 hora. As amostras foram incubadas com A7241A (10 ug /ml) durante a noite a 4 ° C e depois tratou-se com um anticorpo secundário (simples mancha MAX-PO; Nichirei, Tóquio, Japão) à temperatura ambiente durante 30 min. Para visualizar a actividade da peroxidase, 0,2 mg /ml de 3,3′-diaminobenzidina (DAB; Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japão) foi utilizado como o substrato em tampão de 0,05 M de Tris-HCl (pH 7,6) contendo 0,01% H

2O

2. coloração nuclear foi realizada com hematoxilina.

A marcação radioactiva

Nós compramos 1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecano-1, 4, 7, ácido 10-tetra-acético (DOTA) a partir Macrocyclics (Dallas, TX, EUA),

111InCl

3 foi obtido a partir de Nordion, Inc. (Vancouver, Canada), e

90YCl

3 foi obtido a partir de Eckert e Ziegler (Braunschweig, Alemanha).

B5209B foi conjugado com DOTA e radiomarcado com

111In e

90Y como descrito anteriormente [14]. Nós relatamos que a fracção imunorreactiva de radiomarcado B5209B não prejudica a conjugação com B5209B intacta [14].

Biodistribuição estudo

NCI-H69 xenotransplante (300,7 ± 125 milímetros

3) ratos foram aleatoriamente divididos em 5 grupos (n = 3 por grupo). Cada rato foi injectado com 40? Ci de

111In-B5209B (80? G) através da veia da cauda. Os ratos foram sacrificados aos 6, 24, 48, 72 e 144 h após a injecção. Sangue, coração, pulmão, fígado, rim, baço, estômago, intestino, músculo, osso femoral, esterno, e tumor foram recolhidos, pesados ​​e medidos por radioactividade. A percentagem de dose injectada por grama de tecido (% ID /g) foi calculada para cada órgão.

A dose absorvida tumor para

90Y-B5209B foi estimada a partir dos dados de biodistribuição de

111In- B5209B. acumulação tumoral em vários pontos tomo foram representados graficamente contra o tempo, a partir da qual foi calculada a área sob a curva (AUC). dose absorvida tumor foi estimado com base em um modelo de rato dosimetria MIRD de estilo [18]. A dose absorvida em órgãos em um homem de referência de 70 kg foi estimada a partir de nossos dados biodistrubution usando programa de computador MIRDOSE3 [19].

Estudo terapêutico

ratinhos de xenotransplante NCI-H69 foram divididos aleatoriamente em dois grupos (n = 3 por grupo). Os ratinhos foram injectados através da veia da cauda, ​​com solução salina ou 200 uCi de

90Y-B5209B (70 ug). Os volumes tumorais para o

grupos 90Y-B5209B controle e foram 310,5 ± 128,6 milímetros

3 e 273,5 ± 153,6 milímetros

3, respectivamente. O volume de tumor e peso corporal foram medidos duas vezes por semana durante 4 semanas após a injecção. O volume do tumor foi calculado utilizando a seguinte fórmula: 0,5 ×

2 × (diâmetro mais longo) (menor diâmetro). O crescimento do tumor (%) foi calculada utilizando a fórmula: (volume do tumor em cada ponto de tempo) /(volume do tumor no dia 0) x 100. Os ratinhos foram sacrificados quando o tamanho do tumor era 1.500 mm

3 ou peso corporal diminuiu em 20% do peso inicial.

estudo patológico

ratinhos de xenotransplante NCI-H69 foram divididos aleatoriamente em 5 grupos (n = 3 por grupo). Os ratinhos foram injectados através da veia da cauda com 200 uCi de

90Y-B5209B. Os ratinhos foram sacrificados nos dias 0, 7, 14, 21, e 28 após a injecção, e em seguida as amostras de tecido de tumor NCI-H69, fígado, rim, pulmão, coração, intestino delgado, baço, pâncreas, esterno, e fémur foram obtidos a partir de os ratinhos.

Todas as amostras foram fixadas em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 ° C. Eles foram embebidos em parafina e obtiveram-se secções espessas 3-5 mícrons. O esterno e fêmur foram descalcificadas antes de inclusão em parafina. seções de slides, excluindo o osso femoral e esterno, foram desparafinados, desidratados, e corados com hematoxilina e eosina. seções ósseas e esterno femorais foram coradas com solução de Giemsa.

desoxinucleotidil Terminal mediada-transferase dUTP nick rotulagem final (TUNEL) e Ki-67 coloração foram realizados em seções NCI-H69 para investigar o estado da apoptose tumorais e células proliferação, respectivamente.

a apoptose foi detectada utilizando peroxidase ApopTag Além disso In Situ a apoptose kit de detecção (Chemicon International, Inc., Billerica, MA), conforme as instruções do fabricante.

Ki-67 de coloração foi realizada como previamente descrito [14].

apoptótica e células proliferativas foram quantificados por determinação da percentagem de células TUNEL- e Ki-67-positivas, respectivamente, como previamente descrito [14].

estatística análise

os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. As médias foram comparadas usando o Student

t

-teste. Os valores de p de 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

A especificidade do B5209B para ROBO1 antígeno

células NCI-H69 exibiu intensidades de fluorescência média de 35,29 e 7,80 com B5209B e controle negativo IgG 3423, respectivamente (Figura 1A e 1B). A ligação de B5209B foi inibida pela adição de ROBO1 solúvel.

(a) Fluxo de análise de citometria com B5209B (histograma cheio) na linha celular NCI-H69. Os histogramas em branco indicam as experiências de bloqueio que se usaram ROBO1 solúvel. (B) Análise de fluxo de citometria com IgG 3423 (histograma preenchido). Os histogramas em branco indicam as experiências de bloqueio que se usaram ROBO1 solúvel. (C) análise de imuno-histoquímica de ROBO1 com A7241A em NCI-H69 xenotransplante. (Barra de escala = 100 mm).

expressão ROBO1 em xenoenxertos NCI-H69

A expressão de ROBO1 em xenotransplantes NCI-H69 foi confirmada por IHC utilizando A7241A. A coloração com A7241A foi observado nas membranas celulares, como ROBO1 é expressa sobre a superfície celular (Figura 1C).

Biodistribuição estudo

O estudo de biodistribuição usando

111In-B5209B foi realizada utilizando murganhos de xenoenxerto NCI-H69 (Fig 2). A absorção do tumor de

111In-B5209B foi de 3,46 ± 0,3%, 6,42 ± 0,5%, 5,70 ± 2,5%, 9,37 ± 2,0% e 10,1 ± 1,3% ID /g a 6, 24, 48, 72, e 144 h após injecção, respectivamente. A captação tumoral máxima de

111In-B5209B ocorreu em 144 h após a injecção. Alta retenção de traçador no sangue foi observada com 19,2 ± 2,1% ID /g a 6 h, mas esta diminuiu para 6,55 ± 0,5% ID /g a 144 h.

111In-B5209B mostraram alta absorção no fígado, rim, baço e com 5,78 ± 0,9%, 4,73 ± 0,4%, e 5,13 ± 0,4% ID /g a 144 h, respectivamente.

Os resultados representam as percentagens calculadas de dose injectada por grama de tecido (% ID /g).

a dose absorvida por tumores tratados com 200 uCi de

90Y-B5209B foi estimado em 10,5 Gy. As doses absorvidas pelo fígado, rim, baço, e medula óssea foram estimados dos seus dados de biodistribuição para ser 2,1 mGy /MBq, 3,8 mGy /MBq, 1,3 mGy /MBq, e 0,4 mGy /MBq, respectivamente, dentro de 70 kg assunto referência do sexo masculino para

90Y-B5209B.

estudo RIT

A eficácia terapêutica do

90Y-B5209B foi investigada em ratos de xenotransplante NCI-H69 (Fig 3a). Os tumores no grupo de solução salina demonstrou um crescimento rápido. Um rato no grupo solução salina foi sacrificado no dia 20 porque o volume do tumor atingiu 1.500 mm

3. Na

grupo 90Y-B5209B, o volume do tumor diminuiu para 19,3 ± 6,1% no dia 13 em comparação com o volume original no dia 0. O volume do tumor mostraram diferenças significativas entre os grupos de dia 9 em diante (p 0,01), embora nenhum foi observada diferença significativa no dia 0, 2 ou 6. regrowth do tumor foi observada no dia 20.

(a) curva de crescimento do tumor, (b) o peso corporal de ratos de xenotransplante NCI-H69 média (praça aberta, salina; triângulos negros,

90Y-B5209B). ** P 0,01 (t de Student).

peso corporal do animal foi medida após a injecção (Fig 3b). Embora o peso corporal médio diminuiu para 89,5 ± 4,7% do valor original no

grupo 90Y-B5209B, essa alteração foi transitória. Os ratinhos no grupo de soro fisiológico não mostrou qualquer redução significativa do peso corporal. No dia 6, o peso corporal diferiu significativamente entre o grupo da solução salina e o

grupo 90Y-B5209B (p 0,01). No dia 9, o peso corporal não apresentaram diferença significativa entre os dois grupos.

análise patológica

Em seguida, avaliamos o efeito antitumoral por análise patológica. No dia 0, as células tumorais apresentaram crescimento sólido associado com estroma fibroso hialinizado (Figura 4a)

(a) do tumor NCI-H69, no dia 0, ampliação original × 400.; (B) do tumor NCI-H69 no dia 7, ampliação original 400 ×; (C) do tumor NCI-H69, no dia 0, ampliação original 400 ×; (D) do tumor NCI-H69, no dia 0, ampliação original 400 ×; (E) do tumor NCI-H69, no dia 0, ampliação original × 400. barra de escala = 100 pm.

No dia 7, observou-se necrose massiva de coagulação, as células apoptóticas, e degeneração de células, definido pela corpo celular inchaço, inchaço nuclear celular, e compactação da cromatina (Fig 4b).

no dia 14, além de necrose de coagulação e degeneração celular, observamos também a agregação histiocyte e fibrose em regiões necróticas (Fig 4C).

No dia 21, as regiões necróticas não foram observadas, enquanto que a agregação histiocyte e fibrose foram observados (Fig 4d). Embora o número de células em degeneração diminuiu em comparação com o dia 14, nós ainda observamos muitas células em degeneração.

No dia 28, poucas células em degeneração foram observados (Fig 4e). As características do corpo da célula e do núcleo, tais como forma e tamanho, não foram alteradas e pareciam ser os mesmos que os observados no dia 0.

S1 figura mostra o Ki-67 e coloração TUNEL. A percentagem de células Ki-67-positivas no dia 7 diminuiu significativamente (27,2 ± 3,4%) em comparação com o dia 0 (55,0 ± 13,9%, p 0,01; Figura 5). A percentagem de células positivas TÚNEL nos dias 7 aumentaram significativamente (8,83 ± 1,2%) em comparação com o dia 0 (4,46 ± 1,1%; P 0,01; Figura 5)

Ki-67:. Razão de Ki células -67-positivos; TUNEL: proporção de células positivas TUNEL. * P 0,01 (t-teste dos alunos).

Sem alterações patológicas aparentes foram observadas nos órgãos normais, excluindo o baço, esterno, fêmur, e fígado.

No dia 7, do baço mostrou um decréscimo nos números de ambas as células hematopoiéticas na polpa vermelha e linfócitos na polpa branca (Figura 6a). No dia 14, ilhas regenerativos, composto por uma mistura de eritroblastos e células granulocíticas, foram observados na polpa vermelha do baço. Na polpa branca do baço, a densidade celular de linfócitos foi na mesma gama que a observada no dia 7. No dia 21, as células hematopoiéticas, incluindo eritoblastos, granulócitos, megacariócitos e, foram significativamente aumentadas na polpa vermelha do baço . Além disso, foi observado um ligeiro aumento dos linfócitos na polpa branca. No dia 28, a densidade celular de células hematopoiéticas pareceu ser a mesma que a observada no dia 0 na polpa vermelha do baço, e os linfócitos foram significativamente aumentados na polpa branca.

(a), Baço, ampliação original × 400, barra de escala = 100 mm. (B) Esterno, ampliação original × 400, barra de escala = 100 mm. (C) Femur, ampliação original × 400, barra de escala = 100 mm. (D) Fígado, ampliação original × 400, barra de escala = 100 mm.

Nós, então, realizada a coloração Giemsa do esterno e do fêmur (Fig 6b e 6c). No dia 7, a medula óssea do esterno mostrou uma notável diminuição do número de células hematopoiéticas. granulócitos maduros fez-se a grande maioria das células hematopoiéticas restantes. Na medula óssea femoral, observou-se uma pequena diminuição no número de megacariócitos, enquanto não houve decréscimo aparente na números de eritroblastos e granulócitos. Os danos para a medula óssea do fémur foi suave em comparação com a observada na medula óssea do esterno. No dia 14, ilhas de regeneração foram observados na medula óssea do esterno, e alguns megacariócitos estavam presentes. A medula óssea femoral exibiram um aumento em megacariócitos, e a densidade celular de células hematopoiéticas pareceu ser a mesma que a observada no dia 0. No dia 21, a medula óssea do esterno mostrou um aumento significativo do número de células hematopoiéticas. No dia 28, a densidade celular de células hematopoiéticas na medula óssea do esterno pareceu ser a mesma que a observada no dia 0.

No dia 7, balão de números de hepatócitos foi observada no fígado (Fig 6d) , enquanto que este não foi visto no dia 14. Além disso, as características de hepatócitos pareciam ser os mesmos que os observados no dia 0.

Discussão

este estudo é o primeiro a demonstrar que

111In-B5209B acumula dentro xenotransplantes NCI-H69, e

90Y-B5209B tem efeitos significativos antitumorais contra xenotransplantes NCI-H69.

para avaliar a especificidade de B5209B para ROBO1, foi realizado um estudo de bloqueio utilizando citometria de fluxo. A ligação de B5209B foi inibida pela adição de ROBO1 solúvel, embora o mesmo tratamento não inibem a ligação de IgG de 3423. Portanto, B5209B reconhece especificamente o antigénio ROBO1.

usada

111In-anti-ROBO1 quanto um substituto biodistribuição de prever comportamentos in vivo de

90Y-anti-ROBO1; esta era, pois foi relatado que

111In e

marcado com 90Y anticorpos, proteínas e peptídeos são equivalentes biologicamente, no que diz respeito à sua absorção em tumores e outros órgãos importantes [20].

B5209B confirmou que tem especificidade para o antigénio ROBO1. Além disso, a absorção de

111In-B5209B em NCI-H69 aumentou gradualmente ao longo do tempo, e o consumo máximo por tumores foi de 10,1 ± 1,3% ID /g a 144 h. A absorção de radiomarcador para os órgãos normais que não expressam ROBO1, tais como fígado, rim e baço, mostraram relativamente alta de acumulação. No entanto, a captação de cada órgão seja diminuído gradualmente ao longo do tempo ou manteve-se constante. Estes comportamentos de absorção diferiu da absorção observada em tumores. Portanto, os resultados do nosso estudo suportam bloqueio e biodistribuição que

111In-B5209B visa especificamente ROBO1. Espera-se que

90Y-B5209B iria acumular em xenoenxertos NCI-H69, devido a afinidade de ligação semelhante [14]

.

Embora

111In-B5209B mostrou relativamente elevada acumulação no fígado, rim, e baço, a especificidade de ligação de

111In-B5209B não pode explicar essa alta acumulação, porque esses órgãos não expressam ROBO1 [16]. Este fenómeno pode ser explicado pela presença de resíduo

111In-B5209B no sangue e Fcy ou a absorção mediada por receptor FcRn pelas células endoteliais nestes órgãos [21, 22].

injectados 200 uCi de

90Y-B5209B em ratos de xenotransplante NCI-H69, e o volume do tumor de xenoenxertos NCI-H69 diminuiu significativamente após o tratamento com

90Y-B5209B. Após

90Y-administração B5209B, foram observadas mudanças patológicas no tumor, incluindo a degeneração celular, necrose de coagulação, um aumento de células apoptóticas, e uma diminuição de células Ki-67-positivas. Estas alterações são alterações patológicas comuns em tecidos tumorais tratadas. Assim, estes resultados sugerem que

90Y-B5209B possui efeitos significativos antitumorais quando usado em RIT.

Infelizmente, observamos rebrota tumor no dia 20 no

grupo 90Y-B5209B. No estudo patológico, diminuição da degeneração celular foi observada desde o dia 21 ao dia 28. Não houve região necrótico no dia 21, apesar de a agregação histiócitos e fibrose foi observada nesse momento, e estas são as respostas imunitárias a células necróticas. Histiócitos ingerir células necróticas, e fibroblastos reparar naquela região. Além disso, as características morfológicas dos organismos celulares e os núcleos no dia 28 pareceu ser o mesmo que os observados no dia 0. Estes resultados sugerem que os efeitos anti-tumorais de RIT diminuiu no dia 21. Para atingir a remissão completa ou sobrevivência prolongada utilizando

90Y-B5209B, melhoramento ou extensão desses efeitos antitumorais é necessário. terapia de combinação com RIT, quimioterapia e poli ADP ribose polimerase resultados inibidor em sobrevivência prolongada em comparação com cada terapia sozinha [23, 24]; Portanto, a terapia de combinação tem um potencial para produzir actividade anti-tumor mais eficazes. O uso de longo meia nuclide vida pode alcançar a melhoria dos efeitos terapêuticos.

90Y é uma β terapêutica útil

– emissor que tem alta energia máxima (2,3 MeV) e um de longo alcance (tecido de penetração máxima 11 mm) [25]. No entanto, a sua meia-vida é relativamente curta (2,7 dias). Comparado com

90Y,

177Lu inferior tem o máximo de energia (0,5 MeV) e um alcance mais curto (no máximo 1,6 milímetros penetração nos tecidos), mas tem uma meia-vida mais longa (6,7 dias) [26]. Assim, o uso de

177Lu pode prorrogar o período de efeitos antitumorais e limitar os danos aos órgãos por causa de seu curto alcance. Além disso, tem sido relatado que

177Lu RIT é mais eficaz do que com

RIT 90Y no tratamento de lesões pequenas ( 1,000 mm

3) [27, 28].

177Lu RIT pode ser mais eficaz para os relativamente pequenos tumores que foram utilizados neste estudo

.

Yoshida et al. relataram sobre o efeito de radioimunoterapia utilizando o

90Y anticorpo anti-c-kit para SCLC [8]. A

90Y anticorpo anti-c-kit alcançada uma resposta terapêutica completa para xenoenxertos de SCLC. Os dois estudos diferiu em várias maneiras, tais como a proteína alvo, o anticorpo utilizado e o volume do tumor. O volume do tumor utilizado em nosso estudo (273,5 ± 153,6 milímetros

3) foi mais de 50 vezes maior do que o volume do tumor usado in2 seu estudo (4,4 ± 3,2 milímetros

3). A diferença do volume do tumor pode explicar a disparidade no efeito terapêutico observado entre os dois estudos, porque o volume do tumor é o factor principal na determinação do resultado do tratamento em radioterapia [29]. Além disso, a disponibilidade de tratamento RIT depende da presença ou ausência da expressão da proteína alvo. Portanto, uma variedade mais ampla de proteínas alvo para RIT é preferível.

90Y-B5209B tem valor como um candidato terapêutico para o tratamento de SCLC ROBO1-positivo porque c-kit não é sempre expresso em CPPC.

perda também observada de peso corporal, diminuição das células hematopoiéticas e do balão hepatócitos. Estas condições foram transitórios, indicando que 200 uCi de

90Y-B5209B estava sob a dose máxima tolerada de xenoenxerto em ratinhos NCI-H69. É necessário efectuar o estudo de escalonamento de dose para determinação de uma dose letal e a dose terapêutica óptima. Consideração da dose absorvida para os órgãos normais é importante para determinar a dose de radiação terapêutica em pacientes. Neste estudo, estimou-se a dose absorvida órgãos em um homem de referência de 70 kg a partir de nossos dados de biodistribuição. As doses absorvidas pela medula fígado, rim, baço e medula foram de 2,1 mGy /MBq, 3,8 mGy /MBq, 1,3 mGy /MBq, e 0,4 mGy /MBq, respectivamente. Em um estudo clínico de

90Y-Zevalin, as doses absorvidas aceitáveis ​​para os órgãos normais ea medula vermelha estavam abaixo de 20 Gy e 3 Gy, respectivamente [30]. As doses máximas toleradas, calculadas a partir de doses absorvidas pelo fígado, rim, baço, e medula óssea, foram 9,5 GBq, 5,3 GBq, 15,4 GBq, e 7,5 GBq, respectivamente. Assim, a dose terapêutica máxima estimada de

90Y-B5209B é de 5,3 GBq. No entanto, é relatado que este biodistribuição do anticorpo marcado radioactivamente mostra uma discrepância entre os modelos animais e pacientes [31]. Além disso, B5209B reage a ROBO1 humano, mas não de murino ROBO1. É necessário realizar um estudo de biodistribuição com

111In-B5209B em pacientes para estimar a dosimetria exata.

Foi observada uma diferença no grau de dano entre o esterno e fêmur. No entanto, o acúmulo de

111In-B5209B não tem nenhuma diferença entre os dois em nosso estudo biodistribuição. Isto sugere que a acumulação de

90Y-B5209B a estes órgãos não é um factor principal da diferença no grau de danificação entre os dois. Nós já explicou que esta diferença pode ser devido à disparidade intervalo de áreas de piscina de sangue e de alta acumulação, como tumor, fígado e baço [14]. Isto sugere que o grau de efeito secundário na RIT tem o potencial para alterar a função em uma posição metastático. Portanto, é necessário identificar as posições focais antes da injecção de

RIT agente marcado com 90Y para a estimativa do efeito colateral.

No baço, observou-se ilhas de células regenerativas compostos de eritroblastos e granulocítica em dias 14 e 21, juntamente com um aumento significativo do número de células hematopoiéticas, incluindo megacariócitos. Estes resultados sugerem que a regeneração de tecidos hematopoiéticos começou no dia 14-20, e danos em tecidos hematopoiéticos era transiente com este tratamento. O aumento de megacariócitos foi observada após o aumento de eritroblastos e granulócitos. Além disso, observou-se uma diminuição na megacariócitos, sem eritroblastos e granulócitos, no fêmur. Kashiwakura et ai. relataram que megacariócitos de unidades formadoras de colónias são mais radiossensíveis do que as outras células progenitoras mielóides [32]. Portanto, a alta radiossensibilidade de megacariócitos de unidades formadoras de colônia pode explicar estes fenómenos.

No dia 7, observamos um balão de hepatócitos no fígado.