Abstract

A desregulação de junções apertadas (TJs) é frequentemente associada a doenças humanas, incluindo a carcinogênese e recentes estudos suportam papel das proteínas integrais TJ na regulação da epitelial-a-mesenquimal Transição (EMT). A este respeito, a expressão de claudina-1, um componente chave de TJs, é altamente aumentada no cancro do cólon e está causalmente associada com o crescimento do tumor e progressão. No entanto, o mecanismo de /s regulação subjacente da claudina-1 em células epiteliais intestinais permanece pouco compreendido. Nos nossos estudos, identificámos sítios de ligação putativos de factores de transcrição intestinal Cdx1, -2 e GATA4 na região flanqueante 5 ‘do gene da claudina-1. Nossos estudos posteriores utilizando comprimento total e /ou mutante de deleção constrói em duas linhas humanos diferentes de células de cancro do cólon, SW480 e HCT116, mostrou papel fundamental da Cdx1, Cdx2 e GATA4 na regulação da claudina-1 expressão do mRNA. No entanto, a superexpressão de Cdx2 teve o efeito mais potente sobre claudin-1 expressão do mRNA e atividade do promotor. Além disso, em amostras de pacientes com câncer de cólon, foi observada uma correlação significativa e paralelo entre expressões Cdx2 claudin-1 e. ensaio cromatina imunoprecipitação (CHIP) confirmou a ligação do Cdx2 com claudina-1 promotor de

in vivo

. Utilizando construções Cdx2 mutante de deleção, foram mapeados ainda mais o domínio C-terminal Cdx2 ser importante na regulação da actividade do promotor de claudina-1. Curiosamente, a co-expressão de activado β-catenina induzida ainda mais a sobre-regulação dependente da actividade do promotor de Cdx2 claudina-1 enquanto que a expressão do dominante negativo (DN) -TCF-4 revogada esta activação. Tomados em conjunto, podemos concluir que homeodomain fatores de transcrição Cdx1, Cdx2 e GATA4 regular claudin-1 expressão de genes em células cancerígenas do cólon humano. homeobox Além disso, uma linha cruzada funcional entre Wnt-sinalização e de activação da transcrição relacionada com relacionada com o caudal (CDX) proteínas e GATA-proteínas é demonstrado na regulação da claudina-1 promotor-ativação

Citation:. Bhat AA, Sharma A, Papa J, Krishnan M, Washington MK, Singh AB, et al. (2012) Caudal homeobox Protein CDX-2 Coopera com Wnt Pathway to Regular Claudina-1 em células do cancro do cólon. PLoS ONE 7 (6): e37174. doi: 10.1371 /journal.pone.0037174

editor: Frederic Andre, Universidade de Aix-Marseille, França |

Recebido: 06 de janeiro de 2012; Aceito: 17 de abril de 2012; Publicado: 15 Junho 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Bhat et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) CA124977 concessão (P. Dhawan) e DK088902 (AB Singh). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

junções apertadas (TJS), a adesão célula-célula mais apical, ajudam a regular a polaridade e estado diferenciado das células epiteliais. Perturbação de junções célula-célula, juntamente com as mudanças concomitantes na expressão de proteínas associadas ajuda a induzir a invasão e metástase em progressão do cancro. A família de proteínas claudina é parte integrante da estrutura e função das junções apertadas, e alterações na expressão de membros da família claudina; embora de uma forma específica do tecido, foi detectado em vários cancros. Várias linhas de evidência sugerem que claudina-1 é um componente chave de TJs [1], [2], e está directamente envolvida na função de barreira e cerca de TJs [3], [4]. Além disso, estudos incluindo o nosso demonstraram que claudina-1 é expressão desregulada de uma variedade de cancros incluindo cancro colo-rectal [3], [5]. Temos ainda mostrado usando uma grande coorte de pacientes com câncer de cólon que claudin-1 expressão do mRNA é também altamente aumento no câncer de cólon [25]. É ainda digna aqui notar que, no cancro do cólon, desreguladas claudina-1 de expressão associados com a progressão tumoral e metástase [5]. Além disso, claudina-1 é um alvo de β-catenina sinalização /Tcf, um regulador chave da homeostase do cólon e um crescimento neoplásico /progressão [6]. No entanto, os detalhes da regulação da transcrição de cólon claudin-1 expressão não são claramente compreendidas.

A. A análise Western blot de Cdx1, Cdx2, GATA4, claudina-1 e claudin-4 expressão da proteína em células SW480. células SW480 foram transientemente transfectadas com Cdx1, Cdx2 e /ou vectores de expressão GATA4, e 20 ^ g de extractos de células inteiras foram analisados. p-actina foi utilizado como controlo de carga. B. Densitometria para claudin-1 e claudin-4 expressão. C. Análise de Quantitative PCR em Tempo Real. células SW480 foram co-transfectadas com Cdx1, Cdx2 e vectores de expressão GATA4 na presença das construções repórter indicados, e RT-PCR quantitativa foi realizada. Quarenta e oito horas mais tarde, o ARN total foi isolado e submetido a PCR em tempo real utilizando iniciadores específicos de gene. Os resultados foram representados graficamente como a média ± DP de três experiências independentes e apresentados como uma mudança de dobragem. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 quando comparado com o controlo. As diferenças entre dois grupos foram analisadas pelo teste t de Student de duas caudas e de mais de dois grupos por ANOVA one-way com post-hoc de Bonferroni teste de comparação múltipla.

O homeodomain proteínas Cdx1 e Cdx2 são os membros da família do gene-related homeobox caudal [7] – [9]. Estudos apoiar o papel da Cdx1 e Cdx2 na regulação da diferenciação precoce e manutenção das células epiteliais do intestino. Estudos utilizando células epiteliais de origem intestinal, demonstraram que a modulação da expressão de Cdx1 e /ou Cdx2 tem efeitos funcionais significativos na diferenciação intestinal [10], [11], a proliferação de [10], [12], e a transcrição de genes específicos do intestino programa [13] – [16]. Deve notar-se que Cdx1 Cdx2 e ligam-se a vários promotores específicos do intestino para regular a transcrição de gene específico do intestino [13] – [15], [17], [18]. Além disso, GATA4, um factor de transcrição de dedos de zinco, está envolvido na regulação da proliferação e diferenciação de células epiteliais intestinais e ajuda a regular o desenvolvimento embrionário do tracto gastrointestinal [19]. Estudos têm demonstrado também que as interações de GATA4 com Cdx2 e ajuda HNF-1α regular a expressão de vários genes de adesão célula-célula, incluindo E-caderina e claudina-2 [19], [20].

Neste relatório, demonstrou-se que a expressão do gene do cólon claudina-1 é também um alvo de regulação transcricional por Cdx1, Cdx2 e GATA4 onde Cdx2 pareceram ter efeito mais potente como indutor de cólon claudina-1 de expressão. Nós fornecer mais dados de apoio correlação paralelo entre claudin-1 e expressão Cdx2 em amostras de doentes com cancro do cólon. Mais importante ainda, os nossos dados sugerem que regula Cdx2 claudina-1 de expressão em cooperação com Wnt-sinalização, um regulador conhecido da claudina-1 de expressão.

A sequência de claudina-1 de promotor e de identificação do transcription- local de iniciação foi previamente descrito [21]. principais locais de ligação de consenso putativos estão sublinhados. B. Cdx1, Cdx2 e GATA4 regulação da claudina-1 gene repórter luciferase. SW480 (B), HCT116 (C), MCF-7 (D) e células MDCK (E) foram transfectadas transitoriamente com um plasmídeo repórter de claudina-1-luciferase de 1,2 kb juntamente com Cdx1, Cdx2 e /ou vectores de expressão GATA4. Vazio vector pGL3-basic foi utilizado para fins de controlo. o plasmídeo de ADN não específica foi usada para manter quantidades iguais de ADN em todas as amostras de transfecção. Os resultados são expressos em fold-activação da actividade da luciferase em relação após a normalização com

Renilla

atividade a partir de 3 ensaios independentes, e os valores são expressos em média ± SD. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 quando comparado com o controlo. As diferenças entre dois grupos foram analisadas pelo teste t de Student de duas caudas e de mais de dois grupos por ANOVA de uma via com Bonferroni Teste de comparação post-hoc múltipla.

Resultados

Expression forçado de Cdx1, Cdx2 ou GATA4 induz a expressão claudina-1 em células cancerígenas do cólon

Para examinar se Cdx1, Cdx2 e /ou GATA4 ajudar a regular cólon claudin-1 expressão, determinou-se o efeito de sobre-expressão acima de factores de transcrição endógena sobre claudina-1 de expressão. Para este fim, utilizou-se células cancerígenas do cólon SW480, que expressam níveis baixos de claudina-1 endógeno [5]. as construções de plasmídeos de expressão de mamífero contendo de comprimento completo Cdx1, Cdx2 ou GATA4 foram transf ectadas transitoriamente em células SW480. plasmídeos de expressão vazias serviu como controle. Quarenta e oito horas após a transfecção, as amostras foram recolhidas e foram submetidas a preparação de lisado ou extracto de RNA total. Imunotransferência utilizando anticorpos específicos do antigénio foi feita para confirmar a sobre-expressão e níveis semelhantes de sobre-expressão de antigénios em estudo (Figura 1A). Como mostrado na Figura 1B, observou-se a regulação positiva robusta de claudina-1 em células que sobre-expressam Cdx1 (3,8 ± 0,451 vezes), Cdx2 (6,5 vezes ± 0,854) ou GATA4 (3,3 ± 0,115 vezes) ao nível da proteína. RT-PCR quantitativa mostrou indução semelhante de claudina-1 sobre a expressão de ARNm sobre-expressão de todos os factores de transcrição acima e mais uma vez esta indução foi máxima em células que sobre-expressam Cdx2 (Figura 1C). Este efeito de Cdx1, Cdx2 ou GATA4 sobre claudina-1 de expressão foi específica, porque a expressão da claudina-4, ainda um outro membro da família claudina, não foi afectada pela expressão forçada de qualquer um dos factores de transcrição acima (Figura 1A B).

células SW480 foram co-transfectadas com diferentes combinações de Cdx1, Cdx2 e vectores de expressão GATA4 na presença de construções repórter indicados, e ensaios de luciferase foram realizados. Quarenta e oito horas mais tarde, as células foram lisadas e a actividade da luciferase foi medida. Os resultados foram representados graficamente como a média ± DP de três experiências independentes e a actividade da luciferase normalizada em cada linha celular foi apresentada como a actividade de luciferase relativa. O valor médio de células transfectadas com o vector pGL3-basic na ausência de vectores de expressão foi definido como 1. B e análise de mancha de Western de C. claudina-1 de expressão de proteína em células SW480. células SW480 foram transfectadas com diferentes combinações de Cdx1, Cdx2 e vectores de expressão GATA4 e 20 ug de proteínas foram analisadas. ** P 0,01, *** p 0,001, **** p 0,0001 em comparação com o controlo. As diferenças entre dois grupos foram analisadas pelo teste t de Student de duas caudas e de mais de dois grupos por ANOVA one-way com post-hoc Bonferroni teste de comparação múltipla.

A. As construções repórter contendo 5′- sequencialmente excluído que flanqueiam os fragmentos de 1,2 kb claudina-1 (-1160 /-260) foram preparadas e transfectadas em SW480 (B) e as células HCT 116 (C) conforme descrito em “Procedimentos experimentais”. Os resultados são expressos como a actividade de luciferase relativa de três experiências diferentes realizadas em triplicado (média ± D.P.). As diferenças entre dois grupos foram analisadas pelo teste t de Student de duas caudas e de mais de dois grupos por ANOVA de uma via com Bonferroni Teste de comparação post-hoc múltipla.

Cdx1, Cdx2 e GATA4 Regular claudina-1 Gene transcrição em células cancerígenas do cólon

em estudos anteriores, a expressão forçada de Cdx1, Cdx2 ou GATA4 resultou em um aumento na claudin-1 proteína e expressões de mRNA. Portanto, nós ainda determinado se Cdx1, Cdx2 e /ou GATA4 ajudar a regular claudin-1 transcrição. A este respeito, foi realizada ensaio de repórter de luciferase usando um claudina-1 promotor humano (-1160 /+ 160) -luciferase construção repórter descrito anteriormente [21] designado como pGL3 /-1.2Cld-1 (Figura 2A) em todo o manuscrito. A região -1.160-160 pb do promotor de claudina-1 humano contém sítios de ligação putativos CDX, HNF e GATA, juntamente com os locais de ligação putativos para TCF /Lef-1 (Figura 2A). células SW480 foram transientemente transfectadas com o pGL3 /-1.2Cld-1 ou pGL3-basic (apenas o vector) juntamente com um plasmídeo repórter de referência. A actividade da luciferase de pGL3 /-1.2Cld-1 foi normalizada para a de pGL3-basic para além do vector de referência. A expressão ectópica de Cdx1 ou GATA4 não alterou o nível de expressão Cdx2, nem Cdx2 sobreexpressão tem um efeito perceptível sobre Cdx1 ou expressões proteína GATA4 (Figura 1A). A sobre-expressão de ambos os Cdx1 ou GATA4 resultou em um aumento ~ 3 vezes na actividade do promotor de pGL3 /-1.2Cld-1. No entanto, semelhante a sobre-expressão de Cdx2 resultou num aumento de 6 vezes na actividade da mesma construção (Figura 2B). Observou-se uma tendência semelhante de indução de actividade de luciferase pGL3 /-1.2Cld-1-impulsionado em cancro do cólon HCT116, que foi de 2,5-3 vezes sobre a superexpressão de Cdx1 e GATA4 e ~ 4 vezes sobre a superexpressão de Cdx2 (Figura 2C). Obtivemos resultados semelhantes usando um longo 3,3 Kb (-3.140-160) ensaio de repórter claudin-1 promotor, que não foi significativamente diferente em comparação com o Kb claudin-1 promotor de 1,2 (Figura S1). Por conseguinte, prosseguiu-se a utilização do 1,2 Kb claudina-1 promotor para estudos posteriores. Os nossos estudos posteriores suportado especificidade dos nossos achados acima como sobre-expressão de ainda um outro factor de transcrio HNF-1α não afectou a actividade do promotor claudina-1 tanto em células SW480 (Figura S2). Nós confirmou ainda a especificidade das nossas descobertas à expressão do cólon claudin-1 como a sobre-expressão transitória semelhante de Cdx1, Cdx2 ou GATA4 em células de câncer humano de mama (MCF-7) ou células do epitélio renal (MDCK células II) não aumentou claudin-1 promotor atividade (Figura 2D e)

HD:. homeodomain; A, B, C: domínios conservados. B. Actividade da luciferase após a co-transfecção com Cdx2 de tipo selvagem e mutantes de truncagem. Supressão do Cdx2 C-terminal (Cdx2CD) significativamente (***

p Art 0,001) reduziu a actividade repórter claudin-1. análise de mancha C. Western utilizando anticorpo anti-Flag para verificar expressão equivalente de mutantes truncados Cdx2 em células SW480 transfectadas transitoriamente com Cdx2 truncamento vetores de expressão mutante. p-actina foi utilizado como controlo de carga. D. Cdx2 de ligação para a região flanqueadora 5 ‘da claudina-1 gene promotor mostrado por ensaio de chip. cromatina formaldeído reticulado preparado a partir de 5 × 10

7 SW480 células foi incubada com anticorpos para Cdx2 ou com IgG (controlo negativo). A reticulação dos imunoprecipitados foi invertida e o ADN foi purificado e analisado utilizando iniciadores específicos para a região promotora, quer a claudina-1 ou para desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato. Os resultados mostram que a indução de claudina-1 de actividade de promotor por Cdx2 requer domínio Cdx2-C-terminal.

Cdx1, Cdx2 e factores de transcrição GATA4 funcionar sinergicamente para regular a expressão de genes diferentes [19]. Portanto, verificou-se se uma sinergia semelhante existia entre Cdx1, Cdx2 e GATA4 na regulação da claudina-1 transcrição do gene. Para testar, nós co-transf Cdx1 com Cdx2, Cdx1 com GATA4 e Cdx2 com GATA4 em células SW480. De facto, a co-expressão de Cdx1 com Cdx2, Cdx1 com GATA4 ou Cdx2 com GATA4, todos resultou em aumento significativo (9-13 vezes) na actividade do promotor de claudina-1 (Figura 3A). Este sinergismo na regulação da claudina-1 de expressão foi ainda confirmada nos níveis de proteína em que foi induzida a expressão claudina-1 (8-10 vezes) em comparação com (3-6 vezes) com Cdx1, Cdx2 ou GATA4 sozinho (Figura 3B C)

Claudina-1 na actividade de promotor SW480 (a) e células HCT 116 (B).. As células foram co-transfectadas transientemente com construções de vector de expressão para β-catenina activado (S33Y) juntamente com Cdx1, Cdx2 ou vectores de expressão GATA4. atividade claudina-1 promotor foi revogada após a co-transfecção de dnTcf-4 com Cdx1, Cdx2 ou expressão GATA4 vetores células SW480 (C) e HCT116 (D).

claudina-1 Promotor Contém Sítios de Ligação para Cdx e Fatores de Transcrição GATA

Com base em nossas conclusões anteriores, examinamos mais sítios de ligação putativos para Cdx1, Cdx2 e GATA4 em claudin-1 promotor. Utilizou-se análise computacional utilizando software MatInspector (Oxford Molecular Group) para identificar os sítios de ligação putativos para o consenso CDX- e elementos GATA-ligação (Figura 2A). Para confirmar a eficácia funcional desses sítios de ligação putativos e também para identificar as regiões envolvidas na regulação da claudina-1 de transcrição de genes, foram geradas construções de claudina-1 de deleção do promotor a partir da região flanqueante 5 ‘, tal como descrito anteriormente [21]. A Figura 4A representa a construção do promotor de comprimento completo (-1160 /+ 160) e nove construções de deleção (-850 /+ 160, -740 /+ 160, -665 /+ 160, -550 /+ 160, -490 /+ 160, -420 /+ 160, -350 /+ 160 e -260 /+ 160). As construções repórter gerados acima foram, em seguida, co-transfectado com Cdx1, Cdx2 ou expressão GATA4 construções em células SW480 e HCT116. A construção do promotor de comprimento completo continham o sítio de ligação Cdx e GATA4 consenso, juntamente com o local de ligação para Tcf /Lef-1, e induziram claudina-1 actividade do promotor de 5-6 vezes em células SW480 (Figura 4B). No entanto, esta indução foi perdido após a exclusão do proximal 310 pb (-1.160 a -850), o que sugere que esta região bp 310 tem locais importantes para claudin-1 indução do promotor de fatores de transcrição sob investigação. Achados semelhantes de células HCT116 apoiou esta noção (Figura 4C). Ambas as linhas celulares exibiram padrões semelhantes de atividade do promotor, embora os sinais em geral eram mais fortes em células SW480. Esta região bp 310 continha uma Cdx, dois de ligação de consenso locais GATA e um local de ligação Tcf /Lef-1 sugerindo importância potencial desses sites na regulação da claudina-1 expressão do gene.

A. Correlação entre as expressões claudina-1 e Cdx2 no câncer de cólon. Os dados de matrizes de tecido de cancro colorectal costume (microarrays de tecido desenvolvidos em Vanderbilt) que contêm espécimes cirúrgicos de 50 amostras de cancro primário e emparelhados metastáticos fresco congelado humanos colorretais são mostrados. Observou-se uma correlação direta significativa entre claudin-1 e expressão Cdx2 (** P 0,01) utilizando o teste qui-quadrado de Yates. B. coloração representativo para claudina-1 (um) e Cdx2 (b) em amostras de pacientes de cancro do cólon. As secções foram contrastadas com hematoxilina para determinar os detalhes estruturais.

O domínio C-terminal é necessária para Cdx2 Mediated Ativação de Claudina-1 transcricional Atividade

Acima de estudos sugeriram um papel de Cdx1 , Cdx2 e GATA4 na regulação da claudina-1 promotor. No entanto, Cdx2 pareceu ter o efeito mais potente sobre a actividade do promotor de claudina-1. Por conseguinte, em mais estudos, determinou-se o domínio Cdx2 que é necessário para a activação da transcrição de claudina-1 de promotor. A este respeito, testou-se o efeito de construções de deleção Cdx2 mutantes quanto à sua capacidade para induzir claudina-1 de actividade do promotor (Figura 5A) [22]. A análise de imunotransferência utilizando um anticorpo anti-FLAG confirmou os níveis de expressão semelhantes de Cdx2 construções de deleção mutantes (Figura 5C). Os resultados mostraram que a deleção do domínio de activação de transcrição canónica (Cdx2 δ55-136), os domínios N-terminais (Cdx2 δ15 ou Cdx2 δ50) ou a região entre os aminoácidos 140 e 180 (Cdx2 δ140-180) não teve nenhum efeito significativo sobre claudina -1 actividade do promotor. Em contraste, a eliminação de Cdx2 terminal-C 244-311 (Cdx2CD) reduziu a actividade do promotor claudina-1 por 5 vezes em comparação com o tipo selvagem Cdx2 (Figura 5B). Tomados em conjunto, estes estudos sugerem que domínio Cdx2 C-terminal é necessário para a indução dependente de Cdx2 de claudina-1 ativação do promotor.

Para determinar ainda se Cdx2 se liga ao claudin-1 promotor de

in vivo

, foi realizada a análise de chip e comparação SW480 células com superexpressão Cdx2 com células SW480 transfectadas com o vector plasmídeo de expressão vazia. A Figura 5D mostra o ADN resultante puxado para baixo pelo anticorpo anti-Cdx2 contendo a sequência que flanqueia o sítio de ligação Cdx. Isto sugeriu que Cdx2 liga-se aos elementos CDX-sequência dentro do 310 pb de claudina-1 de promotor e isso aumenta vinculam a superexpressão de Cdx2 SW480 em células, o que, por sua vez, aumenta a actividade do promotor de claudina-1. Para determinar adicionalmente se o C-terminal é importante para a ligação Cdx2 de claudina-1 de promotor, que sobre-expresso Cdx2CD (mutante de deleção do terminal C) ou um mutante de deleção N-terminal, que não afecta o claudina-1 de actividade de transcrição (δ50 Cdx2 ) em células SW480 e análise ChIP realizada. A análise ChIP demonstrado que o aumento da ligação, devido à sobre-expressão de comprimento completo Cdx2 foi anulada após a sobre-expressão de Cdx2CD mas não o mutante de deleção N-terminal (Cdx2 δ50) (Figura 5D). Estas descobertas sugerem que Cdx2 C-terminal do domínio é importante para a ligação de Cdx2 de claudina-1 e o promotor de indução dependente de Cdx2 actividade de claudina-1 de promotor.

A diafonia Funcional de sinalização Wnt e relacionados com Cdx transcricional activação Regula Claudin 1-Promotor Atividade

Claudina-1 é um alvo conhecido da Tcf /Lef 1 de sinalização [6] e Tcf /Lef-1 elementos estão presentes dentro de -1160 a -850 região de claudin- o um promotor. Para testar o efeito de β-catenina /Tcf /Lef-1, claudina-1 promotor foi submetido a co-transfecção na presença ou ausência de activado β-catenina (S33Y) juntamente com Cdx1, 2 ou GATA4. As transfecções transientes foram realizadas em células SW480 e HCT116 e a actividade da luciferase de pGL3 /-1.2Cld-1 foi normalizada para pGL3-Basic, para além do vector de referência. A sobre-expressão de activado β-catenina (S33Y) com Cdx1, Cdx2 ou GATA4 resultou em pelo menos duas vezes mais a indução de claudina-1 de expressão de genes mediada por promotor comparação com Cdx1, Cdx2 ou GATA4 sozinho (Figura 6A B). Por outro lado, quando sobre-expresso Cdx1, Cdx2 ou GATA4 com dnTcf-4, a indução de claudina-1 de promotor foi revogada sugerindo potencial conversa cruzada entre estes factores (Figura 6C D). Tomados em conjunto, nossos dados sugerem que a modulação da β-catenina /atividade Tcf /Lef desempenha papel central na Cdx, GATA4 regulação mediada de expressão claudin-1.

Claudina-1 e Cdx2 Expressões são correlacionados em colorretal humano As amostras de carcinoma

expressão da proteína Cdx2 está associado a estágios avançados de cólon tumorigênese [23]. expressão claudina-1 correlaciona-se positivamente com a progressão tumoral e metástase no câncer de cólon [5]. Portanto, nós investigamos uma possível correlação entre Cdx2 e claudina-1 expressões no câncer de cólon. Foi examinada a correlação potencial entre expressões Cdx2 claudina-1 e em uma grande população de amostras de tecidos humanos. A análise imuno-histoquímica para claudin-1 e Cdx2 no colo costume matrizes de tecido de cancro (microarrays de tecido desenvolvido na Universidade de Vanderbilt pelo Dr. M. K. Washington; que contêm espécimes cirúrgicos de 50 amostras primários e emparelhado metastático fresco congelado humano colorectal cancer) foi realizada. Os resultados mostraram imunomarcação nuclear predominante para Cdx2 enquanto claudina-1 de coloração foi predominantemente citosólica embora alguma coloração ponteada membrana foi também observado (Figura 7B). É importante ressaltar que uma análise mais aprofundada demonstrou uma correlação significativa (p 0,01) entre as expressões Cdx2 claudin-1 e em 36:50 amostras (72%) de câncer de cólon (Fig 7A.). Tomados em conjunto, estes dados sugerem uma correlação direta entre as expressões de Cdx2 e claudina-1 em carcinomas colo-rectais.

Discussão

A desregulação da diferenciação colonocyte está no cerne da carcinogênese do cólon. Claudina-1 de expressão é altamente aumentada no cancro do cólon e está causalmente associada com o crescimento do tumor e progressão [5]. De interesse, para além da expressão da proteína desregulado e localização, claudina-1 aumenta a expressão de mRNA também em cancro do cólon [25]. Também é digno de nota que a manipulação genética de claudina-1 em células de câncer de cólon resultou em mudanças bruscas e inversa em seu estado de diferenciação, incluindo a expressão da caderina-E [5], [24]. Além disso, a indução de diferenciação epitelial em células cancerígenas do cólon, utilizando histona desacetilase (HDAC) associada com uma diminuição específica em claudina-1 de expressão entre os membros da família claudina [25]. Tomados em conjunto, claudina-1 de expressão parece afectar carcinogénese do cólon através da modulação da diferenciação das células epiteliais do cólon. Portanto, nós examinamos o papel de fatores de transcrição importantes na regulação da diferenciação epitelial intestinal, assim como carcinogênese do cólon na regulação da claudina-1 de transcrição de mRNA. O principal resultado dos nossos estudos usando duas linhas de células de cancro do cólon diferentes e amplamente utilizados foram (i) Cdx1, Cdx2 e GATA4 ajuda a regular claudin-1 transcrição do gene, e este regulamento era específico para as células de origem do cólon, (ii) Cdx2 é o mais potente indutor da claudina-1 de actividade de promotor entre Cdx1, Cdx2 e GATA4, e fisicamente se liga ao CDX-consenso local de ligação /s, de claudina-1 de promotor, tal como determinado pela análise de chip, (iii) Cdx1, Cdx2 e GATA4 regular cólon claudin-1 expressão por meio do potencial sinergismo entre cada-outros e através do potencial cross-talk com a via Wnt-sinalização. Tomados em conjunto, neste relatório nós fornecemos os primeiros insights sobre os complexos eventos de ativação da transcrição, que regulam cólon claudin-1 expressão.

A proteína homeobox caudal Cdx1 se expressa principalmente no compartimento da cripta, enquanto que a proteína Cdx2 é detectada tanto da cripta e das vilosidades os compartimentos [26]. Importante, resultado de vários estudos sugerem que o papel de Cdx1 Cdx2 e na regulação da homeostase intestinal é frequentemente complementares e podem depender da maturação das células do epitélio intestinal [27]. Estas conclusões são complementadas com a demonstração de um papel bastante discreto de Cdx1 na regulação da proliferação celular epitelial intestinal, enquanto Cdx2 desempenham um papel importante na regulação do estado de diferenciação das células epiteliais do intestino [28]. GATA4 também pertence a uma família de fatores de transcrição que desempenham papel importante na regulação da embriogênese e maturação, possivelmente precoce de células epiteliais do intestino [29]. GATA4 juntamente com GATA5 /6 tem sido associado com a sobrevivência da célula, a proliferação celular e transformação neoplásica de vários tipos de células [8] – [15]. Notavelmente, entre cancros gastrointestinais, GATA4 é amplificado em ~ 10% dos adenocarcinomas de esôfago e Barrett metaplasia [30]. Papel de GATA4 na regulação da carcinogénese do cólon não está bem estudada embora estudos limitados sugerem que ele pode funcionar como um supressor tumoral no cancro do cólon [31]. No entanto, uma necessidade de ser advertido na formulação funcional específico desses fatores de transcrição como a sua função /s são muitas vezes dependentes do contexto e interação com outros reguladores de transcrição também são importantes.

De interesse, o papel do fator de transcrição Cdx2 em a regulação da carcinogênese do cólon permanecem controversos e os estudos sugerem seu papel como um “modulador tumor” positivo ou negativo. A este respeito, os ratinhos que são heterozigotos-nulo para o gene Cdx2 desenvolver hamartomas do cólon após o alelo Cdx2 restante é perdida, [33] [32]. Estes ratinhos heterozigóticos Cdx2-nulo também são sensíveis à azoximetano (AOM) induzida adenocarcinoma do cólon [34]. Além disso, os heterozigotos compostos para genes de polipose adenomatosa coli (APC) Cdx2 e desenvolver mais pólipos adenomatosos do cólon em comparação com a sua heterozigótico

Apc

ninhada [35]. Juntos, os resultados acima sugeriria função da Cdx2 como um supressor de tumor de cólon. No entanto, a análise imunohistoquímica detectou expressão forte Cdx2 em ~ 90% das amostras de cancro do cólon humano [38], [39]. Além disso, Cdx2-a sobre-expressão em células cancerígenas do cólon induz o crescimento independente de ancoragem e a sobrevivência das células [36]. De interesse, Cdx2 promove o crescimento independente de ancoragem através da repressão transcricional de IGFBP-3 [37]. Assim, pode prever-se um papel de promoção do tumor de Cdx2 no câncer de cólon. Tomados em conjunto, pode ser postulado que o papel do Cdx2 na regulação do cancro do cólon pode depender do estado de diferenciação das células cancerígenas do cólon e interação com outros fatores de transcrição.

Os resultados de vários estudos têm revelado a existência de uma interacção complexa entre Cdx1, Cdx2, GATA4 e HNF-1α na indução da expressão do gene do intestino, incluindo um membro da família claudina, claudina-2 [40], [41]. É importante notar que semelhante ao claudina-1, claudina-2 também expressão é regulada positivamente em carcinogénese do cólon [42]. Cdx2 foi demonstrada a desempenhar um papel na regulação de outras proteínas de adesão célula-célula, incluindo LI-caderina, claudina-3 e claudina-4 [20]. No nosso estudo, nós identificamos local de ligação consenso Cdx bem como o local de ligação do GATA-no promotor claudina-1 humano. O facto de a expressão forçada de Cdx1, Cdx2 ou GATA4 induzida não só claudina-1 de proteína e a expressão de ARNm, mas também induziu a actividade da luciferase repórter dependente da claudina-1 de promotor humano de comprimento completo (-1.160-160) suporta um papel causal acima de fatores de transcrição na regulação da claudina-1 expressão. Notavelmente, a deleção da sequência de promotor de claudina-1 de -1160 a -840 pb (310 pb eliminação) da região flanqueante 5 ‘que contém os locais de ligação e CDX- GATA4 revogada o aumento na actividade da luciferase observada utilizando a full-length construção do promotor. Além disso, a nossa conclusão de que o Cdx1, Cdx2 ou indução dependente de GATA4 da atividade claudin-1 promotor pode ser ainda mais reforçada quando acima fatores de transcrição foram co-expressos suporta uma interdependência complexa entre estes fatores de transcrição na regulação da claudina-1 expressão . O fato de que a expressão forçada semelhante de HNF-1α não afetou claudin-1 expressão torna especificidade aos nossos achados (Figura S2). Além disso, a nossa descoberta de que a sobre-expressão de Cdx1 semelhante, Cdx2 ou GATA4 nas células cancerosas epiteliais renais e da mama não teve nenhum efeito aparente sobre claudina-1 de expressão sugerem que esta não é um mecanismo universal de claudina-1 de expressão e é bastante específico do cólon. É possível que esses fatores podem exigir outros co-fatores para ser ativo, que estão presentes apenas nas células cancerígenas do cólon.

Nossos dados sugerem ainda que, entre os fatores de transcrição sob investigação, Cdx2 é o indutor mais potente de claudina-1 de expressão. Na verdade, nossos estudos usando análise ChIP demonstrou uma associação direta da Cdx2 com claudina-1 promotor e, assim, sugeriu que claudin-1 é um alvo direto de regulação da transcrição dependente de Cdx2.