Abstract

Fundo

Um grande número de humanos Os antigénios associados a tumores que são reconhecidos por células T CD8 +

t em uma classe antigénio leucocitário humano I (HLA-I) da forma -restricted foram identificados. proteína de sequência rica em AT especial de ligação 1 (SATB1) é altamente expressa em muitos tipos de cancros humanos como parte do seu fenótipo neoplásico, e a sobre-regulação da expressão SATB1 é essencial para a sobrevivência de tumores e metástase, assim, esta proteína pode servir como um racional alvo para vacinas contra o câncer.

Metodologia /Principais achados

peptídeos Doze SATB1 derivados foram previstos por um imuno-informática abordagem baseada no motivo de ligação a HLA-a * 02. Estes péptidos foram examinadas quanto à sua capacidade para induzir respostas de células T específicas do péptido em células mononucleares do sangue periférico (PBMC), obtida a partir de HLA-A * 02

+ dadores saudáveis ​​e /ou + doentes com cancro de HLA-A * 02

. O reconhecimento de HLA-A * 02

+ SATB1-expressando células cancerosas também foi testada. Entre os doze péptidos SATB1-derivados, SATB1

sub 565-574 respostas de células T específicas do péptido frequentemente induzidas em PBMCs de dois dadores saudáveis ​​e doentes com cancro. É importante ressaltar que as células T

565-574 específicos SATB1 reconhecido e morto HLA-A * 02

+ SATB1

+ células cancerosas de forma HLA-I-restrito.

Conclusões /Significado

identificaram um novo HLA-a * 02 restringidos-péptido epitopo SATB1 derivado reconhecida por CD8

+ células T, as quais, por sua vez, reconhece e mata HLA-a * 02

+ SATB1 células

+ tumorais. O epitopo identificado SATB1-derivado pode ser usado como um marcador de diagnóstico, bem como um alvo imunológico para o desenvolvimento de vacinas contra o cancro

citação:. Wang H, Yin B, S Matsueda, Deng L, Li Y, Zhao W , et ai. (2013) Identificação de especial AT-Sequência Rica Binding Protein 1 como um antigénio tumoral Novel Reconhecido pela CD8

+ Células T: Implicações para o cancro imunoterapia. PLoS ONE 8 (2): e56730. doi: 10.1371 /journal.pone.0056730

editor: Silke Appel, da Universidade de Bergen, Noruega |

Recebido: 26 Outubro, 2012; Aceito: 14 de janeiro de 2013; Publicação: 21 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi em parte apoiada por doações do National Cancer Institute, National Institutes of Health e Instituto de Pesquisa do Câncer, eo Instituto de Pesquisa Hospital Metodista. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Uma das mais promissoras abordagens em terapia do cancro baseia-se no aproveitamento do sistema imunitário para eliminar células malignas [1], cujo sucesso depende em grande parte sobre a identificação de antigénios associados a tumores adequados (AT) para gerar eficaz vacinas contra o câncer. tem sido bem estabelecido que as células tumorais expressam TAAs que pode ser reconhecida por CD8

+ células T no contexto da classe antigénio de leucócitos humanos (HLA moléculas I-I). Um grande número de TAA e epitopos derivados de TAA foram identificados [2], [3], com algumas destas proteínas e derivados peptidicos já em ensaios clínicos de vacina. aprovações recentes dos sipuleucel-T (Provenge) e ipilimumab (YERVOY) pela Food and Drug Administration (FDA) representam vacina /medicamentos marcos à base de imunoterapia no campo da imunoterapia do cancro [4], [5]. E um ensaio clínico de fase III do peptídeo gp100 para o melanoma também produziram resultados altamente encorajadores [6]. Além disso, o trabalho de dois grupos independentes sublinhada a importância de antigénios específicos de tumor em eliciar respostas imunes contra um tumor em desenvolvimento [7], [8], sem dúvida, intensificando ainda mais os esforços para pesquisar novos antigénios tumorais para imunoterapia do cancro.

Apesar de tais resultados promissores, o sucesso em testes de vacinas contra o câncer em geral tem sido esporádica [9] – [11]. Durante os últimos dois anos, vários TAAs que são expressos em diferentes tipos de neoplasia foram identificados [2], [3]. No entanto, a maioria dos antigénios descritos até agora são dispensáveis ​​para a sobrevivência e crescimento das células tumorais, com a excepção de alguns TAAs, tais como a telomerase [12], survivina [13] e anti-apoptóticos membros da família Bcl-2 família (Bcl-2, Bcl-X (L) e Mcl-2) [14]. As células tumorais podem por conseguinte ter escapado vigilância pelo sistema imunitário através de perda e /ou sub-regulação de antigénios tumorais [15]. Por conseguinte, a segmentação TAAs que são essenciais para a sobrevivência e crescimento de células tumorais pode impedir melhor imuno-selecção de variantes de perda de antigénio como resultado da vacinação e melhorar a eficácia da imunoterapia do cancro [15], [16]. Esses antígenos tumorais imunogénicas que provocam o mínimo de escape imunológico, portanto, representam as vacinas candidatas mais ideal para imunoterapia de câncer.

Especial AT-rich ligação sequência da proteína 1 (SATB1) é um factor nuclear que funciona como um organizador da cromatina global. Ela regula a expressão do gene através da dobragem da cromatina em domínios de ansa, e prender os domínios de ADN para a estrutura da rede SATB1 [17]. SATB1 parecia estar sobre-expresso em linhas celulares de cancro da mama agressivo, mas as células epiteliais mamárias humanas ausentes ou indetectáveis ​​em condições normais e imortalizados, sugerindo um papel de SATB1 na organização reprogramação da cromatina e perfis em última análise, transcrição de tumores de mama para promover o crescimento e metástase [18] . Além disso, os níveis mais elevados de expressão SATB1 foram associadas com muitos outros tipos de cancro, incluindo o carcinoma da laringe de células escamosas [19], do cancro endometrial endometrióide [20], o carcinoma hepatocelular [21], cancro rectal [22], o melanoma cutâneo maligno [23 ], cancro gástrico [24], [25], do cancro do ovário [26], o cancro da próstata [27], o cancro do pulmão [28] e glioma [29]. -Regulação de SATB1 nestes tipos de cancros podem promover o crescimento de tumores e metástases. Desde SATB1 é essencial para o crescimento do tumor /sobrevivência e metástases, escape imune por perda ou a infra-regulação da expressão SATB1 pode impedir o crescimento de células tumorais sustentada e /ou metástase, tornando assim SATB1 um alvo atraente para vacinas anti-cancro contra vários tipos de cancros que expressam SATB1.

neste relatório, nós descrevemos a identificação de epítopos de células T SATB1 derivados de reconhecimento de células T, utilizando uma abordagem imuno-bioinformática. Foram selecionados doze péptidos que foram previstos para se ligarem a HLA-A * 02 molécula. Eles foram sintetizados e avaliados

In vitro

quanto à sua capacidade para estimular células T em PBMC a partir de indivíduos saudáveis ​​e /ou em pacientes de cancro com base em interferão-γ libertação (IFN-γ). Um destes péptidos, SATB1

565-574, foi encontrada para induzir a libertação de IFN-γ em células T periféricas de ambos os indivíduos saudáveis ​​e em doentes com cancro. Importante,

565-574 células T espec�icos SATB1 foram capazes de reconhecer e matar HLA-A * 02

+, SATB1-expressando células tumorais de uma forma HLA-I-dependente. Estes resultados demonstram a validade da abordagem imuno-bioinformática e sugerir SATB1

565-574 pode representar um novo epitopo específico do tumor para a imunoterapia do cancro.

Materiais e Métodos

dadores saudáveis ​​e pacientes com câncer

HLA-a * 02

+ próstata ou câncer de ovário pacientes e dez HLA-a * 02

+ indivíduos saudáveis ​​foram incluídos no estudo após a obtenção do consentimento informado por escrito. Todos os protocolos foram aprovados pelo Institutional Review Board (IRB) no Baylor College of Medicine antes de iniciar estudos. 20 ml de sangue periférico foi obtido a partir de cada pessoa, e as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade utilizando Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Noruega). PBMCs isoladas de fresco foram criopreservados para uso posterior em 1 ml de meio de congelamento contendo 90% de FCS e sulfóxido de dimetilo a 10% (DMSO) a -140 ° C. HLA-A * 02 expressão em CMSPs obtidas a partir de doentes com cancro e indivíduos saudáveis ​​foi verificada por meio de citometria de fluxo com FITC HLA-A * 02 mAb BB7.2 (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA).

linhas celulares

Todas as linhas de células de câncer de mama (MCF-7, CAMA-1, MDA-MB-134VI, MDA-MB-175VII, MDA-MB-361, DU4475, MDA-MB-231, MDA -MB-436, MDA-MB-453, MDA-MB-468), células T2 (a HLA-A * 02

+ deficiente para TAP, linha celular), linhas celulares de cancro da próstata (PC3, LNCaP e DU145), A linha celular de cancro do ovário OVCAR-3 e linha de células de linfoma Jeko-1 foram adquiridos à American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EUA). Uma linha de células de cancro do ovário Skov-1 [30], [31] foi um presente do Dr. Kunle Odunsi (Roswell Park Cancer Institute, NY, EUA); uma linha de células de linfoma L1236 [32], [33] foi um presente do Dr. Catherine M. Bollard (Baylor College of Medicine, em Houston, EUA). Todas as linhas celulares foram mantidas em meio RPMI-1640 (Mediatech, Manassas, VA, EUA), suplementado com 10% de FBS, 1% de L-glutamina, e 1% de penicilina e estreptomicina

Peptídeos

peptídeos Doze SATB1 derivados (Tabela 1) foram preditos usando BIMAS (https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/), SYFPEITHI (https://www.syfpeithi.de/), e Rankpep (https://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html) com base no motivo de ligação a HLA-a * 02. Os epítopos que foram previstos pelo menos dois destes algoritmos foram seleccionados para testes adicionais. Os péptidos foram sintetizados por um método em fase sólida utilizando um sintetizador de péptidos (AApptec, Inc .; Louisville, KY, EUA), purificou-se por cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa e validado por espectrometria de massa. Os péptidos sintetizados foram dissolvidos em DMSO a uma concentração de 10 mg /mL e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Um peptídeo (SATB1

544-552) foi excluído do estudo devido à dificuldade de síntese de peptídeos.

In vitro

células T Stimulation of Peptide específicos-em PBMC

PBMC (1 × 10

5 células /poço) a partir de qualquer indivíduos saudáveis ​​ou pacientes com cancro foram incubadas com concentrações de péptidos de 20 ug /mL de péptido por [34] – [37] em 96 poços L-inferior microplacas (BD; Franklin Lakes, NJ, EUA) em 200 ul de meio de células T (TCM), que consiste em meio RPMI 1640 (Mediatech, Manassas, VA, EUA), 10% de soro AB humano (Vale biomédica, Winchester , EUA), 50 uM de 2-mercaptoetanol, 100 UI /ml de interleucina-2 (IL-2), e uma solução de aminoácidos não essenciais MEM 0,1 mM de ácido (Invitrogen; Grand island, NY, EUA). Metade do TCM foi removido e substituído com péptidos contendo TCM fresco (20 ug /ml) a cada 5 dias. Após 14 dias de cultura, as células foram colhidas e testadas quanto à sua capacidade de produzir IFN-γ em resposta a células T2 (1 × 10

4 células /cavidade), que foram pré-carregadas com qualquer um dos péptidos SATB1 (5 ug /mL) ou um péptido de controlo (um péptido de ligação de EBV irrelevante HLA-a * 02: GLCTLVAML) como um controlo negativo. Após 18 horas de incubação, os sobrenadantes foram recolhidos, e IFN- γ libertação foi determinada por ensaio de ELISA.

rápida protocolo de expansão (REP) para SATB1 Péptido-específica células T

específico peptídeo-

SATB1 As células T foram expandidas por um protocolo de expansão rápida (REP) como anteriormente descrito [38] com uma ligeira modificação. Resumidamente, no dia 0, 0,1-0,5 × 10

6 células T específicas do péptido SATB1 foram cultivadas num frasco T25 com 20 ml de RPMI-1640 suplementado com 10% de soro AB humano, 50 uM de 2-mercaptoetanol, 30 ng /mL de anticorpo OKT3 (Ortho Biotech; Bridgewater, NJ, EUA) e 30 ng /mL de anticorpo anti-CD28 (R D Systems; Minneapolis, MN, EUA), juntamente com 20 × 10

6 irradiados PBMC alogênicos e 5 × 10

6 irradiados de Epstein Barr (EBV) de células B transformadas como células alimentadoras. Os frascos foram incubados na posição vertical a 37 ° C em 5% de CO

2. IL-2 (300 UI /mL) foi adicionado no dia 1 e no dia 5, metade do sobrenadante da cultura celular foi removido e substituído com meio fresco contendo 300 UI /ml de IL-2. 14 dias após o início do REP, as células foram recolhidas e criopreservadas para experiências futuras.

Esgotamento de CD4

+ ou CD8

+ T células de PBMC

CD4

+ células T CD8 ou

+ células T foram positivamente empobrecido a partir de PBMC de acordo com as instruções do fabricante usando monoclonais anti-CD4-revestidos Dynabeads ou monoclonais anti-CD8-revestidas (Dynal Biotech ASA, Oslo, Noruega). PBMC esgotadas de CD4 + células T

+ T ou CD8 foram verificadas por citometria de fluxo.

Ensaio ELISA

a libertação de citoquinas foi medida por revestimento de 96 poços placas de ELISA (Thermo Fisher Scientific; Rochester, NY, EUA) com 1 ug /mL de IFN-γ anti-humano (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA) durante a noite a 4 ° C. A placa foi lavada seis vezes com PBS contendo 0,05% de Tween-20 (solução de lavagem) para remover o anticorpo não ligado do revestimento, e bloqueadas com BSA a 1% /PBS em temperatura ambiente por 2 horas. Em seguida, 50 ul de sobrenadante foi adicionada a cada poço e incubou-se à temperatura ambiente durante 1 h, em seguida, 50 mL de 0,5 ug /mL biotinilado IFN-γ anti-humano (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA) foi adicionado e as placas foram incubadas durante mais 1 hora adicional à temperatura ambiente. Após a incubação, as placas foram lavadas e incubadas durante 30 min com poli-HRP-estreptavidina (Thermo Fisher Scientific; Rochester, NY, EUA) diluídos em PBS 1:5000 /1% de BSA. As placas foram lavadas e 100 ul de solução de substrato TMB (Sigma-Aldrich Co .; St. Louis, MO, EUA) foi adicionado por poço. A reacção colorimétrica foi parada utilizando 2N H

2SO4 e as placas foram lidas a 450 nm utilizando um leitor de placas de ELISA.

Extração de RNA e RT-PCR

extracção de ARN e RT-PCR foi realizada como relatado anteriormente [39]. Resumidamente, ARN total foi extraído a partir de células cancerosas com um reagente Trizol mL (Invitrogen; Carlsbad, CA, EUA). Três microgramas de RNA foi transcritos de modo inverso em ADNc em 30 uL de volume e 1 ul de cada ADNc foi utilizado na reacção de PCR subsequente com um par de iniciadores específicos SATB1: Iniciador 1:5′-TGCAAAGGTTGCAGCAACCAAAAGC-3 ‘; 5’-AACATGGATAATGTGGGGCGGCCT-3 ‘. GAPDH foi usada como controlo de carga: iniciador 1:5’-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3 ‘; Primer 2:5’-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3 ‘. A reacção de PCR foi realizada sob as seguintes condições: 95 ° C durante 1 min, 95 ° C durante 40 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 40 s, o total de 40 ciclos, 72 ° C durante 5 min, e GAPDH foi executado durante 25 ciclos. Quantidades iguais dos produtos de PCR foram, em seguida, carregado e detectados por electroforese em gel.

Western Blot

Os extractos celulares totais foram preparados e resolvidas em geles de SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas para membrana de PVDF (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA) e ainda incubadas com o anticorpo SATB1 (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). LumiGlo sistema de substrato quimioluminescente de KPL (Gaithersburg, MD, EUA) foi utilizado para detecção da proteína.

Análise FACS

As células (0,5 x 10

6) foram coradas com FITC-anti -CD8, PE-Cy5 anti-CD4 (ambos da eBioscience, San Diego, CA, EUA) ou FITC anti-HLA-a * 02 (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA) em PBS contendo 2% de FBS sobre gelo durante 30 min, e, em seguida, lavada duas vezes em PBS. Em seguida, as células foram re-suspensas em 500 ul de PBS e analisadas utilizando uma máquina FACScalibur. Para DimerX HLA-A * 02: coloração com Ig, SATB1 reactivo CD8

+ células T foram incubadas com antigénios HLA-A * 02: Ig (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) carregadas com um determinado péptido, e em seguida, coradas com FITC anti-IgG1 de ratinho (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). A citometria de fluxo foi realizada num aparelho FACScalibur.

Ensaio de Citotoxicidade

SATB1-derivada de células T específicas do péptido foram testadas quanto à citotoxicidade contra células T2 carregadas com péptido, dois HLA-A * 02

+ SATB1

+ linhas celulares de cancro (SKOV-1 e jeko-1) e uma molécula HLA-a * 02 negativa SATB1

+ linha celular PC3 como um controlo negativo por um lactato desidrogenase (LDH) de ensaio (Promega; Madison, WI, EUA). O ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. liberação de LDH foi calculado com base na seguinte fórmula:.

A citotoxicidade (%) = (Experimental – Effector espontânea – Alvo libertação de LDH espontânea) /(Target máxima – libertação espontânea alvo LDH) × 100

a libertação espontânea foi determinada usando-se o sobrenadante das células alvo sozinhas ou células efectoras sozinhas, e a libertação máxima foi determinada utilizando o sobrenadante de células alvo incubadas com uma solução de lise incluídos no kit de LDH.

t-teste de

Student foi utilizado para analisar as diferenças quantitativas entre os poços experimentais e controles em ensaios ELISA. P 0,05 foi considerado significativo

Resultados

mRNA SATB1 é expressa em uma variedade de cânceres

Para examinar se SATB1 é expressa em células cancerosas, a expressão do mRNA para SATB1 em. vários tipos de células de tumor foi realizada por RT-PCR. Como mostrado na Figura 1, o ARNm SATB1 foi altamente expressa em uma variedade de cancros, incluindo cancro da mama, cancro do ovário, cancro da próstata, bem como o linfoma. Enquanto a linha de células epiteliais de próstata normais, PNT1A não expressaram ARNm SATB1.

A expressão de ARNm para SATB1 em diferentes linhas celulares foi determinada por RT-PCR. As linhas celulares de cancro da mama (MCF-7, CAMA-1, MDA-MB-134VI, MDA-MB-175VII, MDA-MB-361, DU4475, MDA-MB-231, MDA-MB-436, MDA-MB- 453 e MDA-MB-468), cancro da próstata (PC) linhas celulares (PC3, LNCaP e DU145), cancro do ovário (OC) linhas celulares (OVCAR-3 e SKOV-1), linhas de células de linfoma (Jeko-1 e L1236 ) e uma linha epitelial de próstata normal de células PNT1A foram incluídos como um controlo. Os resultados são representativos de três experiências independentes.

Indução de CTL específicos de péptidos SATB1 derivados de dadores saudáveis ​​

Primeiro, obtidos PBMC de 10 HLA-A * 02

+ dadores saudáveis ​​para determinar se precursores de células T reactivas SATB1-se presentes nesses indivíduos saudáveis. As células foram estimuladas

In vitro Compra de duas semanas, com cada um dos péptidos contendo derivados SATB1-HLA-A * 02 se ligam ao motivo (Tabela 1). No final da estimulação de péptidos, a partir de sobrenadantes das culturas foram analisados ​​por ELISA para detectar a libertação de IFN-γ em resposta a células T2 pulsadas com ou sem péptidos correspondentes. Como mostrado na Tabela 2, a quase totalidade dos 11 péptidos SATB1-derivados (10/11) foram capazes de induzir respostas de células T específicas do péptido em pelo menos um dos indivíduos saudáveis. Em particular, o péptido SATB1

565-574 induziu maior nível de libertação de IFN-γ ( 900 pg /ml) em 4 dos 10 indivíduos saudáveis, indicando a sua elevada imunogenicidade e potencial na expansão de células T específicas do antigénio em indivíduos saudáveis.

Presença de SATB1 derivados peptídicos CTLs específicos em pacientes com câncer

Nossa análise indicou que as células específicas do péptido T contra SATB1

565-574 foram encontrados em ~ 60% dos indivíduos saudáveis, nós, portanto, fundamentado que os precursores de CTL que poderiam reconhecer este péptido pode também ser abundante em PBMC de pacientes com câncer. Para testar a nossa hipótese, examinamos se peptídeo SATB1

565-574 poderia induzir CTLs específicas do péptido de PBMC de HLA-A * 02

+ pacientes com câncer ovariano. PBMC de três HLA-A * 02

+ pacientes com câncer ovariano foram recolhidos e estimulados

in vitro

com peptídeo SATB1

565-574. Como mostrado na Tabela 3, péptido SATB1

565-574 foi capaz de induzir CTL específicos do péptido a partir de PBMCs de doentes com cancro do ovário, o que indica que o péptido é altamente imunogénica não apenas em indivíduos saudáveis ​​mas também em pacientes com cancro. Também determinar se este candidato peptídeo poderia induzir CTLs específicas do péptido de PBMC de HLA-A * pacientes 02

+ do câncer de próstata. Como foi o caso com os pacientes de cancro do ovário, o péptido SATB1

565-574 CTL específicos de péptido-induzidos de forma semelhante a partir de PBMC de doentes com cancro da próstata, bem 5 (Tabela 3), indicando precursores de CTL que reconhecem este péptido são abundantes em CMSPs de cancro pacientes.

SATB1 derivado Peptide Induced CD8

+ T Responses dependente de células

Para analisar melhor SATB1

565-574 células T específicas do péptido, o próximo

565-574 células T expandidas SATB1 específicas do péptido identificadas nas Tabelas 2 e 3, a fim de se obter um número suficiente destas células. Para este fim, foram realizadas experiências de titulação de péptidos para determinar a concentração de péptido óptima para o carregamento de células T2 para o reconhecimento pelas células T. Como mostrado na Figura 2A, as células T2 podem ser sensibilizados pelo péptido SATB1

565-574 mas não um peptídeo controlo EBV para o reconhecimento das células T a uma concentração de 0,08 ug /mL, e os locais de ligação de HLA-A * 02 moléculas em T2 células ficou saturada a 5 ug /mL. Aumentando ainda mais as concentrações de SATB1

565-574 falhou para aumentar a produção de IFN-γ. Portanto, utilizou-se de forma consistente a concentração de péptido de 5 mg /mL para células T2 pré-carregamento nos ensaios ELISA. As células T expandidas mantida antigénio-especificidade e segregadas quantidades significativas de IFN-γ após estimulação com células T2 pulsadas com os péptidos correspondentes, mas não com um péptido de controlo EBV (Figuras 2A e B). Para se obter provas directas sobre os subconjuntos de células T que respondem representados na Figura 2B, os SATB1 PBMC péptido-reactivas expandidas foram esgotados, quer para

+ células T CD4 (Figura 2C) ou CD8

+ células T (Figura 2D ) antes da incubação com péptidos para os ensaios ELISA. Tal como mostrado na Figura 2E, CD8

+ células T, não

+ células T CD4 + (Figura 2F), obtidos a partir de PBMC expandidas respondeu a SATB1

565-574 células T2 pulsadas, indicando que a resposta de células T induzida pela SATB1

565-574 era dependente de CD8

células + T. Além disso, dimerX HLA-A * 02: Ig coloração (Figura 2G e H) e coloração intracelular IFN-γ (Figura S1) também demonstraram que SATB1

565-574 péptido específico induzida, HLA-A * 02 restringidos CD8

+ respostas dependentes de células T.

induzida CD8

+ T respostas dependentes das células. O reconhecimento de células T2 pré-carregado com concentrações tituladas de péptidos (0-20 ug /ml) por expandida SATB1 células específicos de 565-574

T a partir de dadores saudáveis ​​# 1 foi testado por ensaio ELISA (A). As PBMCs SATB1-reactivas expandidas (B) foram co-incubadas com células T2 (1 × 10

4 células /cavidade) sozinho em meio completo (CM), ou com células T2 pré-carregado com qualquer SATB1

565 -574 (5 ug /ml) ou um péptido de controlo EBV como um controlo negativo. As células foram incubadas durante 18-24 horas, a secreção de IFN-γ no sobrenadante foi determinada por ensaio de ELISA. PBMC SATB1 reactivos desprovidas de CD4

células + T (C) e PBMC SATB1 reactivos desprovidas de CD8

células + T (D) foram verificadas por citometria de fluxo. Os reconhecimentos de células T2 pulsadas com SATB1

565-574 por PBMC SATB1-reactivos quer depletados de CD4

+ células T (E) ou CD8

+ células T (F) foram determinados por ELISA. SATB1 reactivo CD8

+ células T foram incubadas com antigénios HLA-A2: Ig carregadas com um péptido de controlo EBV (L) ou com o péptido SATB1

565-574 (H), e depois coradas com anti-ratinho FITC de IgG1. As células foram analisadas usando um aparelho FACScalibur. Os dados (de A, B, E e F) são representados como média ± SD. Os resultados são representativos de pelo menos três experiências independentes. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001 versus controles (células T2 sozinho ou células T2 pulsadas com um controle EBV peptídeo).

Reconhecimento e morte de células cancerosas pelo SATB1 derivado peptídeo específico CD8

+ T células em uma HLA-I restrito Manner

com base em nossos resultados até agora,

565-574 CD8 específicas,

células SATB1 + T foram utilizados em experiências subsequentes. Para determinar se as células T específicas do péptido SATB1 derivados foram capazes de reconhecer e matar HLA-A * 02

+, SATB1 expressando-as células cancerosas, usamos uma HLA-A * 02

– cancro da próstata positivo mRNA SATB1 linha celular PC3 (como controlo negativo) e * 02

+ SATB1 ARNm linhas celulares de cancro positivo cinco HLA-a. A expressão de ARNm SATB1 nestas linhas celulares 6 foi anteriormente analisado por RT-PCR (Figura 1) e HLA-A * 02 expressão foi verificada por meio de citometria de fluxo (Figura 3A). Além disso, também verificada a expressão da proteína SATB1 entre estas linhas de células (Figura 3B), e descobriram que todas as linhas celulares de cancro da proteína expressa SATB1 excepto PC3 e de Ovcar-3. Portanto, OVCAR-3 foi também considerado como um controlo negativo. Como mostrado na Figura 4A, SATB1

sub 565-574 células T espec�icos poderia reconhecer * 02 células que expressam HLA-A

+ SATB1 Skov-1 e Jeko-1, mas não células PC3 ou OVCAR-3. Os outros dois HLA-A * 02

+ SATB1 expressando linhas celulares de cancro (CAMA-1, MDA-MB-231) só pode ser reconhecida quando foram pré-tratados com IFN-γ (Figura 4B), o que sugere que ambos reforçada HLA-a * 02 expressão na superfície das células (Figura S2) ou indução de immunoproteasomes por IFN-γ, pode facilitar a apresentação do epitopo correcta às superfícies celulares para o escrutínio de células T. Em contraste, as células normais, incluindo PNT1A e PBMC autólogos, não poderia ser reconhecido por células SATB1

565-574 espec�icos T (Figura 4A). Além disso, as células específicas SATB1-565-574

T não reconhecem in vitro Th diferenciadas, incluindo subconjuntos Th1, Th2 e Th17 (Figura S3).

(A) células foram coradas com FITC -anti-HLA-a * 02 em PBS contendo 2% de FBS. Em seguida, as células foram lavadas e re-suspensas em PBS e analisadas utilizando uma máquina FACScalibur. (B) A expressão de proteína SATB1 em várias células tumorais foi determinada por Western blot. Actina foi utilizado como um controlo de carga.

(A) SATB1

de células específicas T-565-574 a partir de um dador saudável # foram cultivadas em meio sozinho ou co-incubadas com vários tipos de tumores células, bem como as células normais (PNT1A e PBMC); (B) As células tumorais foram pré-tratadas com ou sem IFN-γ (10 ng /mL) durante 48 horas antes da incubação com SATB1 células T específicas de 565-574

. SATB1

565-574 específicos de células T foram cultivadas em meio isolado como controlo negativo (coluna vermelha); Para bloquear as respostas dependentes de HLA, quer anti-HLA-I mAb (W6 /32) ou HLA-II mAb foi adicionada a culturas de células durante a incubação de SATB1

sub células específicas T-565-574 com Skov-1 (C) ou Jeko-1 células (D). As células foram incubadas durante 18 -24 horas, a secreção de IFN-γ no sobrenadante foi determinada por ensaio de ELISA. SATB1

565-574-CD8 específicas,

+ células T foram testadas quanto à citotoxicidade contra células T2 pulsadas com ou sem péptidos (E), Skov-1 (F) e Jeko-1 (g) pelo ensaio de LDH. * 02 células PC3 negativos para HLA-A foram usadas como um controlo negativo no ensaio de LDH. Dados de A-G são representados como médias ± DP. Os resultados são representativos de três experiências independentes. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P

. 0,001 versus controlos

para determinar se as células do reconhecimento de células cancerosas, SATB1

565-574 específicos CD8

+ T foi HLA-I restrito, nós co-cultivadas

565-574 células T SATB1 espec�icos, quer com Skov- 1 ou Jeko-1 células na presença de ambos HLA-I anti-Acm (W6 /32) ou anti-HLA-II mAb. Tal como mostrado na Figura 4C e D, as respostas das células T foram completamente inibida pela adição de I de HLA anti-mAb, mas não anti-HLA-II (HLA-DP mAb), o que sugere que o reconhecimento de células de tumor por SATB1

+ células T sub> 565-574 específicos CD8

para examinar melhor se SATB1

565-574 específicos CD8

+ células T foram capazes de matar HLA-A * 02

+, SATB1-expressando células de cancro, foram realizados ensaios de citotoxicidade. Tal como mostrado na Figura 4E, SATB1 células T específicas para 565-574

matou as células T2 pulsadas com SATB1

565-574, mas não células T2 pulsadas sozinho ou aqueles com um péptido de controlo EBV. Importante, SATB1

células específicas-565-574 T foram capazes de matar HLA-A * 02

+, SATB1 expressando células Skov-1 e Jeko-1, mas não HLA-A * 02

– PC3 células (Figura 4F e G). Estes resultados sugerem que

565-574 células T espec�icos SATB1 reconhecer um epitopo de célula T que é endogenamente processados ​​e apresentados por células tumorais.

Discussão

É bem estabelecido que CD8 células

+ T desempenham um papel crítico no controle de desenvolvimento e progressão do tumor. epítopos peptídicos derivados de TAA podem ser reconhecidos como antigénios pelas células T no contexto de moléculas MHC-I [40], [41]. Identificação de TAAs ideais e os seus péptidos que são reconhecidos pelas células T é essencial para o desenvolvimento de vacinas contra o cancro eficazes. Os TAAs ideais, tais como proteínas anti-apoptóticas [14], a telomerase [12] e survivina [13], sendo obrigatório para o crescimento do tumor /sobrevivência, podem representar alvos ideais para vacinas de imunoterapia mediada cancro. SATB1 é altamente expressa em muitos tipos de cancros humanos e a sobre-regulação da expressão SATB1 é essencial para a sobrevivência de tumores e metástase, assim SATB1 representa um desses TAAs ideais.

O objectivo do presente estudo foi o de identificar HLA -A * 02 de ligação epítopos SATB1 derivados reconhecidos por células CD8 +

T em PBMC de indivíduos saudáveis ​​e pacientes com câncer. Doze SATB1 péptidos derivados foram previstas usando BIMAS, SYFPEITHI, e Rankpep com base no motivo de ligação a HLA-A * 02. Os péptidos que foram previstos pelo menos dois de três programas foram seleccionados para posterior teste quanto à sua capacidade para estimular PBMC de indivíduos saudáveis ​​e /ou em pacientes com cancro. Estudos adicionais mostraram que 10 dos 11 péptidos sintetizados SATB1 derivados foram capazes de induzir respostas de células T específicas do péptido em pelo menos um dos 10 indivíduos saudáveis. Especificamente, SATB1

565-574 foi encontrada para induzir um nível mais elevado de libertação de IFN-γ ( 900 pg /ml) em 4 dos 10 indivíduos saudáveis, indicando que este péptido pode ser imunogénica e, potencialmente capaz de se expandir antígeno células T específicas em indivíduos saudáveis. Além disso, SATB1

565-574 induziu respostas de células T específicas frequentemente em PBMC de doentes com cancro do ovário, bem como em PBMC de doentes com cancro da próstata. Importante,

565-574 células T específicas do péptido SATB1 reconhecidas e mortas HLA-A * 02

+ SATB1-expressando Jeko-1, células Skov-1, bem como de IFN-y-tratados linhas celulares de cancro da mama ( CAMA-1 e MDA-MB-231), sugerindo que este péptido é processado naturalmente por células cancerosas.

SATB1 é um factor organizador cromatina global e de transcrição e emergiu como um factor chave integrando arquitectura da cromatina de ordem superior com regulação genética [42]. SATB1 promove o crescimento de tumores e metástases através da reprogramação de perfis organização da cromatina e de transcrição, e é altamente expressa em uma variedade de cancros, incluindo cancro da mama [18], carcinoma de células escamosas da laringe [19], do cancro endometrial endometrióide [20], o carcinoma hepatocelular [21] , cancro rectal [22], o melanoma cutâneo maligno [23], o cancro gástrico [24], [25], do cancro do ovário [26], o cancro da próstata [27], o cancro do pulmão [28] e glioma [29]. Nas células de tumor com níveis elevados de SATB1, genes que promovem a progressão do tumor e metástases foram regulados positivamente, ao passo que os genes que inibem a metástase do tumor foram reprimidos [17]; ao mesmo tempo silencia de SATB1 reduziu muito a capacidade invasiva e metastática de células de câncer [43].