Sumário

Dados Acumulando indicam que as células-tronco do câncer contribuir para chemoresistance tumor e sua persistência altera a evolução clínica. O nosso estudo anterior demonstrou que o cancro do ovário pode ser iniciada por células de cancro do ovário (iniciando OCIC) caracterizado por o antigénio de superfície CD44 e c-kit (CD117). Tem sido demonstrado experimentalmente que um microRNA, nomeadamente o miR-193a, tem como alvo o ARNm de c-kit para a degradação e pode desempenhar um papel crucial no desenvolvimento do cancro do ovário. Como miR-193a é regulada é mal compreendida ea imagem que surge é complexa. Para desvendar essa complexidade, é proposto um modelo matemático para explorar como estrogênio mediada por aumento da regulação de outro alvo de miR-193a, ou seja, E2F6, pode atenuar a função de miR-193a em duas formas, uma através de um concurso de E2F6 e c transcrições -KIT para miR-193a e segunda pela ligação da proteína E2F6, em associação com um complexo Polycomb, ao promotor de miR-193a para regular negativamente a sua transcrição. O nosso modelo prevê que este controlo bimodal aumenta a expressão de c-kit e que o segundo modo de regulação epigenética é necessária para gerar um comportamento de comutação em expressões de c-kit e E2F6. Análise adicional do conjunto de dados do cancro do ovário TCGA demonstra que os doentes com cancro do ovário com baixa expressão de EZH2, uma proteína da família Polycomb-grupo, mostram correlação positiva entre E2F6 e c-KIT. Nós conjecturar que uma inibição EZH2 simultânea e terapia anti-estrogénio pode constituir uma estratégia terapêutica combinada eficaz contra o câncer de ovário

Citation:. Cheng FHC, Aguda BD, Tsai JC, Kochańczyk M, Lin JMJ, Chen GCW, et ai. (2014) um modelo matemático de Bimodal Controle epigenética de miR-193a em células-tronco do cancro do ovário. PLoS ONE 9 (12): e116050. doi: 10.1371 /journal.pone.0116050

Autor: David Wai Chan, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 22 de setembro de 2014; Aceito: 30 de novembro de 2014; Publicação: 29 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Cheng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por bolsas de investigação do Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan (NSC102-2320-B-194-006, NSC102 -2115-M-194-007-MY2, MOST103-2911-I-194-504 e MOST103-2320-B-194-002), Centro Nacional de Ciências teóricas (NCTS), e Chung Cheng Universidade Nacional (NCCU Ciência Interdisciplinar conceder 103-03), Taiwan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Co-autor Baltazar D. Aguda é empregado por DiseasePathways LLC. DiseasePathways LLC forneceu apoio sob a forma de salário por autor BDA, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. O papel específico deste autor é articulada na seção “autor contribuições”

Conflito de interesses:. Co-autor Baltazar D. Aguda é empregado por DiseasePathways LLC. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de ovário é a neoplasia maligna ginecológica mais letal ea quinta maior causa de morte por câncer entre mulheres [1]. Como o cancro do ovário tem poucos sintomas precoces no seu curso, a maioria dos pacientes são diagnosticados com fases tardias (III e IV) da doença. A taxa de sobrevida em 5 anos é geralmente inferior a 20% para pacientes com doença em estágio avançado, apesar dos avanços terapêuticos, enquanto que a taxa de sobrevivência para pacientes com estágio I ou II da doença é superior a 80% para o mesmo período [2]. Embora quimioterapêuticos correntes demonstram uma taxa de resposta completa mais do que 90% em tumores em fase precoce, apenas uma taxa de resposta parcial 20-30% pode ser observada em tumores avançados, bem como em tumores que recidivaram de quimio-resistentes [3]. Uma melhor compreensão das alterações moleculares de carcinogénese do ovário pode levar a melhores estratégias terapêuticas para esta doença mortal.

Uma hipótese emergente afirma que o cancro surge a partir de uma pequena população de células cancerosas iniciar auto-renovação (CIC) [4 ]. Estes CICs são pensados ​​para possuir potencial tumorigénico e resistência aos medicamentos reforçada dentro de um tumor, e são capazes de repovoar as colónias de tumor

in vivo

. CICs ovarianos Temos isoladas anteriormente (OCICs) de pacientes com câncer ovariano [5]. Estes OCICs exibem maior resistência aos medicamentos no sentido de cisplatina e taxol, e são caracterizados pela expressão de vários marcadores de superfície celular, incluindo c-KIT (CD117, ou factor das células estaminais do receptor). No entanto, o mecanismo de como surgem OCICs e como estes marcadores de superfície celular são transcricionalmente controladas não são completamente compreendidos.

O estrogénio é um regulador importante do crescimento e diferenciação em ovários normais [6] e está envolvida no desenvolvimento de cancro do ovário [7]. A este respeito, estudos têm explorado o risco de cancro do ovário em mulheres utilizando a terapia de substituição hormonal (HRT), no tratamento dos sintomas da menopausa [8], [9], [10]. Por exemplo, um estudo envolvendo um milhão de mulheres sugeriu que as mulheres tratadas com TSH foram associadas com um risco aumentado de cancro do ovário [11]. No entanto, o papel do estrogénio na carcinogénese do ovário não é totalmente compreendido.

Epigenetic modificações no genoma desempenham um papel crucial no controlo da transcrição e da modificação epigenética aberrante agora é considerada uma característica do cancro [12]. modificações epigenéticas são responsáveis ​​pelo controle expressão dos genes que permitem fenótipos específicos [13], [14]. Entre eles, a metilação do ADN é um dos mais modificação epigenética caracterizado que ocorre na posição 5 ‘da citosina em dinucleótidos CpG que resultam na formação de 5-metilcitosina. metilação de ADN que ocorre nos aglomerados de locais CpG (denominadas ilhas CpG) na região promotora de um supressor de tumor gene resulta na repressão da transcrição e da tumorigénese em alguns casos [15]. Também considerado como reguladores cruciais da expressão do gene, miRs são referidos como supressores de tumor miRs-se que regulam a expressão de um oncogene [14]. Estudos descobriram que supressores de tumor-miRs são frequentemente regulados negativamente por mecanismos genéticos que conduzem a epigenética ou a sobre-regulação de oncogenes e de aceleração da tumorigénese [16]. Por exemplo, o miR-34b /c (que reside no promotor ilha CpG de um gene) foi encontrado para ser epigeneticamente silenciado por metilação do DNA em células de cancro metastáticas [17]. Re-expressão de miR-34b /c suprimida invasão do cancro

in vitro

e

in vivo

.

Estamos interessados ​​em miR-193a, que está localizado no cromossomo 17q11. 2 e incorporado numa ilha CpG. Estudos descobriram que miR-193a foi epigenetically silenciado por hipermetilação do promotor na leucemia mielóide aguda (AML) e câncer de pulmão [18], [19]. Importante, miR-193a tem como alvo o marcador de células estaminais, c-kit, para repressão no LMA [18], [20]. Outro alvo confirmada experimentalmente de miR-193a é E2F6 [21]. -Regulação de E2F6 tem sido observada em células de cancro da mama por tratamento com estrogénio [22]. Dentro da família E2F de factores de transcrição que estão envolvidas no controlo do ciclo celular, através da activação da transcrição ou da repressão [23], E2F6 foi encontrado para ser um repressor de transcrição capaz de se associar com a histona-lisina N-metiltransferase de EZH2, que é um componente importante de Polycomb o complexo de [24], [25], e com ADN metil-transferase DNMT3B, permitindo o seu recrutamento para o complexo repressor [26].

à medida que o papel de miR-193a no cancro do ovário é actualmente desconhecida , nossa hipótese de que a proteína E2F6 pode suprimir a expressão de miR-193a, tanto diretamente como um repressor da transcrição de ligação de DNA e indiretamente através da promoção do conjunto complexo Polycomb. De facto, a existência de locais de ligação para a proteína E2F6 no promotor de miR-193a tal como demonstrado por dados do chip-Seq ENCODE [27] parece sugerir que a supressão de longo prazo de miR-193a por E2F6 pode levar ao silenciamento epigenético de miR -193a. Estes eventos podem conduzir à sobre-regulação de c-kit e desencadear o aparecimento do fenótipo OCIC, promovendo, assim, a carcinogénese do ovário. Neste estudo, utilizamos um modelo matemático para explorar os meandros desse controle epigenético de miR-193a, que pode vir a ser significativa, uma vez que prevê um comportamento de comutação no c-kit que pode ser fundamental para a carcinogênese de ovário.

Materiais e Métodos

cultura celular

de células de cancro do ovário A2780 linha foi propagada em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com FBS a 10%, e 50 unidades /ml de penicilina /estreptomicina. A célula foi incubada a 37 ° Cwith 5% de CO

2.

Clonagem de miR-193a expressando vetor

As sequências que transcrevem o miR-193a pré-miARN foi amplificado por PCR usando iniciadores específicos F: 5′-CGCGGATCCAGTTTCTCGGCGCATAACTC-3 ‘e R: 5′-CCCAAGCTTCGCTATTTCTCCAGCGAAGTG-3’, utilizando ADN genómico de células que expressam Iosé miR-193a. Os produtos de PCR foram ligados em yT um vector de clonagem (Yeastern Biotech, Taiwan) para confirmação da sequenciação. miR-193a-yT A foi digerido com BamH I e Hind III e inserido no local de clonagem múltipla de p

Silenciador

4,1-CMV vector de expressão Puro siARN, que foi pré-digerido com BamHI e HindIII

.

extracção de RNA e RT-PCR quantitativo

extracção de RNA foi realizada usando o reagente TRIzol (Invitrogen de Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Para remover o ADN de contaminação potencial do ADN complementar, 1 ug de ARN total foi tratado com ADNase I (amplificação Grau, Invitrogen) antes da transcrição reversa. RNA foi, em seguida, utilizando iniciadores aleatórios (por c-KIT ou expressão E2F6) ou kit de transcrição reversa TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) transcrito reversa. Quantitativa em tempo real de RT-PCR foi então realizada utilizando ABI StepOne em tempo real do sistema de PCR (Applied Biosystems). Primers estão disponíveis mediante solicitação. A expressão relativa de miR-193a, c-KIT e E2F6 foi calculado usando o método Ct comparativa.

Resultados

miR-193 alvos c-KIT e E2F6

Para investigar a relação entre o miR-193a e c-kit /E2F6 em cancro do ovário (Fig. 1A), que sobre-expressa o miR-193a em células de cancro do ovário A2780, que têm baixos níveis de expressão de miR-193a. Expressão de miR-193a resultou numa regulação negativa significativa de ARNm de c-Kit e E2F6 ARNm, sugerindo, assim, que o ARNm de c-kit e E2F6 ARNm são alvos de miR-193a em células de cancro do ovário (Fig. 1B).

(a) diagrama esquemático do c-KIT e E2F6 mRNA mostrando sítio de ligação previsto miR-193a na sua 3’UTR. As sequências de ligação detalhados (MRE) desses sites também são mostrados junto com alinhamentos de sequências de miRNA. (B) a análise qPCR de miR-193a, c-KIT e E2F6 nas células de cancro do ovário A2780. Superexpressão de miR-193a em células A2780 leva a infra-regulação de c-KIT e E2F6 mRNAs.

equações do modelo

As interações entre os componentes do miR-193a-E2F6- c-kit módulo de regulação são mostrados na Fig. 2A. acoplamento apertado dos componentes da rede e da cinética não linear potenciais pode dar origem a dinâmica do sistema complexos, que podem ser entendidos com a ajuda de um modelo matemático. Em nosso modelo cinética (Fig. 2B) há seis componentes, que representam: miR-193a (

R

m), mRNA E2F6 (

R

e), c-KIT mRNA (

R

c), o complexo de miR-193a com mRNA E2F6 (

R

em), complexo de miR-193a com c-KIT mRNA (

R

mc), e proteína E2F6 (

P

). As equações de ação em massa químicos para a respectiva concentração destas moléculas ou complexos,

R

m,

R

e

R

c,

R

em

R

mc, e

P

, estão demonstrados a seguir: (1) (2) (3) ( 4) (5) (6)

(a) Activação de sinalização do receptor de estrogénio (ER) podem aumentar o aumento da transcrição de E2F6 que pode, subsequentemente, aumentar a expressão de c-kit por meio de miR-193a mediada mecanismo cerna . Por outro lado, para além de repressor de transcrição, E2F6 pode levar ao silenciamento epigenético do promotor de miR-193a resultante da sobre-regulação de c-kit. A descrição de cada número da via está listado na Tabela S1. (B) A interacção bioquímica para esta rede reguladora miR-193a proposto. Modelo variáveis ​​nomes de espécies de moléculas também são dadas.

Aqui, a taxa de associação de miR-193a-E2F6 mRNA é

k

1 e associação taxa de miR-193a mRNA c-KIT é

k

2; a taxa de dissociação de complexos de miR-193a-E2F6 mRNA é

k

m1 e miR-193a-c-KIT mRNA é

k

m2; a taxa de tradução de proteína E2F6 é

k

3; a taxa de transcrição de miR-193a é

k

4, de E2F6 mRNA é

k

5 e de mRNA c-kit é

k

6; a taxa de degradação de miR-193a é

δ

m, de mRNA E2F6 é

δ

e, de c-KIT mRNA é

δ

c, de miR-193a E2F6-mRNA é

δ

em, e de miR-193a-c-KIT mRNA é

δ

mc ea taxa de degradação de E2F6 proteína é

δ

p; ea força da inibição da transcrição miR-193a pela proteína E2F6 é indicado como

K

4.

O primeiro termo do lado direito da Eq. (1) corresponde à seta 9 da fig. 2A expressando a inibição da transcrição de miR-193a por, principalmente, a proteína E2F6, mas também por Polycomb actividade de proteínas complexas. O valor do parâmetro

K

4 visa, assim, explicar tanto a repressão da transcrição direta pelo E2F6 e para o silenciamento gênico de longo prazo realizado por e dependente dos níveis de EZH2 e DNMT3B. (A concentração de E2F6 é uma variável do modelo dinâmico, enquanto os níveis de proteínas Polycomb essenciais, que não são explicitamente presente em equações do modelo, não estão sujeitos à regulamentação do módulo e seus níveis são considerados constantes, pelo menos na escala de tempo módulo de equilíbrio .) o segundo, respectivamente, terceiro termo () no lado direito da Eq. (1) representa a taxa de libertação de miR-193a a partir do complexo com ARNm E2F6 (respectivamente, com o complexo de c-kit de ARNm). Interacções com as setas correspondentes 6 e 7 na Fig. 2A, que expressam ARNm de formação do complexo híbrido, são indicados, respectivamente, por o quarto e o quinto termo no lado direito da Eq. (1). O último termo na Eq. (1) é uma primeira ordem termo degradação miR-193a.

A taxa de transcrição do gene E2F6 constitutiva (seta 1 na Fig. 2A) é

k

5 (Eq. (2)). Esta taxa depende do nível de estimulação hormonal e, como nosso modelo descreve simplificado regulação em células de ovário, vamos associar diretamente

k

5 com o nível de estrogênio. O segundo termo na Eq. (2) representa a libertação de ARNm E2F6 do complexo com miR-193a, enquanto que o terceiro termo é a taxa da reacção de ligação oposto. O último termo na Eq. (2) é uma degradação de ARNm E2F6. Os termos no lado direito da Eq. (3) são análogos. O primeiro termo na Eq. (4) representa a taxa para a ligação do ARNm e E2F6 miR-193a. O segundo termo na Eq. (4) representa a reação oposta, eo terceiro termo representa a degradação da

R

em. Os termos no lado direito da Eq. (5) são análogos. A última equação é responsável por tradução E2F6 (seta 8 na Fig. 2A) e degradação.

estados estacionários

estados estacionário dar o comportamento a longo prazo do sistema. Os estados estáveis ​​de sistema (1) – (6) pode ser obtido igualando os lados direitos das equações a zero. Vamos

S

= (

R

m,

R

e

R

c,

R

em

R

mc,

P

), ser qualquer estado estacionário de sistema (1) – (6). O estado estacionário

S

satisfaz as seguintes equações (7) (8) (9) (10) (11) (12), onde

e (13)

Notamos que uma vez que

R

m é determinado pela Eq. (12), em seguida, os outros componentes do estado estacionário

S

pode ser determinada por equações. (7) – (11). Daí a condição para a existência do estado estacionário

S

é que

k

4 encontra-se em

h

[0, ∞), a faixa da função

h

. Estamos interessados ​​na interrupção limiar ou de comportamento do sistema (1) – (6), particularmente em comutação da expressão de ARNm de c-kit. Assim, as condições sobre os parâmetros para a existência de múltiplos estados estacionários são relevantes. Aqui nós damos um critério para a existência de três estados estacionários do modelo da seguinte forma: (14) (15), onde é o valor máximo de no intervalo [0, ∞), e é dada por

a prova para o critério (14) -. (15) é dada no texto S1

o estado estacionário Bifurcação Diagram na (

k

5,

R

c) plano

Tendo em conta as equações. (7) – (8), os estados estacionários de

R

e e

R

aumento c ou diminuição na mesma direção. Esta previsão do modelo é consistente com a hipótese de Cerna [28], [29] que a expressão de E2F6 correlaciona-se positivamente com a de c-KIT.

Como mencionado antes,

k

5 é um parâmetro controlável associada experimentalmente com a adição de hormonas (por exemplo, estrogénio), e

K

4 é uma medida da eficiência de inibição de, principalmente, proteínas E2F6 contra miR-193a. Como veremos na discussão abaixo, a interação entre

k

5 e

K

4 pode gerar uma expressão excessiva de mRNA c-KIT. Assim, seria interessante ver a dependência do estado estacionário no parâmetro

K

5 para diferentes valores de

K

4 – isto é mostrado na Fig. 3. Este diagrama é referido como um “diagramas de bifurcação de estado estacionário”, e

k

5 é referido como um parâmetro de bifurcação. Para gerar as curvas experimentais semelhantes aos mostrados na Fig. 3, pode-se projetar um experimento no qual as células são cultivadas em diferentes concentrações de estrogênio e, em seguida medir os níveis de mRNA de longo prazo.

A dependência dos estados estacionários da variável

R

c (nível de RNA de c-KIT) no parâmetro

k

5 (taxa de transcrição de E2F6) para valores de diferença do parâmetro

K

4 (eficiência de inibição de E2F6). O valor dos parâmetros estão listados na S2 texto.

Com os parâmetros que satisfaçam Eq. (14) – (15), o modelo prediz que existe uma gama de

K

5 para os quais o sistema admite três coexistentes estados estáveis. Por exemplo, para

K

4 = 0,0001 (ou seja, uma menor eficiência de inibição; A Fig. 3, linha verde) e

k

5 está entre 0,0556 e 0,1585, o modelo dá três estados estacionários (dos quais o alto

R

C e a baixa

R

c estados são estáveis; ver a curva associada a

K

4 = 0,0001 na Fig. 3). A importância do joelho direito em um diagrama de bifurcação steady-state reside no seguinte fato: como o parâmetro de controle

k

5 é o aumento do valor baixo para cima através do valor crítico

k

5

R associado com o joelho direito, o correspondente nível de estado estacionário de

R

c vai aumentar e, devido à instabilidade (respectivamente, estabilidade) dos estados estacionários no ramo médio (respectivamente, o ramo superior) no diagrama de bifurcação steady-state, o sistema irá saltar para o estado estacionário no ramo superior ao valor crítico

k

5

R e, em seguida, ficar no ramo superior (ver Fig. 3). Há uma diferença acentuada nos níveis de mRNA c-KIT entre os estados estáveis ​​de

R

c nos ramos inferiores e superiores no diagrama de bifurcação steady-state, que sugerem o câncer fenótipo de promoção excessiva expressão de mRNA c-kit para

k

5

k

5

R. Por outro lado, se se está inicialmente no estado estacionário sobre o ramo superior, que está associada com a sobre-expressão de ARNm de c-KIT, pode-se diminuir o

K

5 para reduzir o valor constante nível de estado de

R

c. Além disso, se a pessoa continua a diminuir o

k

5 valor abaixo do valor crítico

k

5

Lassociated com o joelho esquerdo, então o nível de estado estacionário correspondente de

R

c diminuirá e, devido à instabilidade (respectivamente, estabilidade) dos estados estacionários no ramo médio (respectivamente, o ramo inferior) no diagrama de bifurcação steady-state, o sistema descerá para o estado estacionário no ramo inferior ao valor crítico

k

5

L (ver Fig. 3). Isso seria recuperar o nível de mRNA c-KIT normal.

Para resumir, o modelo prevê que existe um valor limite

k

5

R (respectivamente,

k

5

L) na taxa de transcrição

k

5 para as células para ativar (respectivamente, desligue) a expressão da OCIC marcador c-KIT. Por isso, é importante ajustar a taxa de transcrição

k

5 a afetar a expressão da OCIC marcador c-KIT.

Significado do parâmetro

K

4

Apesar de diminuir o valor de

k

5 (associados ao nível de estrogênio baixo) pode reduzir a expressão do marcador OCIC c-KIT, alguma evidência clínica sugere que o anti terapia -estrogen é apenas parcialmente eficaz no tratamento de cancro do ovário [30], [31]. O modelo sugere que isso pode ser devido à inibição da expressão de miR-193a pela proteína E2F6 como refletido no valor do parâmetro

K

4 do primeiro termo do lado direito da Eq . (1). Este termo é motivado pelo facto de a expressão de miR-193a depende da actividade supressora da transcrição de proteína E2F6 (relacionado com o nível de EZH2 e DNMTs). Em particular, a inibição suficientemente forte (suficientemente grande

K

4) conduziria a um silenciamento de mais longo prazo da expressão do miR-193a por metilação de ADN (ver Eq. (1)), e assim implicaria a sobre-expressão de ARNm de c-kit; enquanto que para o caso extremo

K

4 = 0, o sistema (1) – (6) só pode suportar no máximo um estado de equilíbrio (veja S1 texto), o que implica a não-existência do joelhos direito e esquerdo no diagrama de estado estacionário e perda do interruptor bi-estável.

Vamos

k

5

b denotam a constante da taxa de transcrição basal do mRNA E2F6. No que se segue, dependendo da interação entre o

k

5

b e

K

4, iremos descrever dois cenários em que o segundo corresponderia para a observação clínica de que a terapia anti-estrogénios são apenas parcialmente eficazes no tratamento de cancro do ovário [30], [31].

em células com baixa eficiência de inibição de E2F6 (isto é, uma menor

K

4), com o parâmetro

k

5 é aumentada de

k

5

b para

k

5

2 (linha sólida vermelha na Fig. 4A), o estado estacionário de

R

c vai primeiro passar de

L

0

L

1 através do ramo inferior, e, devido à instabilidade dos estados estacionários no ramo meio, interruptor de

L

1 a

U

1 no ramo superior, e, finalmente, mover ao longo do ramo superior ao

U

2. Por outro lado, como o parâmetro

k

5 é diminuída de

k

5

2

k

5

b (linha sólida azul na Fig. 4A), o estado estacionário de

R

c vai primeiro passar de

U

2

U

0 através do ramo superior e, devido à instabilidade dos estados estacionários no ramo do meio, em seguida, mudar de

U

0

T

0 no ramo inferior, e, finalmente, voltar para

L

0. Daí para a baixa eficiência de inibição de E2F6 (isto é, baixa

K

4) e constante pequena taxa basal (ie, pequena

k

5

b), além de estrogénio pode activar a sobre-expressão de ARNm de c-KIT, enquanto que a retracção do estrogénio pode desligar a sobre-expressão de ARNm de c-Kit e tornar as células recuperar o nível de ARNm de c-KIT normal.

a dependência dos estados estacionários da variável

R

c (nível de RNA de c-KIT) no parâmetro

k

5 (taxa de transcrição de E2F6) para diferentes valores de

K

4: (A)

K

4 = 0,1 (ou seja, baixa eficiência de inibição de E2F6), (B)

K

4 = 1 (ou seja, alta eficiência na inibição de E2F6). A linha de seta vermelha e azul indica mudanças abruptas do estado constante de

R

c com pelo diferente

k

5

valores que a seguir indicados. O valor dos parâmetros estão listados na S2 texto.

Em células com alta eficiência de inibição de E2F6 (ou seja, um maior

K

4), com o parâmetro

k

5 é aumentada de

k

5

b para

k

5

2 (linha sólida vermelha na Fig. 4B), o estado estacionário de

R

c vai primeiro passar de

L

0

L

1 através do ramo inferior, e, devido à instabilidade dos estados estacionários no ramo meio, interruptor de

L

1 a

U

1 no ramo superior, e, finalmente, mover ao longo da ramo superior ao

U

2. Por outro lado, como o parâmetro

k

5 é diminuída de

k

5

2

k

5

b (linha sólida azul na Fig. 4B), o estado estacionário de

R

c vai primeiro passar de

U

2

U

0 através do ramo superior e, devido ao fato de que

k

5

b é a constante da taxa de transcrição basal do mRNA E2F6 e

k

5

b é maior do que o

k

5 componente do ponto joelho esquerdo, em seguida, tem de parar em

U

0, que é o estado associado com a sobre-expressão de ARNm de c-kit. Daí em alta eficiência de inibição de E2F6 (ou seja, um maior

K

4) e grandes constante da taxa basal (ie, grande

k

5

b), retracção de estrogénio não atenua a expressão de ARNm de c-kit. Nós fazer uma observação importante: para suficientemente grande

K

4, o

k

5 valor associado com o joelho esquerdo está muito próximo de zero. Daí para suficientemente grande

K

4, que caberia a situação descrita neste parágrafo. Isto sugere que, para suficientemente grande

K

4, retração de estrogênio não pode desligar sobre-expressão de mRNA c-KIT, o que é consistente com a observação clínica acima mencionado.

Validação de o modelo em TCGA câncer de ovário dataset

à luz do modelo acima, fundamentado que, em pacientes com cancro do ovário com baixa EZH2 (isto é, baixa

K

4), aumento de E2F6 mRNA (que resulta de um aumento da taxa de transcrição de E2F6,

k

5) pode induzir a expressão de mRNA c-KIT (

R

c), por meio de miR mediada por -193a mecanismo Cerna. No entanto, essa correlação pode não existir em pacientes com alta EZH2 (ou seja, alta constante de inibição de E2F6 para miR-193a,

K

4) como miR-193 é epigenetically silenciados. Para fornecer um suporte independente para esta hipótese, analisamos os dados de microarrays expressão em TCGA dataset cancro do ovário [32]. Curiosamente, os pacientes com cancro do ovário com EZH2 nível baixo mostram uma correlação positiva entre a expressão de E2F6 e c-kit (Fig. 5A). Análise de um outro conjunto de dados de microarray em cancro do ovário (GDS2785) também demonstrou um fenómeno semelhante (S1 Fig.). No entanto, essa relação não se observa em pacientes com elevado EZH2 (Fig. 5B e Fig S1.) Ou na correlação entre E2F6 e um alvo não-miR-193a (S2 Fig.). Tomados em conjunto, este fenômeno é consistente com nossa previsão (Fig. 3) que mRNA de E2F6 e c-KIT demonstra uma relação Cerna em baixa

K

4.

Os dados microarray Expression a partir de 568 pacientes com cancro do ovário são classificados de acordo com o nível de expressão de EZH2. O gráfico de dispersão demonstra a correlação entre o nível de expressão de E2F6 e c-KIT em doentes com cancro do ovário com (A) baixo EZH2 (parte inferior 12,5%) e (B) de alta EZH2 (12,5 topo%). R e P-valor da correlação de Pearson são mostrados. Curiosamente, como previsto pelo modelo, os pacientes com baixo EZH2 mostra uma correlação positiva de E2F6 e c-kit (A, R = 0,322, P 0,005). Tal correlação não é observado em pacientes com EZH2 alta (B, R = 0,2148 P . 0,05). No entanto, os pacientes com elevada EZH2 pode ainda ser separado em 2 sub-grupos com base no valor da mediana de c-kit (alto cor, vermelho, baixa, cor azul). Nenhum destes subgrupos demonstra uma correlação positiva entre E2F6 e c-KIT.

Discussão

O nosso modelo matemático postula a existência de um controle epigenético bimodal de miR-193a no ovário carcinogênese. Em células com baixa eficiência de inibição de E2F6, existe uma relação entre ~linear transcrição de E2F6 e ARNm de c-kit, o que sugere uma relação entre estes cerna 2 genes. Nesta hipótese cerna [28], [29], os 3’UTRs de vários mRNAs conter o elemento de ligação de miR-(s) (MRE) e, por conseguinte competir pela ligação com o MIR. Teoricamente, uma miR pode ser controlada por ambos epigeneticamente hipermetilação do promotor e a sua cerna de uma forma bimodal.

É também digno de nota de salientar que esta relação cerna é um evento reversível, de tal modo que a retracção de estrogénio, que resulta em menor expressão de E2F6, podem reduzir a expressão de c-kit (Fig. 6, painel superior). Tal fenómeno pode ser observado em células epiteliais do ovário normais ou células do cancro do ovário em que a eficácia de inibição E2F6 é baixa. Com efeito, os componentes de repressores da transcrição, tais como EZH2 que é necessária para a supressão transcricional de E2F6 se encontra a ser baixa em células normais de ovário e um sub-conjunto de cancro do ovário [33], [34]. Importante, este também é consistente com a evidência clínica de que a expressão de E2F6 e c-KIT são correlacionados em doentes com cancro do ovário com baixa expressão de EZH2 mas não em casos de alta expressão de EZH2.

Sob a condição de baixa EZH2 e expressão DNMT3B (painel superior, como indicado pela cor azul e vermelho claro), E2F6 só leva a uma supressão mínima de miR-193a (isto é, baixa

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4) e a relação entre E2F6 e c-Kit exibe uma relação cerna. Como resultado, a quantidade de c-Kit nas células de cancro do ovário depende da quantidade de estrogénio (esta informação é mediada pelo nível de E2F6). Pelo contrário, sob a condição de alto nível de EZH2 e DNMT3B expressão (painel inferior, como indicado pela cor azul e vermelho escuro), E2F6 exerce uma elevada eficiência de inibição (isto é, elevado

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4 ). incremento ligeira dos resultados E2F6 no silenciamento epigenético de miR-193a e, subsequentemente, uma sobre-expressão do c-kit. Sem miR-193a, as células podem ser “bloqueado” em um estado de alta c-kit resultando na carcinogénese do ovário.

No entanto, em células com elevada eficiência de inibição de E2F6, o nosso modelo prevê uma não altamente relacionamento -linear entre a expressão de E2F6 e c-KIT. Sob a condição de baixo nível de expressão E2F6, segue-se uma relação entre cerna E2F6 e c-KIT. No entanto, a expressão elevada de E2F6 em conjunto com elevada expressão do repressor de transcrição, tais como EZH2, E2F6 pode levar ao silenciamento epigenético da expressão de miR-193a através trimetilada H3K27 e metilação de ADN (Fig. 6, painel inferior). 3 e fig.