Sumário

receptor específico de células fotorreceptoras (PNR /NR2E3) é um receptor nuclear, órfão, que desempenha um papel crucial no desenvolvimento e manutenção da retina de fotorreceptores. As mutações causadoras de doenças em PNR ter um efeito pleiotrópico resultando em diferentes doenças da retina. Recentemente, o PNR tem sido implicado no controlo de funções celulares nas células cancerosas. PNR foi relatado para ser um novo regulador de expressão ERa em células de cancro da mama e expressão correlaciona-se com elevada PNR resposta favorável a um tratamento com tamoxifeno. Além disso, o PNR foi mostrada para aumentar a estabilidade de p53 em células HeLa, o que implica que o PNR pode ser um alvo terapêutico neste e em outros cancros que retêm um gene de tipo selvagem de p53. Para facilitar ainda mais a compreensão das funções PNR no cancro, que caracterizado composto 11a, um material sintético, agonista PNR putativo em vários ensaios à base de células. Curiosamente, mostrámos que 11a não conseguiram activar PNR e a sua citotoxicidade era independente da expressão de PNR, excluindo PNR como um mediador para citotoxicidade 11a. análises sistemáticas dos efeitos citotóxicos de 11a em linhas de células NCI-60 revelou uma forte correlação positiva de citotoxicidade com o estatuto de p53, isto é, p53 linhas celulares tipo selvagem foram significativamente mais sensíveis a 11a do que p53 mutado ou celulares nula linhas. Além disso, utilizando p53 HCT116 + /+ e p53 – /- linhas celulares isogénicas que revelou que o mecanismo de citotoxicidade induzida por 11a ocorreu através de G

1 /S paragem do ciclo celular de fase em vez de apoptose. Em conclusão, observou-se uma correlação de sensibilidade 11a com o estado de p53, mas não com a expressão PNR, o que sugere que tumores que expressam p53 do tipo selvagem pode ser sensível a este composto

Citation:. Zhao Z, Wang L, Wen Z, ayaz-Guner S, Wang Y, Ahlquist P, et al. (2013) Análise sistemática dos efeitos citotóxicos de 11a Composto, um agonista sintético putativos de fotorreceptores-Specific Receptor Nuclear (PNR), em linhas celulares de cancro. PLoS ONE 8 (9): e75198. doi: 10.1371 /journal.pone.0075198

editor: Eric Xu, Van Andel Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 14 de maio de 2013; Aceito: 11 de agosto de 2013; Publicação: 16 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto é suportado pelo National Institutes of Health CA125387 a WX, NIH conceder CA22443 para PA e ERA DOD da HOPE Scholar Award W81XWYH-11-1-0237 para WX. PA é um investigador do Howard Hughes Medical Institute. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

receptores nucleares de hormonas regulam uma variedade de processos biológicos essenciais, incluindo o desenvolvimento, diferenciação e sobrevivência celular [1-3]. As suas actividades e os níveis de expressão são estritamente controladas, e a desregulação de receptores nucleares (NRS) e seus coregulators está envolvido em doenças metabólicas e desenvolvimento do cancro [4-6]. NRs são a segunda maior família de proteínas que são alvos de drogas farmacêuticas [7]. Dos 48 receptores nucleares identificados em humanos, cerca de metade são bem caracterizada com ligandos naturais conhecidos. As NRs restantes são assim chamados receptores nucleares órfãos porque seus ligantes fisiológicos permanecem desconhecidos. Apesar de não ter ligandos naturais, os receptores nucleares órfãos podem ser alvo de ligandos sintéticos para o tratamento de doenças humanas, por exemplo ROR sintético e LRH-1 agonistas foram utilizados para tratar doenças auto-imunes metabólica e [8]. Os ensaios de polarização fluorescente, luminescente amplificado proximidade homogénea (Alphascreen) ensaios, e resolvida no tempo de transferência de energia de fluorescência ensaios (TR-FERT) foram desenvolvidos como alta Throughput Screening (HTS) aproxima-se para identificar compostos que têm como alvo os receptores nucleares para fins terapêuticos [9- 12].

NR2E3 /PNR é um receptor nuclear, órfão, que é altamente expresso em células da retina [13] e modestamente expressa na próstata e tecidos uterinos [14,15]. PNR ativa a expressão de genes específicos da haste e suprime a expressão de genes específicos do cone por ciclina D1-regulação para baixo e Tbx2 [16-20]. Este padrão de regulação genética define o duplo papel de PNR na mediação do desenvolvimento e manutenção de fotorreceptores [21]. Mutações no PNR foram encontrados em várias doenças da retina, incluindo a síndrome reforçada S-cone, formas autossómicas dominantes e recessivas de retinite pigmentosa, síndrome de Goldmann-Favre, e aglutinados degeneração retinal pigmentário [22-27]. Novas evidências sugerem que o PNR pode ter funções importantes em células cancerosas através da regulação da estabilidade p53 e expressão estrogênio receptor alfa (ERa). Em células HeLa e linhas celulares de cancro da p53-positiva HCT116, o PNR estabiliza p53 por acetilação e induz a apoptose [28]. Nas linhas celulares de cancro da mama MCF7 ERa-positivos e T47D, o PNR ERa regula directamente por ligação à região do promotor de ERa, aumentando assim a expressão do gene ERa [29]. A expressão do PNR também é significativamente associada à sobrevida livre de recidiva e resposta tamoxifeno favorável, pacientes com câncer ERa-positivos nó de mama negativo [29]. Estes estudos implicam que PNR pode ser um alvo terapêutico para doenças da retina, cânceres de retenção um gene p53 do tipo selvagem, e cancros da mama ERa-positivos.

agonistas específicos PNR, naturais ou sintéticas, foram identificados utilizando alto rendimento testes de rastreio. Uma vez que Apo-PNR tenha sido mostrado para interagir com co-repressores N-COR, SMRT, e RetCoR [20,30], o composto agonista sintético PNR 11a foi identificado utilizando um ligando de domínio de ligação ao ADN de GAL4 PNR de fusão do domínio de ligação β-lactamase ensaio de transactivação e ensaio de libertação de NCOR [30,31]. Embora 11a foi testado em ensaios baseados em células para efeitos agonistas no PNR e foi demonstrado que têm baixa toxicidade em linhas de células de controlo, 11a não tem sido demonstrado que se ligam directamente PNR. Em vez disso, evidências recentes sugerem que 11a é improvável que seja um agonista PNR directo [32]. Nosso resultado concorda com esta conclusão depois. Como PNR foi recentemente implicada no cancro da mama positivo ERa e mostrado para regular a estabilidade de p53, este composto pode ter utilidade terapêutica. No entanto, a avaliação sistemática do composto citotoxicidade foi falta e os alvos celulares de 11a ainda não foram definidos. Neste estudo, foram avaliados sistematicamente os efeitos citotóxicos de 11a em NCI-60 linhas de células [33] e descobriu que a citotoxicidade 11a é independente da expressão PNR, mas correlaciona-se positivamente com o status de p53, com maior sensibilidade em linhas celulares p53 tipo selvagem do que nula p53 /linhas de células mutantes. Usando HCT116 p53 + /+ e p53 – /-. Linhas celulares isogênicos, demonstramos que os efeitos citotóxicos da 11a resultou em grande parte G induzida por p53

1 /S parada do ciclo celular fase, com uma contribuição menor da apoptose

Materiais e Métodos

cultura celular e tratamento 11a

A linha de células LM2 foi uma simpática oferta do Dr. Joan Massagué [34]. As linhas celulares isog�nicas HCT116 foram um presente amável do Dr. B. Vogelstein [35]. Todas as outras linhas de células foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD). O HEK293T, MCF7, MDA-MB-231, LM2, MDA-MB-468, linhas de células isogénica SKOV3, e HCT116 foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, MD) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Gibco) a 37 ° C com 5% de CO

2. A A2780 e linhas celulares de cancro do ovário OVCAR3 foram mantidas em meio RPMI-1640 (Gibco) suplementado com FBS a 10%. A linha celular de cancro da mama T47D foi mantida em DMEM /F12 (Gibco) suplementado com FBS a 10%. Composto 11a foi comprado de Pharmabridge Inc. (Pensilvânia Centro de Biotecnologia, Doylestown, PA). O pó 11a foi dissolvido em etanol e depois em dimetil sulfóxido (DMSO) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a uma concentração final de 8 mM. assíncronos células foram semeadas 24 horas antes do tratamento com 11a, de tal modo que as células foram de aproximadamente 50% -60% confluentes no momento da adição 11a. A concentração final de 11a em nM – gama uM foi obtida por diluição 11a no meio fresco, e 0,1% de DMSO foi usado como o controlo para cada experimento. All-trans-retinóico, doxorrubicina, etoposido, estaurosporina e 3-aminobenzamida foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO).

Para a análise do ciclo celular, as células foram privadas de soro durante 24 horas, a fim de alcançar L

0 sincronização. As células foram então autorizados a reentrar no ciclo celular, completando com DMEM mais 10% FBS contendo as concentrações indicadas de 11a.

embalagem Retrovirus, infecção e geração de linha de células estável

A embalagem plasmídeos PME-VSVG, pHIT60 e pLNCX foram adquiridos de OpenBiosystems (Huntsville, AL). Os retrovirus foram empacotados em células HEK293T transfectadas com 3,8 ug de PMA-VSVG, 1,4 ug e 3,8 ug pHIT60 pLNCX ou pLNCX-GFP-PNR utilizando o reagente Transit-LT1 (Mirus Bio) de acordo com as instruções do fabricante. Seis horas após a transfecção, o meio foi mudado. As partículas virais foram então colhidas 24 a 48 horas mais tarde utilizando um filtro de seringa de 0,45 um (Thermo Scientific).

Para infectar as células com os retrovírus, os vírus foram misturados com um volume igual de meio fresco suplementado com 10% FBS. Foi adicionado polibreno a uma concentração final de 5 ug /ml, a fim de aumentar a eficiência da infecção. O meio foi trocado a 6 horas após a infecção. As células foram seleccionadas com G418 (800 ug /ml) durante uma semana para gerar linhas celulares estáveis ​​expressando GFP ou PNR.

CellTiter Glo ensaios de viabilidade celular luminescente

Mil células por poço foram semeadas em placas quadriplicado em uma placa de 384 poços e tratadas com as concentrações indicadas de 11a para uma semana. As células foram então submetidas ao ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter Glo de acordo com as instruções do fabricante (Promega, Madison, WI). O IC

50 valores foram calculados usando a XLfit

TM add-in para Excel.

ensaios de repórter de luciferase

O repórter luciferase DR2-driven, TLX e COUP-TFI plasmídeos foram presentes amáveis ​​do Dr. Ronald Evans. COUP-TFII plasmídeo foi uma simpática oferta do Dr. Michael Gould. Os outros plasmídeos foram adquiridos a OpenBiosystems (Huntsville, AL). Os ensaios de luciferase foram efectuados utilizando o sistema de ensaio de luciferase (Promega, Madison, WI). células HEK293T foram semeadas numa placa de 96 poços (2 × 10

3 /poço). Após 24 horas, as células foram transfectadas utilizando Transit-LT1 (Mirus Bio) com o repórter 20ng DR2-driven luciferase, 10 ng repórter β-galactosidase e 20 ng vetor de expressão CMV para o controle, PNR, TLX, COUP-TFI ou COUP-TFII. Composto 11a foi adicionado 24 horas após a transfecção, e a actividade da luciferase foi determinada após incubação durante mais 24 horas. β-galactosidase actividade foi utilizada para normalizar para a eficiência de transfecção.

ensaios de proliferação celular

As células (2 x 10

3 /poço) foram semeadas numa placa de 96 poços. Após 24 horas, várias concentrações de 11-A foram adicionados às placas. As células foram cultivadas durante 72 horas e, em seguida, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (Sigma-Aldrich) de solução (20 uL por poço, 4 mg /ml em PBS) foi adicionado. As células foram incubadas a 37 ° C durante 4 horas. Depois de descartar o sobrenadante, adicionou-se 200 uL de DMSO e a absorvância foi medida com um filtro de 540 nm num leitor de microplacas X5 Victor (PerkinElmer, Waltham, MA). Aproximados

50 valores IC foram calculados utilizando GraphPad Prism Software (Versão 5,04, Graph-Pad Software Inc., San Diego, CA) e um log três parâmetros em relação regressão não linear de resposta.

celular Análise do Ciclo

As células foram recolhidas por tripsinização, centrifugou-se e fixados em 80% gota a gota de etanol arrefecido com gelo com agitação em vórtex contínuo. Antes da análise, as células foram centrifugadas, e o etanol foi removido. Os sedimentos celulares foram ressuspensos em 1 ml de solução de PI /ARNase (50 ug /mL de iodeto de propídio, 50 ug /ml de RNase A, 0,25% de Triton X-100 em PBS). A análise de citometria de fluxo foi realizada com um FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) com excitação a 488 nm. histogramas fluorescentes vermelhas integradas foram analisados ​​com Modfit LT (Verity Software House, Topsham, ME).

Ensaio de apoptose medida por anexina V /PI coloração

As células foram marcadas com Alexa-488 anexina V e PI, e avaliadas quanto a apoptose por citometria de fluxo de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen). Resumidamente, 1 x 10

6 células foram lavadas duas vezes com PBS, e coradas com 5 jil de anexina V e 1 ml de PI (100 ug /ml) em 1 × tampão de ligação durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. A análise de citometria de fluxo foi realizada com o FACSCalibur. Ambos início apoptótica (anexina V-positivo, PI-negativo) e tardia (anexina V-positivo e PI-positivo) células em apoptose foram incluídas nas determinações de morte celular analisados ​​por FlowJo (Árvore Star Inc., Ashland, OR).

Análise Western Blot

As células foram colhidas e lisadas com tampão RIPA (50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 0,1% de SDS, 0,5% de desoxicolato de sódio, 1% de Triton X 100, 1 mM de DTT, inibidores da protease e Benzonase) . Após centrifugação, a proteína total foi quantificada utilizando o BioRad Protein Assay (BioRad), e 25 ug de proteína foi resolvido por SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose, durante 1,5 horas a 0,35 A. As membranas foram bloqueadas com leite magro a 5% e incubadas com o anticorpo primário, à temperatura ambiente durante 2 horas ou durante a noite. As membranas foram então incubadas com o anticorpo secundário durante 1 hora à temperatura ambiente e visualizada utilizando SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, Waltham, MA) em filme de autorradiografia. O anticorpo anti-PNR foi gerado pela Genemed Synthesis Inc., TX. Dois péptidos conjugados com KLH foram sintetizados por Genemed Synthesis Inc.: PETRGLKDPEHVEALQD e LSQHSKAHHPSQP, correspondente aos aminoácidos 331-347 PNR humanos e 353-365, respectivamente. Estes péptidos foram utilizados para imunizar coelhos. O anti-soro foi purificado por afinidade após a sangria final para a obtenção de anticorpos específicos anti-PNR. Os anticorpos anti-p53 e anti-p21 foram obtidos a partir de Pierce (Rockford, IL); anticorpos anti-ciclina D1 e anti-Hsp90 foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); anticorpo anti-PARP foi obtido a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

A análise quantitativa PCR em Tempo Real

O ARN total foi extraído utilizando o HP kit de ARN total (VWR Scientific, West Chester, PA) de acordo com as instruções do fabricante. 1 ug de ARN foi revertida transcritas utilizando Superscript II RT de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA) e PCR quantitativa foi realizada utilizando SYBR Green corante (Roche Scientific, Basileia, Suíça) e um instrumento CFX96 (BioRad, Hercules, CA ). sequências de primers (IDT, Coralville, IA) utilizados neste estudo foram os seguintes: COUP TFII: para a frente, 5′-GCCATAGTCCTGTTCACCTC-3 ‘; reverso, 5’-GGTACTGGCTCCTAACGTATTC-3 ‘; RARB2: para a frente, 5’-GTGGAGTTTGCTAAACGTCTG-3 ‘; reverso, 5’-TCATGGTGTCTTGTTCTGGG-3 ‘; NGFI-A: para a frente, 5’-CAGCACCTTCAACCCTCAG-3 ‘; reverso, 5’-AGTCGAGTGGTTTGGCTG-3 ‘; 18S: para a frente, 5’-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3 ‘; reverso, 5’-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3 ‘.

A análise estatística

Todos os resultados são representativos de pelo menos três experiências independentes. A significância estatística do GI

50 valores entre tipo selvagem, mutante, e linhas celulares p53 nulos foi calculada usando um não pareado Wilcoxon Rank Sum frente e verso. A significância estatística da expressão do gene nos ensaios de análise e de apoptose qRT-PCR foi calculado usando um teste t de duas faces Student.

Resultados

11a não tem efeitos agonistas em relação PNR em cell- ensaios baseados

para investigar as funções celulares de PNR, foram empregados composto 11a (estrutura mostrada na Figura 1A), um agonista anteriormente descrito PNR putativa com um grupo ciclopropilo amida relatado para conferir uma elevada actividade agonística em relação PNR (CE

50 200 nM) [31]. Composto 11a foi sintetizado e

Os dados de espectrometria de massa (Figuras S1 e S2) e 1H-RMN confirmou a estrutura molecular correcto e o peso molecular de 11a. TLX, COUP-TFI e COUP-TFII estão na mesma subfamília de receptores nucleares como PNR [36], que se ligam a uma repetição directa do motivo GGTCA com um espaçamento de 2 pb (DR2) [37]. A fim de avaliar a especificidade de 11a a PNR, a activação de PNR e estes receptores órfãos estreitamente relacionados por 11a foram comparadas num ensaio de repórter de luciferase dirigido DR2 (Figura 1B e 1C). células HEK293T foram transfectadas com vectores de expressão para o PNR [13], TLX [38], COUP-TFI [39] ou COUP-TFII [39] e um gene repórter da luciferase DR2-dirigido, e as células foram tratadas subsequentemente com 11a utilizando concentrações variando a partir de 15 nM a 150 nM para minimizar o efeito citotóxico. Aos 15 nM, 11a não ativar qualquer um dos receptores nucleares testadas. À medida que a concentração aumenta, 11a activado ligeiramente TLX, COUP-TFI e COUP-TFII de uma forma dependente da dose. No entanto, a activação de PNR foi observada apenas na concentração mais elevada testada ( 150 nM) (Figura 1B). Notamos que as concentrações de 11a superior a 150 nm foram a morte celular grave citotóxica e induzida, o que limitou a precisão do ensaio de repórter luciferase. Este resultado indicou que 11a não tem efeitos agonistas óbvias em relação PNR. Porque PNR foi o menos activado entre os quatro receptores nucleares testadas na faixa indicada de concentrações 11a (Figura 1C), nossos resultados indicam que a especificidade da 11a direção PNR é baixa e o agonismo da 11a provavelmente não é um efeito direto, como mostrado no estudo de liberação NCOR onde 11a também inibiu interações RARa-NCoR [32] TRp-NCOR e.

(a) estrutura química da 11a. células HEK293T transfectadas com as construções indicadas foram tratadas em triplicado com 0,1% de DMSO, 15 nM, 30 nM, 60 nM, 120 nM ou 150 nM 11a. Os dados são expressos como unidades relativas de luciferase normalizada para o controlo de DMSO ± DP. (B) Comparação entre os receptores nucleares diferentes com concentrações crescentes 11a. (C) A comparação entre várias doses de 11a com receptores nucleares diferentes.

Como 11a activado PNR relacionadas com receptores nucleares COUP-TFI e COUP-TFII no ensaio de luciferase DR2 na concentração relativamente baixa de 30 nM (Figura 1) e apenas COUP-TFII poderia ser detectado em todas as linhas celulares de cancro da mama [40], nós examinamos se a 11a poderia alterar a expressão de COUP-TFII genes alvo a jusante em MCF7 e T47D, duas linhas celulares de cancro da mama positivos ERa . COUP-TFII tem sido implicado em vários cancros, tanto para efeitos supressores oncogénicos e de tumores [41]. Em células de câncer de mama, RARB2 [42,43] e NGFI-A [44,45] são dois alvos directos bem caracterizados up-regulamentados pela COUP-TFII. All-trans ácido retinóico (ATRA) foi previamente mostrado para aumentar COUP TFII de nível de mRNA, bem como melhorar COUP-TFII expressão do gene alvo a jusante [46]. Com efeito, 1 uM atRA foi encontrado para aumentar COUP-TFII nível de mRNA de cerca de 1,5 e 2,5 vezes em células MCF-7 e T47D, respectivamente (Figura S3). Curiosamente, embora 11a não aumentou os níveis de ARNm de COUP-TFII nas duas linhas celulares, o tratamento resultou em 11-A sobre-regulação de genes alvo COUP-TFII. Na linha de células MCF7, 0,1 mM 11a induzida NGFI-A expressão do gene para um nível semelhante como 1 PM atRA. 1 PM 11a NGFI-A expressão induzida ~ 5 vezes em relação a de 1 PM atRA (Figura S3A). Porque NGFI-A expressão é muito baixa para ser detectada em células T47D, medimos outro gene alvo COUP-TFII, RARB2. Em células T47D, atRA aumento robusto nível de mRNA RARB2 por 30 vezes. Embora 11a também o aumento da expressão RARB2 de uma forma dependente da dose, a magnitude de activação não era comparável à atRA (Figura S3B). Estes resultados indicaram que possivelmente regula a actividade 11a COUP-TFII de forma gene- e específico da célula.

Desde 11a induziu a morte celular em células HEK293T em concentrações mais elevadas e PNR foi mostrado para induzir a apoptose em diversos tipos de células [ ,,,0],28], nós investigado se a citotoxicidade induzida por 11-A foi PNR-mediada. Porque PNR é indetectável por transferência de Western em linhas celulares de cancro da mama, várias linhas celulares de cancro da mama PNR superexpressão estável, MCF7, MDA-MB-231, LM2 [34] e células MDA-MB-468, foram gerados (Figura 2A). Os ensaios de proliferação de células MTT foram então usadas para determinar o IC

50 valores de 11a em linhas de células de controlo que expressam GFP e linhas de células que sobre-expressam PNR. O IC

50 valores nas células que sobre-expressam PNR foram semelhantes para as linhas de células de controlo correspondente (Figura 2B-E), com IC

50 valores que variam 0,05-0,7 uM. Uma vez que a sobre-expressão de PNR não afectou a citotoxicidade 11a em qualquer uma das células testadas, os nossos resultados indicam que a citotoxicidade induzida por 11a é provável independente de PNR nestas células.

células de cancro da mama (A) foram infectadas com retrovírus que expressam GFP ou PNR. PNR expressão foi detectada no Western blot e Hsp90 foi utilizado como controlo de carga. (B) MCF7, (C) MDA-MB-231, (D) LM2 e MDA-MB-468 de cancro da mama células (E) foram tratados com concentrações que variam de 11 a 10

-8 a 10

-3 M durante 72 horas, e 11a IC

50 valores foram obtidos por ensaios de proliferação celular MTT.

11a citotoxicidade está correlacionada com o estado de p53 em linhas celulares NCI-60

para investigar ainda mais o mecanismo de citotoxicidade e os alvos celulares de 11a, utilizou-se o-60 NCI linha de células de serviço de Developmental Therapeutics Program (DTP) de triagem, um serviço de acesso público, que ajuda a determinar composto citotoxicidade num painel de 60 linhas celulares de cancro, a avaliar a citotoxicidade de 11a em 60 linhas de células [47]. Os dados de citotoxicidade para 11a 58 de linhas celulares NCI-60 foram recebidas de DTP e GI

50 dados são mostrados nas Figuras S4-S6. Este estudo foi composta por 60 linhas de células a partir de 9 tipos diferentes de câncer: leucemia, cancro do pulmão de não pequenas células, cancro do cólon, cancro do SNC, melanoma, câncer de ovário, câncer renal, câncer de próstata e câncer de mama. O ensaio de sulfo-rodamina-B (SRB) foi utilizado para obter os valores de diferentes linhas celulares de cancro GI

50 (inibição do crescimento de 50%). Apesar da ampla variedade de linhas de células envolvidas, o GI

50 valores de 11a caiu em uma faixa estreita (10

-6 a 10

-5 M). Desde o nosso estudo anterior sugeriu que PNR estabiliza p53 por modificações pós-translacionais em células HeLa e linhas celulares HCT116 [28], o próximo examinou se a sensibilidade 11a foi correlacionado com o nível de expressão da p53 ou estado de mutação. O estado de mutação da p53 das linhas celulares NCI-60 foi determinada anteriormente [48]. As 58 linhas de células que receberam IG

50 dados de DTP podem ser classificados em duas categorias: a p53 do tipo selvagem e p53 mutada /nulo (Tabela 1). Ao comparar o GI

50 valores dos dois grupos (Figura 3), descobrimos que as linhas celulares p53 tipo selvagem foram significativamente mais sensíveis do que p53 mutado ou linhas celulares nulos, com GI médio

50 valores 12,0 mM e 19,9 ? M, respectivamente (p = 0,039, frente e verso). Estes resultados implicam p53 como determinante putativo da citotoxicidade induzida por 11-A.

P53 WT

p53 Mut /Null

linha de células

conc. (M)

LINHA CELULAR

conc. (M)

LINHA CELULAR

conc. (M)

LINHA CELULAR

conc. (µM)

SR12.70HL-608.27KM1220.90OVCAR-551.50A54916.20K-5623.59SW-62030.50OVCAR-813.30NCI-H46018.20MOLT-47.36SF-26838.20ADR-RES3.16HCT-1165.39RPMI-82261.24SF-2955.27SKOV340.20LOX IMVI7.10EKVX2.84SF-53924.20786-021.10MALME-3M20.90HOP-6219.40SNB-1932.40RXF 39326.30SK-MEL-51.28HOP-9217.60SNB-7518.50SN12C27.50UACC-2573.46NCI-H22616.90U25121.40TK-1029.80UACC-6221.40NCI-H237.49M1416.80PC-312.10A49811.60NCI-H322M54.80MDA-MB-43514.50DU-14537.90ACHN13.70NCI-H52213.60SK-MEL-222.80MDA-MB-23116.50CAKI-114.20COLO 20512.40SK-MEL-2818.50HS578T53.40UO-3116.90HCC-299822.30IGROV124.20BT-5492.00MCF74.35HCT-1516.80OVCAR-315.70T-47D6.34average GI5011.96HT2915.90OVCAR-411.00average GI5019.92Table 1. 11a resultados de citotoxicidade para as linhas de células 58 na linha de células de triagem NCI60

GI

50 valores e status de p53 (WT: tipo selvagem; Mut /nulo.: mutado ou nulo) são mostrados para cada linha celular. CSV Baixar CSV

11a GI

50 valores (MM) são plotados contra WT p53 e /grupos nulos Mut no gráfico de caixa. Os valores mínimos e máximos, valores médios e valores médios são mostrados. teste de significância foi realizado pelo teste de classificação soma de duas faces não pareado Wilcoxon. *, P . 0,05

A apoptose não é o principal mecanismo responsável por citotoxicidade mediada por 11a

Para estudar o mecanismo de 11a induzida citotoxicidade, foram selecionados três linhas celulares de cancro do ovário com representante estado de mutação p53: SKOV3 (p53 nulo), A2780 (p53 tipo selvagem) e OVCAR3 (mutação p53, p.R248Q) [49]. Estas células foram tratadas com concentrações crescentes de 11a (0 a 1 uM), e a proporção de PARP clivada ao total de PARP foi utilizada como um indicador da apoptose [50]. A doxorubicina foi usada como um controlo positivo para induzir apoptose em células SKOV3 (Figura 4A). Mesmo nas concentrações mais elevadas testadas, 11a induzida apenas modestamente a clivagem de PARP em células SKOV3, mas não em células A2780 ou OVCAR3 (Figura 4A). No entanto, o nível basal de PARP clivada também foi maior em células SKOV3, em comparação com as outras linhas celulares. Para investigar quantitativamente o efeito apoptótica de 11a, foi realizada anexina V /PI dupla marcação. Consistente com os ensaios de PARP clivada, 11a única apoptose induzida em células SKOV3 modestamente mas não em células A2780 ou OVCAR3 utilizando o etoposido como o controlo positivo (Figura 4B e figura S7). Efeitos semelhantes foram observados em linhas celulares do cancro da mama MCF7, onde tanto a doxorrubicina e a estaurosporina induziu apoptose significativa enquanto 11a não induziu a apoptose nas concentrações testadas (Figura 4C e 4D). Colectivamente, estes dados indicam que a apoptose não é o principal mecanismo de contabilidade para a citotoxicidade induzida por 11a.

SKOV3, células A2780 e células OVCAR3 do cancro do ovário (A) e células de cancro da mama MCF7 (C) foram tratadas com as doses indicadas da 11a ou doxorrubicina durante 24 horas. Os lisados ​​celulares totais foram sondadas para a clivagem de PARP, utilizando o anticorpo anti-PARP em western blots. p-actina foi utilizado como um controlo de carga. As setas pretas indicam as posições das proteínas não-clivado e PARP clivada. (B) e (D) Após 24 horas de tratamento com 11-A 2 uM, as células foram recolhidas e coradas com anexina V /PI e submetido a citometria de fluxo. 50 uM de etoposido (B) ou 1 uM estaurosporina (STS) (D) serviram como controlos positivos para a apoptose. A significância estatística foram mostrados como ** P 0,01, *** p . 0,001 em comparação com o controlo de DMSO

11a induz L

1 /S de paragem do ciclo celular de uma forma dependente de p53

Desde 11a não conseguiu induzir apoptose significativa em qualquer uma das linhas celulares testadas, a hipótese de que a citotoxicidade induzida por 11-a pode ser atribuída a paragem do ciclo celular, o que poderia induzir a inibição do crescimento, conforme determinado pelo sulforrodamina B (SRB) ensaio colorimétrico utilizado para a linha de células de pesquisa citotoxicidade NCI-60. Discernir ainda se 11a citotoxicidade relacionada com o estatuto p53, cancro colorectal isogênico HCT116 p53 + /+ e p53 HCT116 – /- linhas celulares foram utilizados [35]. Curiosamente, estas linhas celulares isog�nicas exibiu sensibilidade diferencial a 11a. A linha celular de p53 do tipo selvagem (IC

50 = 0,0337 uM) foi cerca de 10 vezes mais sensível do que a linha celular nula p53 (IC

50 = 0,3188 uM) num ecrã piloto realizado pelo rastreio de molécula pequena e Síntese Mecanismo (SMSSF) da Universidade de Wisconsin (Figura 5A). A sensibilidade diferencial foi confirmada mais tarde utilizando o ensaio de MTT, onde a proliferação de células de p53 do tipo selvagem (IC

50 = 0,36 uM) foram mais sensíveis do que as células nulos p53 (IC

50 = 1,76 ^ M) (Figura 5B). Para investigar adicionalmente o mecanismo pelo qual as duas linhas de células isogénicas mostraram sensibilidades diferenciais 11a, foram avaliados os efeitos apoptóticos de 11a nestas duas linhas celulares. As células foram tratadas com concentrações crescentes de 11a durante 24 horas, e a apoptose foi medida utilizando um ensaio de clivagem de PARP-, em que a proporção de clivagem de PARP indica o estado apoptótico. A Figura 5C mostra que apenas a clivagem de PARP modesta foi observada em qualquer p53 + /+ ou p53 – células HCT116 – /. Para examinar se a PARP desempenhado um papel na citotoxicidade mediada 11a, 11a que células com e 3-aminobenzamida (3-AB), um inibidor de PARP específica [51] co-tratados. inibição de PARP não afectou a citotoxicidade de 11a (Figura 5D), indicando que a citotoxicidade mediada 11a era independente da actividade de PARP. O efeito apoptótico de 11a foi ainda examinado por coloração com anexina V /PI. Enquanto estaurosporina causou apoptose grave, 11a não induziu qualquer apoptose nas linhas celulares isogénicas em comparação com o controlo de DMSO (Figura 5E). Porque a proteína PNR era indetectável nestas células, que PNR seguido por tratamento com 11-A sobre-expresso. Nossos resultados reforçam que o efeito apoptótica foi independente do PNR (Figura 5F)

(A) IC

50 valores de 11a em p53 + /+ e p53 -. Linhas de células HCT116 – /. As células foram semeadas em quadruplicados em placas de 384 poços e tratadas com as concentrações indicadas de 11a de 7 dias. A inibição do crescimento foi determinada por ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter Glo. (B) IC

50 valores da 11a foram examinados nos ensaios de viabilidade celular MTT após 72 horas de incubação com 11-A. (C) As duas linhas de células foram tratadas com 0, 1, 10, 100 ou 1000 nM de 11-A durante 24 horas e submetidas a transferência de Western utilizando anticorpo anti-PARP para detectar a clivagem de PARP. Hsp90 foi utilizado como um controlo de carga. (D) As células foram tratadas com as concentrações indicadas de 11a na presença ou ausência de mM de 3-aminobenzamida 2 (3-AB), durante 72 horas e, em seguida, submetido a ensaios MTT. (E) Após 24 horas de tratamento com 11-A 1 uM, as células foram recolhidas e coradas com anexina V /PI e submetido a citometria de fluxo. 1