Abstract

Fundo

carcinomas de células escamosas de esôfago (CEE) tem mau prognóstico. Enquanto modalidade combinada de quimioterapia e radioterapia sobrevivência aumenta, a maioria dos pacientes morrem dentro de cinco anos. Desenvolvimento de agentes que conferem quimio- específico de células do cancro e radiossensibilidade pode melhorar a terapia de CICAc. Assim, aqui a descoberta de berberina como um agente sensibilizador potente em células CICAc

principais conclusões

Berberina em baixas concentrações.; Células CICAc substancialmente radiosensitized ( Aceito: 17 de julho de 2011; Publicação: 08 de agosto de 2011

Direitos de autor: © 2011 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi financiado pela National Science Foundation Natural da China; Ministério da Ciência e Tecnologia da China. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinomas de células escamosas do esôfago (ESCC), que têm uma incidência particularmente elevada nos países do leste Asiático, geralmente têm mau prognóstico. Apenas uma taxa de sobrevida em 5 anos 4% foi gravado com cuidados cirúrgicos [1]. Radioterapia teve um resultado semelhante [2]. A taxa de sobrevivência de pacientes com CICAc pode ser significativamente melhorada com quimioterapia e radioterapia combinadas [3], [4]. No entanto, o aumento da dose de radiação não produzir resultados mais satisfatórios [5]. Permanece a necessidade de desenvolver agentes que conferem quimio- e radiossensibilidade selectivamente em células cancerosas ao mesmo tempo que o mínimo de toxicidade para as células normais de radiação. Embora vários sensibilizadores de radiação foram testados, incluindo agentes que têm como alvo alvos de ADN ou não de DNA, o sensibilizador de radiação ideal continua a ser descoberto [6].

Berberina, o principal componente alcalóide em Huang Lian e outras ervas medicinais , é o medicamento mais utilizado para o desconforto gastrointestinal na China. Para além da sua utilização comum como um medicamento diariamente, uma série de estudos de laboratório mostraram que a berberina tem actividade antitumoral para uma grande variedade de células cancerosas, incluindo glioblastoma [7], cancro oral, [8], de hepatoma [9], o cancro gástrico [10 ], o cancro da próstata [11], leucemia [12] e osteossarcoma [13]. Na maioria dos casos, a berberina foi encontrado para inibir a progressão do ciclo celular e induzir a apoptose. Um estudo recente mostrou que a berberina foi capaz de suprimir a activação constitutiva do NF-kB em algumas células cancerosas [14], onde foi encontrado para inibir directamente IkB cinase de activação (IKK), que conduz à supressão da fosforilação e a translocação nuclear de p65 . Berberina também foi relatada como tendo um efeito sensibilizador sobre células de cancro do pulmão através da indução de autofagia [15]. Além disso, a berberina pode prejudicar o crescimento do tumor por inibição da angiogénese [16].

que anteriormente mostraram que a berberina pode inibir a proliferação de células de cancro através da indução de quebras de ADN de cadeia dupla (DSB). Berberina, que emite uma fluorescência amarelada, foi encontrada para ser mais intensamente acumulado nos núcleos de células de osteossarcoma, que nos de osteoblastos normais, e esta acumulação diferencial de berberina correlaciona-se com o seu efeito inibidor do crescimento, para a indução de dano do ADN, e subsequentemente à activação de p53 e paragem do ciclo celular [13]. Portanto, a via de transdução de sinal subjacente ao efeito antitumoral da berberina é provavelmente semelhante para as iniciadas por outros agentes que danificam o ADN tais como a cisplatina. Um relatório recente mostrou que a berberina pode regular positivamente p53 por perturbar as interações MDM2-DAX-HAUSP e promover MDM2 auto-ubiquitinação e degradação [17].

Nós aqui relatam que a berberina em baixas concentrações pode radiossensibilizar significativamente CICAc células. Foi demonstrado que o efeito sensibilizador de berberina é mediado pela regulação negativa do

RAD51

, que codifica uma proteína essencial na reparação de recombinação homóloga. Além disso, observou-se que

RAD51

era comumente sobre-expresso em tecidos CICAc humanos, indicando que é necessário regular negativamente RAD51 para alcançar alta radioterapia ou eficácia quimioterápico de ESCC na clínica, porque a sobre-expressão de

RAD51

é conhecido para conferir chemoresistance rádio-e.

resultados

Berberina sensibiliza as células de câncer de esôfago à radiação

Como relatado anteriormente para outros tipos de células cancerosas ionizantes, tratamento de berberina só teve um efeito inibidor do crescimento em células de cancro esofágico de uma maneira dose e dependente do tempo (Fig. 1A). Quando comparado com fibroblastos normais humanos (HNF), células CICAc são mais sensíveis a berberina. Às 72 h, o IC50 para células CICAc KYSE450 (12,58 M), foi de cerca de um quarto do que para a HNF (51,28 M) (Fig. 1B). Em concentrações baixas ( 15 uM), a berberina tinha uma toxicidade relativamente baixa para células CICAc e não induziu apoptose detectável (Figura 1C.). No entanto, as células que foram pré-tratados CICAc com baixas concentrações de berberina exibiram uma sensibilidade significativamente aumentada à radiação ionizante, tal como reflectido pela diminuição notável na sua capacidade para formar colónias (Fig. 2). pré-tratamento de berberina (15 uM, 24 h) reduziu a SF2 (fracção sobrevivente com 2 Gy) de KYSE30 células para 48,1 ± 0,6%, de 77,2 ± 1,2% em células que não foram pré-tratados com berberina. Uma segunda linha CICAc KYSE450 mostraram uma resposta semelhante, com a SF2 reduzida para 50,2 ± 2,1%, quando as células foram pré-tratados com berberina a 15 uM, durante 48 h, em comparação com 81,2 ± 2,6% para células não pré-tratados com berberina. Em contraste, a berberina não teve nenhum efeito sensibilizador sobre fibroblastos humanos normais (Fig. 2)

.

(A), Efeito da Berberina sobre a viabilidade das células KYSE30, KYSE450 e HNF. A viabilidade celular foi avaliada por um ensaio MTT. As células foram tratadas com DMSO ou as concentrações indicadas de berberina por 24 h, 48 h e 72 h. Os resultados foram representados como a média ± DP de três experiências independentes. (B), a citotoxicidade contra as células de berberina KYSE30, KYSE450 e HNF representados por concentrações inibidoras IC50. (C), a medida da apoptose por análise de Western blot de caspase-3. KYSE30 KYSE450 e as células foram tratadas com a berberina, durante 24 h e 48 h, respectivamente. células HL-60 e HeLa tratadas com paclitaxel como controlo positivo.

(A), a radiossensibilização por berberina por ensaio de sobrevivência de células clonogénicas. KYSE30 e KYSE450 células foram expostas a berberina (15 uM) ou controlo de veículo (DMSO) durante 24 e 48 h, respectivamente, antes de serem irradiados e plaqueadas. células de fibroblastos humanos normais foram tratados com berberina durante 24 h e 48 h antes de serem expostos aos raios-X. Os pontos de dados são as médias de duas experiências independentes, cada plaqueadas em triplicado; bares, SE. (B), SF2 valores após o tratamento com a berberina. Diminuição nos valores SF2 indica os efeitos radiosuscetível de berberina.

Berberina pré-tratamento prolonga a persistência de LAP induzida por radiação

radiação

ionizante mata células por infligir vários tipos de danos ao genoma . Especulamos que o efeito sensibilizador de berberina em células cancerosas pode ser causada por deficiência na reparação de quebras de ADN de cadeia dupla (DSB). Por conseguinte, determinados os níveis de LAP por coloração de imunofluorescência de focos γ-H2AX em ESCCs em diferentes pontos de tempo após a exposição aos raios-X. Como mostrado na Fig. 3A, em KYSE30 células não pré-tratados com berberina, a maioria dos focos y-H2AX foram apuradas às 12 h após a exposição a 0,5 Gy de raios-X, e o número médio de γ-H2AX focos diminuiu para o nível basal perto às 24 h. Em contraste, mais γ-H2AX focos persistiu naqueles dois pontos de tempo no KYSE30 células que foram pré-tratados com berberina (15 uM). O número médio de focos γ-H2AX por célula em células que recebem o tratamento de berberina /radiação combinada foi significativamente maior em comparação com a única radiação grupo após 12 e 24 h de tempo de pontos (fig. 3B) (

P =

0,002, e

P Art 0,001, respectivamente). tratamento berberina por si só não foi observado para induzir dano ao DNA óbvio em termos de indução γ-H2AX focos mais controles não tratados (

P

= 0,081).

(A), imunofluorescência de γ-H2AX em KYSE30 células. (B), Resumo dos focos γ-H2AX KYSE30 em células em diferentes pontos de tempo após diversos tratamentos. (C), Resumo dos focos γ-H2AX KYSE450 em células em diferentes pontos de tempo após diversos tratamentos. As colunas, os meios de três experiências independentes. As células que crescem em lamelas em placas de 6 poços foram expostas a berberina (15 uM) durante 24, irradiados (0,5 Gy), e fixadas nos pontos de tempo especificados para análise de imunofluorescência.

KYSE450 células também mostrou uma depuração retardada dos focos γ-H2AX de raios-X induzida quando foram pré-tratados com berberina. Embora a maioria dos focos H2AX-y foram limpos em células de controlo às 24 horas após a exposição a raios-X, mais do que metade do γ-H2AX focos persistiu em células que foram pré-tratados com berberina (Fig. 3C). Estes resultados indicam que o pré-tratamento de berberina prejudicada a reparação de DSB de x-ray-induzida.

Berberina RAD51 regula negativamente em células cancerosas mas não em células não malignas

LAP são reparadas principalmente por duas vias, ou seja, extremidade não-homóloga juntar e recombinação homóloga [18], [19], [20]. Ku70 e Ku86 são essenciais para o primeiro, onde como RAD51 é um actor central neste último. A seguir, determinar se os níveis desses três proteínas foram alterados em células de câncer de esôfago pré-tratados com berberina. Observou-se que, enquanto não se verificaram alterações óbvias nos níveis de Ku70 e Ku86, o nível de proteína RAD51 foi notavelmente diminuída no ESCCs que foram tratados com berberina durante 24 h ou 48 h a 7,5? M ou 15 uM (Fig. 4a). O nível de

RAD51

ARNm mostraram uma redução significativa em ambas as linhas de células de cancro após tratamento com a berberina (Fig. 4B), o que sugere que a regulação negativa da RAD51 foi, provavelmente, devido a uma diminuição da transcrição de

RAD51

mRNA.

(A), os níveis de proteínas de reparo de DNA em células de câncer de esôfago tratados com berberina. As células foram tratadas com a berberina, nas concentrações indicadas e para a duração indicada antes de as células foram preparadas para extractos celulares. (B), diminuição do

RAD51

níveis de mRNA após a exposição berberina. As células foram expostas a berberina (15 uM) durante 24 h para KYSE30 células (48 h para KYSE450 células), e recolhidos por quantitativo em tempo real A análise de PCR do RAD51 /rácios de ARNm de GAPDH. (C),

RAD51

actividade do promotor foi suprimida pela berberina em KYSE30 e KYSE450 células. Os plasmídeos repórter pGL3-RAD51p luciferase (vaga-lume) foram transitoriamente transfectados em células de câncer de esôfago humanos. Quatro horas mais tarde, as células foram tratadas com a berberina, durante 24 h, e, em seguida, ensaiadas para a actividade da luciferase. Firefly valores luciferase foram normalizados para a actividade da luciferase Renilla de uma PRL-SV40 vetor de controle co-transf. Cada valor representa a média SE para três experiências independentes. A análise estatística foi realizada utilizando

o teste t de Student não pareado. *

, P 0,05 quando comparado com valores de controlo. (D), a falta de RAD51 regulação baixa em células não malignas. As células foram expostas a berberina (15 M) para o período de tempo especificado e recolhidos para análise immunoblot. (E), regulação negativa do RAD51 em outros tipos de células cancerosas. As células foram expostas à concentração de berberina designado por 48 h, e recolhidos por análise de imunotransf erência. Os imunoblots mostrado em A, D, e E são representativos de pelo menos duas experiências independentes com GAPDH que serve como um controlo de carga da proteína. C indica culturas expostas para o controlo de veículo de DMSO.

A expressão de RAD51 é conhecido por ser dependente do ciclo celular e é mais elevada em S e G2 /M do que em fases G0 /G1 fase [21] , [22]. Para determinar se a expressão reduzida de RAD51 era devido a alterações na distribuição do ciclo celular em células tratadas com berberina, que submetido células tratadas com berberina para análise de citometria de fluxo. Embora o tratamento de berberina (15 uM durante 24 h) reduziu a percentagem de KYSE30 células em S e G2 /M a 49% dos 60% de controlo (dados não mostrados), uma tal alteração não foi suficiente para explicar a redução muitas vezes na o nível de expressão de RAD51. Mais importante ainda, o tratamento com a berberina (15 uM durante 24 h) não alterou significativamente a distribuição de distribuição do ciclo celular de KYSE450 células (44% e 45% para a percentagem de células em S-G2 /fases M em controlo e grupo tratado, respectivamente ), indicando que a diminuição da expressão de RAD51 em resposta a berberina não é devido à reduzida dimensão da população de células em S e G2 /M fases. Assim, a regulação negativa de RAD51 em resposta a berberina é provavelmente independente das mudanças de expressão que estão associados com a progressão do ciclo celular.

A sobre-expressão de

RAD51

está frequentemente associada com um aumento na sua actividade de promotor [23]. Nós próxima clonada do promotor e da região do extremo 5 ‘do

RAD51

(-1.693-487 pb) em um plasmídeo repórter luciferase, vector pGL3-basic, transfectadas las em células de câncer de esôfago, e testou o

RAD51

atividade do promotor em resposta ao tratamento berberina. Como mostrado na Fig. 4C, a actividade do promotor de

RAD51

foi significativamente reduzida em células que foram tratadas com a berberina, quando comparado com o controlo. Juntos, estes resultados mostraram que a berberina foi capaz de regular negativamente a expressão de

rAd5

1 em células de câncer de esôfago ao nível da transcrição.

Porque RAD51 é um jogador-chave na reparação de recombinação homóloga, a sua infra-regulação poderia contribuir para a radiossensibilidade das células pré-tratadas com CICAc berberina. Desde berberina não teve nenhum efeito sensibilizador sobre HNF, nós especulamos que o nível RAD51 não pode ser afectada pelo tratamento berberina na HNF. Nós primeira pesquisados ​​os níveis basais de RAD51 em várias linhas de células não malignas incluindo HNF. Como mostrado na Fig. 4D, os níveis de RAD51 foram muito mais baixos no HNF, hMSC (células estaminais mesenquimais humanas derivadas de cordão umbilical) e XWXL (fibroblastos derivados de um fibroadenoma benigna) do que em células CICAc. Interessantemente, as células endoteliais vasculares umbilicais humanas (HUVEC) e as células HEK-293 que também expressaram niveis elevados de RAD51. No entanto, em contraste com as células CICAc, nenhum dos quatro tipos de células não-malignas mostraram uma regulação negativa da expressão RAD51 por tratamento de berberina (Fig. 4D).

Para determinar se a regulação negativa de RAD51 por berberina aplica-se a outros tipos das células cancerosas, também expuseram células humanas cancro da mama MCF7, células humanas de osteossarcoma U2OS, células de câncer de próstata do rato RM-1 e células de cancro do pulmão do rato LLC para baixas concentrações de berberina por 48 horas e mediu o nível de proteína de RAD51. Como mostrado na Fig. 4E, RAD51 foi regulada negativamente em todas as quatro linhas celulares de cancro testadas, sugerindo que a regulação baixa de RAD51 por berberina não é exclusivo para as células CICAc. Juntos, estes resultados indicam que diferentes tipos de células podem responder de forma diferente ao tratamento berberina em termos de regulação da expressão RAD51.

regulação positiva de RAD51 pelo IR pode ser atenuada por berberina

Observamos que ionizante radiação induziu um aumento da regulação do RAD51 em células CICAc (Fig. 5A). Em consistente com o aumento do nível de proteína no RAD51, o nível de

RAD51

ARNm foi maior em células CICAc que tinha sido exposta a IV (dados não mostrados). Este resultado está de acordo com um relatório anterior da indução RAD51 por IR em células de glioma [24]. Porque IR pode regular positivamente a expressão de

RAD51

, nós próxima testaram se berberina pré-tratamento pode neutralizar este efeito do IR. As células CICAc foram primeiro tratados com berberina, em seguida, com IR e o nível de expressão foi medida RAD51. Em contraste com a elevação de RAD51 em células que foram tratadas com IV sozinho, berberina pré-tratamento eficaz atenuou a sobre-regulação de RAD51 induzida por IR (Fig. 5B), o que indica que a berberina foi capaz de superar a regulação positiva de RAD51 induzida por IR. Não só houve uma redução no nível total de proteína, a formação de focos RAD51 em resposta a RI foi grandemente inibida por berberina (Fig. 5C). A infra-regulação de RAD51 por berberina foi novamente reflectido no nível de transcrição (Fig. 5D).

(A), aumenta a expressão radiação RAD51 em células tumorais. As células foram expostas às doses indicadas de radiação e recolhidas 24 horas mais tarde para análise de imunotransf erência. (B), níveis de proteína Mudança de Rad51 em resposta a berberina e radiação. As células foram pré-tratados com berberina (15 uM) durante 24 h antes de ser irradiada com 6 Gy de raios-X. As células foram recolhidas para análise de imunotransf erência às 24 h após a irradiação. (C), a inibição da formação induzida por radiação focos RAD51 por berberina. Mostram-se imagens de imunof luorescência de KYSE30 e KYSE450 células coradas com anticorpo anti-RAD51, após 24 horas de pré-tratamento com a berberina e a 24 h após a irradiação com 6 Gy de raios-X. A contracoloração DAPI mostrou os núcleos. (D),

RAD51

níveis de ARNm após o pré-tratamento com a berberina (15 uM) durante 24 h (KYSE30) ou 48 h (KYSE450) antes da irradiação com 6 Gy. As células foram recolhidas para quantitativo em tempo real A análise de PCR do RAD51 /rácios de mRNA GAPDH, decorridas 24 horas após a exposição a 6 Gy de raios-X. Imunotransfer�cias e valores de expressão de mRNA são representativos de pelo menos duas experiências independentes.

RAD51 downregulation por RNAi radiosensitizes células cancerosas

Porque berberina pode afetar muitos caminhos celulares que estão envolvidos na proliferação celular e sobrevivência, não pode ser excluído que outros do que a regulação negativa da RAD51 vias eram responsáveis ​​pelo efeito sensibilizador de berbeirne. Para demonstrar que é a regulação negativa da RAD51, que é responsável por este efeito de berberina, o próximo empobrecido RAD51 em células de câncer de esôfago por RNAi e testaram sua radiossensibilidade. Como mostrado na Fig. 6A,

RAD51

expressão poderia ser eficientemente silenciado por siRNA visando especificamente

RAD51

em ambas as linhas celulares. Além disso, a formação espontânea de focos RAD51 foi grandemente reduzida (Fig. 6B). Como esperado, a depleção de RAD51 levou a uma redução significativa na sobrevivência de células clonogénicas para ambas as linhas celulares de cancro do esófago (Fig. 6C). O SF2 foi reduzida para 33,3 ± 0,4% em células RAD51-RNAi KYSE30 de 78,4 ± 1,2% no controle. KYSE450 células mostraram uma resposta semelhante a depleção de RAD51. Assim, o efeito sensibilizador de berberina em células esofágicas foi principalmente mediado pela regulação negativa de RAD51.

(A), regulação negativa do RAD51 por siRNA. Os níveis de proteína RAD51 foram medidos por Western blot. KYSE30 KYSE450 e as células foram transfectadas com o ARNic em cadeia dupla (200 nm) específicos para

RAD51

ou oligo negativo em meio isento de soro, durante 4 h, em seguida, substituído por meio completo durante 24 h. Os extractos celulares totais foram recolhidos para análise por Western blot utilizando anticorpos RAD51. (B). formação de focos RAD51 induzida por radiação reduzida em células de câncer de esôfago em que

RAD51

foi silenciado por RNAi. As células foram expostas a 6 Gy de raios-X a 28 h após a transfecção com o ARNic em cadeia dupla. (C), Efeito de RAD51 knockdown em radiossensibilidade de células de cancro esofágico, como determinado por ensaio de sobrevivência clonogénica. (D), a análise de transferência de Western de proteína RAD51 em células cancerosas que foram transfectadas com pcDNA3.1 ou pcDNA3.1B-mRAD51. Os imunoblots apresentados são representativos de duas experiências independentes com GAPDH que serve como um controlo de carga de proteína (linha celular KYSE30 /KYSE450-mãe, as células estavelmente transfectadas com pcDNA3.1 KYSE30 /KYSE450 (pcDNA3.1), células mRAD51) (KYSE30 /KYSE450 transfectadas estavelmente com pcDNA3.1B-mRAD51). (E) Efeito de sobreexpressão em RAD51 radiossensibilidade de células de cancro esofágico, como determinado por ensaio de sobrevivência clonogénica. Os resultados para as células transfectadas com o vector pcDNA3.1 mRAD51 ou tratados com berberina foram comparados (* P 0,01).

Introdução de RAD51 exógeno neutraliza o efeito sensibilizador de berberina

Para validar ainda mais o papel de RAD51 como um jogador-chave na mediação do efeito radiosuscetível de berberina, fizemos uma construção que expressa RAD51 murino sob o promotor CMV, pcDNA3.1B-mRAD51, e tinha células CICAc estavelmente transfectadas. Expressão do RAD51 exógeno era evidente em células transfectadas com mRAD51, como mostrado por Western blot (Fig. 6D). Importantemente, o efeito sensibilizador de berberina foi significativamente atenuada em ambas as linhas celulares KYSE30 e KYSE450 que foram transfectadas com mRAD51 (Fig. 6E). Estes resultados, juntamente com os obtidos com RAD51-RNAi, demonstrou que RAD51 é um determinante crítico da radiorresistência em células CICAc.

RAD51 superexpressão é comum em tecidos de câncer de esôfago

A sobre-regulação da

RAD51

expressão é comum em linhas de células de tumor [25] e num número de doenças malignas humanas [26], [27], [28]. A seguir, avaliou o

RAD51

nível de expressão de um painel de 86 tecidos de esôfago primários humanos carcinoma de células escamosas pela coloração imuno-histoquímica. A coloração nuclear e /ou citoplasmático de RAD51 foi detectada em 81 dos 86 espécimes. Nos espécimes que apresentam coloração positiva de RAD51, distribuição subcelular e intensidade foram variadas. A intensidade foi pontuado como 1 em 29, em 2 43, e 3 em 9. seis amostras mostraram uma coloração nuclear predominante, 30 amostras apresentaram coloração citoplasmática predominante, e 45 amostras apresentaram coloração tanto citoplasmática e nuclear (Fig. 7A-E). Em contraste,

RAD51

expressão era baixa ou ausente em tecidos normais circundantes do carcinoma (Fig.7F). No entanto, não foi encontrada correlação entre os níveis de expressão RAD51 e os parâmetros clínico-patológicos em ESCCs (Tabela 1). No entanto, os nossos resultados mostraram que RAD51 é geralmente sobre-expresso em espécimes CICAc. Porque superexpressão de RAD51 geralmente confere resistência a agentes que danificam o ADN [29], [30], [31], nossos resultados exigem medidas que regulam negativamente RAD51 a fim de atingir alta radioterapia ou eficácia quimioterápico de ESCCs em ambientes clínicos. Curiosamente, o tratamento com a berberina também regulada negativamente RAD51 em três linhas adicionais esofágicas celulares de cancro (KYSE410, EC109, e Te-1), tal como no KYSE30 e KYSE450 células (dados não apresentados), sugerindo que a berberina pode tornar efeito sensibilizador a um amplo matriz de células de câncer de esôfago.

Imagens de mostrar nível de expressão diferente e distribuição celular são mostradas. (A), a ausência de coloração (núcleos azuis devido à Hemalum contracoloração de Mayer) específicos para RAD51. (B), níveis baixos de RAD51 no citoplasma, mas não em núcleos, as células de carcinomas invasivos. (C), os níveis intermédios de RAD51 tanto no citoplasma e núcleo das células de carcinoma invasivo. (D), elevados níveis de RAD51 no citoplasma, mas não em núcleos, as células de carcinomas invasivos. (E), elevados níveis de RAD51 nuclear nos núcleos de células de carcinoma invasivo. Nenhuma coloração citoplasma é evidente. (F), a ausência de coloração em RAD51 tecido esofágico normal. A imuno-histoquímica foi realizada como em Materiais e Métodos. Todas as imagens originais foram capturados em × 400 ampliação.

Discussão

Nós demonstramos pela primeira vez que a berberina pode eficientemente regular negativamente a expressão RAD51 em células cancerosas em conferir radiossensibilidade. Berberina tratamento conduziu a uma redução em

RAD51

transcrição e uma inibição

RAD51

actividade do promotor. Também pode superar a regulação positiva de RAD51 que é induzido por radiação (IR) ionizante. O efeito sensibilizador de berberina foi atenuada em células cancerosas que superexpressam RAD51 exógena. Regulação negativa de RAD51, que é essencial para a reparação de recombinação homóloga, muito prejudicada a reparação de DSB induzidos por IR e conduziu a fraca sobrevivência das células tratadas com IR. Importante, observou-se que RAD51 era comumente regulada nos tecidos CICAc humanos, que possam tornar resistência a terapias que visem DNA. Portanto, a administração de berberina como um radio- e chemosensitizer pode servir como uma estratégia no tratamento de pacientes CICAc.

A sobre-regulação de RAD51 em células de cancro foi mostrada para ser associada ao aumento da quimiorresistência [29], [30] . Vários estudos anteriores também mostraram que algumas drogas anti-câncer tornar as células cancerosas radiossensível e quimiossensíveis por downregulating RAD51 e, consequentemente, prejudicando a reparação de recombinação homóloga em células cancerosas. Por exemplo, imatinib (Gleevec), que inibe a tirosina cinase c-Abl, pode reduzir a eficiência da expressão de RAD51 em células cancerosas e conferem radiossensibilidade [24], [32]. Gefitinib, um inibidor de crescimento epidérmico tirosina-quinase do receptor do factor selectiva, foi encontrada para regular negativamente RAD51 em células de cancro do pulmão e os sensibilizar a mitomicina C [33] e gemcitabina [34]. Fenil ácido hidroxâmico PCI-24781, um inibidor da histona desacetilase que tem um efeito sensibilizador sobre células de cancro, também actua por downregulating RAD51 [35]. Além de ter uma série de efeitos secundários, estes medicamentos tendem a ser muito caros.

Muitos produtos naturais têm valores medicinais notáveis. Além de ser mais acessível, medicamentos à base de plantas geralmente têm uma baixa toxicidade. Vários compostos naturais têm sido encontrados para conferir radiossensibilidade e quimiossensibilidade em células cancerosas. Um estudo mostrou que a curcumina, um componente de cúrcuma (

Curcuma longa

), poderia radiossensibilizar células de cancro da próstata através da inibição da função de NFkB, que levou a uma baixa regulação do gene anti-apoptótica

Bcl-2

[36]. O tratamento de células de cancro cervical com a curcumina levou a uma maior produção de espécies reactivas de oxigénio induzida por IR (ROS), o que provoca a activação de ERK1 /2-MAPK sustentada [37]. Em contraste, emodina, uma substância encontrada em algumas plantas, incluindo ruibarbo, foi relatado para inibir a activação de ERK1 /2 em células de cancro do pulmão, o que por sua vez conduz a uma regulação negativa da RAD51 e confere quimiossensibilidade [38], [39].

Huang Lian é uma das ervas medicinais mais comumente usados ​​na China. É uma das 12 ervas medicinais mais vulgarmente utilizados nos Estados Unidos [40]. Para além do seu uso comum como uma droga para o desconforto gastrintestinal, a berberina tem sido testado em ensaios clínicos de diabetes mellitus tipo 2 [41], [42] e em hipercolesterolemia [43]. É importante ressaltar que os pacientes que tomam experiência Berberina efeitos secundários relativamente suaves. Enquanto os estudos anteriores mostraram que a berberina possui efeitos directos anti-tumoral através da indução da produção de espécies de oxigénio reactivas nas células cancerosas, que presumivelmente conferir radiossensibilização [44], [45], [46], [47], o nosso estudo é o primeiro para mostrar que a berberina pode conferir radiossensibilidade por downregulating um jogador-chave na reparação de LAP. Deve notar-se que a potência de berberina em downregulating RAD51 em células CICAc é comparável à de Glivec em células de glioma [24]. Em concentrações mais elevadas, a berberina é esperado que desempenham um papel duplo na promoção da morte das células nas quais ele é retido, por infligindo danos no ADN e, simultaneamente, prejudicar um caminho que é responsável para a reparação do dano. Importante, em concentrações que conferem radiossensibilidade de células de cancro do esófago, a berberina não teve nenhum efeito sensibilizador sobre fibroblastos humanos normais. Correspondentemente, a berberina não foi observada para regular negativamente RAD51 em células não malignas. Estes resultados sugerem que o efeito radiosuscetível de berberina pode ser específico para células cancerosas.

Em resumo, mostramos que a berberina em baixas concentrações radiosensitized substancialmente células de carcinoma espinocelular de esôfago. Actua por downregulating RAD51, um jogador-chave na reparação de recombinação homóloga, levando a prejuízo no reparo de quebras de cadeia dupla. Nossas descobertas descoberto, assim, uma actividade biológica até agora não reconhecidos de uma droga vulgarmente utilizado e barato e indicou que a berberina, com a sua toxicidade relativamente baixa, pode ser usado como um adjuvante em terapia de radiação do cancro.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Todos os procedimentos que envolvam amostras clínicas foram aprovados pelo Comitê de Shandong University School of Medicine de Ética.

Linhas Celulares

Todas as células foram cultivadas a 37 ° C em incubadora humidificada contendo 5% de CO

2. O carcinoma epidermóide de esôfago humano (ESCC) linhas KYSE30, KYSE450, KYSE410, EC109 e TE-1 foram obtidos a partir Cancer Institute Hospital, Academia Chinesa de Ciências Médicas (Pequim) e cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades /mL de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. KYSE30, KYSE450 e KYSE410 foram originalmente gerada pelo Dr. Yutaka Shimada, células (NHF) de fibroblastos humanos normais foram obtidos do Instituto de Ciências Médicas Básicas, da Academia Chinesa de Ciências Médicas (Beijing), e foram mantidas em DMEM suplementado com 10% fetal de soro de bovino, 100 unidades /mL de penicilina-estreptomicina e 4 ng /ml de bFGF. As HUVECs foram obtidas a partir de ATCC. células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano foram uma oferta do Dr. Dong Li, Hospital Qilu, Universidade de Shandong. Fibroblastos (XWXL) foram estabelecidas a partir de um fibroadenoma removido cirurgicamente, com o consentimento informado do paciente e aprovado pelo Comitê de Ética da Shandong University School of Medicine.