Abstract
Midkine (MDK) é um factor de crescimento de ligação à heparina que é altamente expresso em muitos tumores malignos, incluindo os cancros do pulmão. MDK activa a via de PI3K e induz a actividade anti-apoptótica, por sua vez, aumentar a sobrevivência de tumores. Por conseguinte, a inibição da RDM é considerada uma estratégia potencial para a terapia do cancro. No presente estudo, demonstramos um romance pequena molécula composto (iMDK) que tem como alvo MDK. iMDK inibiu o crescimento celular de células de adenocarcinoma de pulmão H441 MDK-positivas que abrigam um oncogénica
KRAS
mutação e células de cancro do pulmão de células escamosas H520, sendo que ambos são tipos de cancro do pulmão não tratável. No entanto, iMDK não reduziu a viabilidade celular de células de adenocarcinoma do pulmão A549 MDK-negativas ou células normais de fibroblasto de pulmão humano (NHLF) indicando a sua especificidade. iMDK suprimida a expressão endógena do RDM mas não a de outros factores de crescimento tais como o PTN ou VEGF. iMDK suprimiu o crescimento de células H441 através da inibição da via da PI3K e indução de apoptose. administração sistêmica de iMDK inibiu significativamente o crescimento do tumor em um rato modelo de xenotransplante
in vivo
. A inibição do RDM com iMDK fornece uma aproximação terapêutica potencial para o tratamento de cancros do pulmão que são movidos por MDK
citação:. Hao H, Maeda, Y, Fukazawa t, Yamatsuji t, Takaoka H, Bao XH, et ai . (2013) Inibição do Factor de Crescimento MDK /Midkine por um novo composto pequena molécula para tratar Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 8 (8): e71093. doi: 10.1371 /journal.pone.0071093
editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão
Recebido: 23 Março, 2013; Aceito: 25 de junho de 2013; Publicação: 16 de agosto de 2013
Direitos de autor: © 2013 Hao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo National Institutes of subvenções (NIH) Saúde para maxila (https://report.nih.gov/index.aspx, número de concessão: HL095580, HL108907, HL110964), do Ministério da Educação, Ciência e Cultura, Japão, para YN (https://www.jsps.go.jp/english/index.html, conceda número: 23591950) e da Universidade de Cincinnati de Pós-Doutorado Programa Research Fellow para YM. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:. Dr. MN é um empregado de uma empresa comercial “SBI Pharmaceuticals Co., Ltd ‘. No entanto, SBI Pharmaceuticals Co., Ltd não financiar este estudo e não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Emprego pela SBI Pharmaceuticals Co., Ltd. não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.
Introdução
o cancro do pulmão é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo [1,2]. esquemas quimioterápicos convencionais como alvo as células de câncer de pulmão, mas também células em proliferação normais. Atualmente, a sobrevivência após a quimioterapia convencional de adenocarcinoma de pulmão (o tipo mais comum de câncer de pulmão) fornece menos de sobrevivência média de um ano a partir do momento do diagnóstico [3]. terapias específicas da via molecular para o adenocarcinoma do pulmão, por exemplo, tendo como alvo mutante
EGFR
ou
ALK
fusões, limitar a toxicidade não-tumor e prolongar o tempo de sobrevivência em comparação com as quimioterapias convencionais [4] – [6 ]. No entanto, não há nenhuma terapia alvo molecular para o mutante
KRAS
adenocarcinoma -driven pulmão, o tipo mais frequente de adenocarcinoma de pulmão na população caucasiana. Além disso, eficazes terapias orientadas molecularmente foram desenvolvidos para os adenocarcinomas, mas não carcinomas de células escamosas. Por conseguinte, as terapias específicas que têm como alvo vários tipos de tumores do pulmão são desesperadamente necessário [7] – [9].
Midkine (MDK) é um factor de crescimento de ligação à heparina que é altamente expressa em muitos tumores malignos, incluindo o pulmão, esôfago, estômago, cólon, hepatocelular, da mama, carcinoma renal e pancreático [10] – [15]. MDK se liga aos receptores de membrana múltiplas, ALK, syndecans, PTP e LRP, e, posteriormente, ativa a quinase PI3 (PI3K) e as vias MAP quinase. Estas duas vias de induzir a proliferação celular e intensificar as actividades angiogénicas e anti-apoptóticos [16], [17]. A inibição da
MDK
por siRNA suprime o crescimento celular das células cancerosas que expressam MDK [18], indicando que MDK pode ser um alvo potencial para terapia de câncer de pulmão. Desde camundongos sem o
Mdk
gene são viáveis [19], visando MDK é uma abordagem terapêutica atraente desde a sua inibição é pouco provável que tenha efeitos deletérios sistémicos. O reconhecimento do papel potencial da via MDK no tratamento de câncer tem aumentado os esforços para identificar inibidores MDK. Matsui et ai. peptídeos sintéticos identificados e compostos que inibem a migração de células MDK-mediada
in vitro
; no entanto, estes não se mostrou potente e carecem de utilidade clínica [20].
No presente estudo, identificou-se um composto de baixo peso molecular (iMDK) que suprimiu a expressão MDK endógeno. iMDK inibiu o crescimento de MDK-expressando H441 células de adenocarcinoma de pulmão que abrigam uma oncogênico
KRAS
mutação e as células de câncer de pulmão de células escamosas H520
in vitro
. Além disso, iMDK suprimiu o crescimento do tumor de pulmão e morte celular induzida por inibição da via de PI3-cinase e induzir a apoptose em um modelo de murganho de xenoenxerto derivado a partir de células de adenocarcinoma de pulmão H441. Segmentação a expressão de MDK fornece uma nova abordagem terapêutica para o tratamento de MDK-expressando cancros do pulmão de células não-pequenas.
Materiais e Métodos
Reagentes
3- [2 – (4-fluorobenzil) imidazo [2,1-beta] [1], [3] tiazol-6-il] -2H-cromen-2-ona (daqui em diante iMDK) adquirido a ChemDiv (San Diego, CA) foi dissolvida em DMSO. PD0325901 (um inibidor MEK) foi obtido a partir signalinginhibitors.com (Wedel, Schleswig Holstein, Alemanha).
linhas de células e condições de cultura
As células de adenocarcinoma de pulmão humanos H322, H358, H441 e A549 e os do pulmão humano de células de carcinoma de células escamosas H520 foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e cultivadas em meio RPMI 1640 (H322, H358, H520) ou alto teor de glucose meio de Dulbecco modificado de Eagle (H441, células A549) suplementado com 10 % inactivado pelo calor soro fetal de bovino. As células de mesotelioma maligno humanos ACC-MESO-1 (MESO-1) obtido a partir JCRB Cell Bank (Osaka, Japão) e as células carcinoma de células escamosas do pulmão humano SQ5 gentilmente cedido pelo Dr. partir Kiura Katsuyuki (Departamento de Hematologia, Oncologia e Respiratory Medicine, Okayama University Graduate School of Medicine, Odontologia e Ciências Farmacêuticas, Okayama, Japão) [21] foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor. Os fibroblastos de pulmão humanos NHLF células normais obtidos a partir de Clonetics (San Diego, CA) foram cultivadas em meio de Eagle modificado alto teor de glucose de Dulbecco. Todas as linhas celulares foram cultivadas em 5% de CO
2 a 37 ° C.
Immunoblot análise
As células foram lisadas em gelo-frio M-PER de tampão de lise adquiridos a Thermo Fisher Scientific ( Rockford, IL). Os lisados celulares foram clarificados por centrifugação (20 min a 15.000 x g a 4 ° C) e a concentração de proteína determinada usando o ensaio de proteína BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). Quantidades iguais de proteínas foram separadas num gel de SDS-PAGE. O gel foi transferidas electroforeticamente para uma membrana Hybond transferência de PVDF (GE Healthcare Ltd., Piscataway, NJ) e incubados com anticorpos primários e secundários de acordo com a Supersignal
® protocolo quimioluminescência West Pico (Pierce, Rockford, IL). Anticorpo específico para o anticorpo β-actina foi obtido a partir de Sigma (St. Louis, MO) e o anticorpo específico para a RDM humana e PTN (pleiotrofina) foram obtidos a partir de Abcam (Cambridge, Reino Unido). Anticorpo específico para a caspase-3, PI3 quinase p85, p85 fosforilada por PI3K (Tyr458) /p55 (Tyr199), AKT, fosforilado-AKT (Ser473), ERK1 /2, fosforilado-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p38MAPK, MAPK fosforilada por p38 (Thr180 /yr182), Bad, XIAP, survivina foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). O anticorpo específico para o VEGF foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). anticorpos conjugados com peroxidase de rábano secundária foram obtidos de Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA).
siRNA inibição mediada de MDK
A. As células H441 foram semeadas numa placa de 12 poços a uma densidade de 1 x 10
5 por poço e cultivadas durante a noite a 37 ° C. No dia seguinte, 100 pmol de dois diferentes ARNsi de segmentação MDK (D-003677-02-0050 e D-003677-03-0050) ou nontargeting siRNA (Thermo Scientific) foi transfectado usando 2 ul de Lipofectamina 2.000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA ) de acordo com as instruções do fabricante. O tempo de incubação para os reagentes de transfecção foi de 24 horas, altura em que o meio tempo foi substituído com meio fresco normal. As células foram colhidas 48 horas após transfecção por ensaios de imunotransferência e de crescimento celular.
A viabilidade celular ensaio
H441, células A549, H520, células HEK293 e células NHLF foram plaqueadas em placas de 24 poços a uma densidade de 1 x 10
5 células e cultivados a 37 ° C durante 24 horas. O meio foi removido por aspiração e substituído com meio de cultura fresco contendo iMDK dissolvido em DMSO (10, 50, 100, 500 nmol /L). DMSO sozinho foi utilizado como controlo. As células foram tratadas durante 48 horas e recolhidas através de tripsinização. As células viáveis foram avaliadas por exclusão de azul de tripano e ensaios de WST-1 (Roche Molecular Biochemicals, Laval, Quebec, Canadá), de acordo com o protocolo do fabricante. Recombinante MDK foi adquirido a R D Systems (Minneapolis, MN) e reconstituído em água para experiências de bloco. Para as experiências de bloco MDK, H441 células foram cultivadas em meio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado com 1% de bovino fetal inactivado pelo calor durante a noite e MDK recombinante (25 nM) e /ou iMDK (25 nM) foi adicionado durante um período adicional de 48 horas.
Hoechst coloração
características morfológicas de apoptose foram avaliados usando Hoechst 33342 dye (Molecular Probes, Eugene, OR), que mancha DNA. As células foram incubadas com 1 ug /ml de corante Hoechst e, em seguida visualizados sob um microscópio de fluorescência (IX81, Olympus Medical Systems Corp., Tóquio, Japão) [22].
TUNEL coloração
desoxinucleotidiltransferase terminal marcação terminal dUTP nick-biotina mediada (TUNEL) coloração foi realizada para detectar a apoptose utilizando o sistema de TUNEL deadend colorimétrico (Promega, Madison, WI) de acordo com o protocolo do fabricante.
análise citométrica de fluxo da apoptose
as células foram plaqueadas em placas de 24 poços a uma densidade de 0,5 x 10
5 culas por po um dia antes do tratamento. Após 72 horas, as células foram colhidas e lavadas uma vez com PBS. As células foram ressuspensas em PBS contendo 0,2% de Triton X-100 e 1 mg /ml de RNase durante 5 min à temperatura ambiente e, em seguida, coradas com iodeto de propídio a 50 ug /ml para determinar sub-L
0 /L
1 conteúdo em ADN utilizando um FACScan. Parelhas, restos celulares e artefatos de fixação foram fechado para fora, e
0 /G
1 Conteúdo sub-G DNA foi determinada usando celular Busca Ver. 3.3 software
Mouse experimentos
O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Revisão Ética em Experimentação Animal da Okayama University Graduate School of Medicina e Odontologia. (Número de referência do Comitê de Ética: Oku-2011472). xenoenxertos de cancro do pulmão humano foram estabelecidos em 6 semanas de idade BALB /c ratos pelados (Charles River Laboratories Japan, Kanagawa, Japan) por injecção subcutânea (SC) a inoculação de células H441 (1 × 10
6/50 ul) misturado com Matrigel
® (BD Pharmingen, San Diego, CA, 50 mL) no flanco dorsal [23]. Os ratos foram distribuídos aleatoriamente em três grupos (n = 8 por grupo) 14 dias após a inoculação do tumor. Um grupo de ratinhos foi intraperitoneal tratado com solução de 100 ul contendo iMDK (9 mg /kg) três dias por semana (nos dias 1, 3, 5, 8, 10) e outro grupo de ratos foi tratado de cinco dias por semana (em dias 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10). DMSO foi administrada para o grupo de controlo. Os tumores foram medidos duas a três vezes por semana, e o volume do tumor foi calculado como uma × b
2 × 0,5, onde a e b foram diâmetros grandes e pequenas, respectivamente. No dia 10, o peso corporal foi medido e, em seguida, todos os ratinhos foram sacrificados e os tumores removidos e preparados para exame histológico. Para a análise de AST e ALT no soro, o sangue foi colhido a partir do coração 48 horas após o tratamento com iMDK (9 mg /kg).
para imuno-histoquímica, os cortes foram desparafinados em sequência através de uma série de xileno, etanol graduada, e os passos de imersão em água. Depois de ser autoclavada em tampão de citrato a 0,2% durante 15 minutos, as secções foram incubadas com peróxido de hidrogénio a 3% durante 30 minutos para bloquear a actividade da peroxidase endógena. Um anticorpo primário específico para p85 fosforilada por PI3K (Tyr458) /p55 (Tyr199) foi obtido a partir de Cell Signaling Technology. Os anticorpos para a RDM e CD31 /PECAM-1 eram de Abcam. O anticorpo para o VEGF era de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). As amostras foram incubadas durante a noite a 4 ° C com uma diluição de anticorpo 1:200 seguido de três lavagens com TBS. Os slides foram tratados com complexo de estreptavidina-biotina (Envision Sistema de polímero marcado, peroxidase de rábano [HRP], Dako, Carpinteria, CA) durante 60 minutos a uma diluição de 1:100. Immunoreactions foram visualizadas utilizando uma solução de substrato-cromogénio 3,3′-diaminobenzidina (DAB) (Dako Cytomation Líquido DAB Substrato Cromogénio Sistema, Dako) e contrastadas com hematoxilina. Os cortes foram imersos num banho de etanol e xileno e montadas para exame.
A análise estatística
As diferenças estatisticamente significativas entre as médias e medianas dos grupos em estudo foram avaliadas por meio do teste t de Student. A significância estatística foi definida como p 0,05 (#) ou p 0,01 (*)
Resultados
A inibição da MDK reduz a viabilidade de células de adenocarcinoma de pulmão H441
A fim. para encontrar uma linha celular NSCLC que é dependente de MDK para o crescimento celular, avaliamos a expressão endógena de proteína MDK em quatro diferentes células l ines NSCLC e células NHLF (normal pulmão humano fibroblastos). células de rim embrionário HEK293 foram usadas como controlo positivo para a expressão MDK. Como mostrado na Figura 1A, MDK foi detectada em células HEK293, H441 células de adenocarcinoma de pulmão e de pulmão humano de células de carcinoma de células escamosas H520 mas não em A549, H322 e H358 células de adenocarcinoma de pulmão, células de carcinoma de células escamosas SQ5 pulmonares ou 1 meso-células mesotelioma maligno . RDM não foi expressa em células normais NHLF. A linha celular H441 é derivada de um tumor do pulmão NSCLC que tem um
KRAS
mutação. Activado
RAS
é a mutação mais comum associado com adenocarcinomas pulmonares na população caucasiana e tratamentos eficazes para esta doença ainda não foram identificados [24]. A fim de determinar se as células H441 dependem MDK para a viabilidade celular, que inibiu MDK utilizando siRNA e examinou o crescimento de células na presença e ausência de RDM. Como mostrado na Figura 1B, 48 horas após a transfecção, dois siRNAs MDK diferentes suprimida RDM em comparação com células H441 siRNA não segmentação. A inibição do crescimento foi significativamente induzida pela supressão do RDM (p 0,01; Figura 1C). Estes resultados demonstram que a segmentação MDK é uma estratégia eficaz para suprimir o crescimento de células de expressar MDK-cancro do pulmão de células não pequenas.
MDK foi detectada em células HEK293, H441 células de adenocarcinoma de pulmão e de pulmão humano células de carcinoma de células escamosas H520 mas não em outros tipos de células, incluindo células NHLF (normal pulmão humano de fibroblastos). A expressão da proteína de RDM e μ-actina foi confirmada por imunotransferência como descrito nos Métodos. A. MDK foi suprimida por dois siRNAs MDK diferentes (MDK siRNA1 e MDK siRNA2) em células H441. A expressão da proteína foi confirmada por imunotransferência como descrito em A. B. inibição do crescimento em células H441 após o silenciamento do gene MDK foi significativamente aumentada. A viabilidade celular foi avaliada por ensaio de exclusão de azul de tripano como descrito nos Métodos. A significância estatística foi definida como p . 0,01 (*)
iMDK inibe a expressão MDK endógeno em células de adenocarcinoma de pulmão H441
A fim de encontrar um composto terapêutico que inibe a expressão MDK, nós primeiro desenvolvida uma linha de células relatora MDK por transfecção de forma estável células HEK293 com um constructo de luciferase MDK promotor-fundido. Nós usamos esta linha de células modificadas para rastrear 44.000 compostos no Discovery Center Drogas na Universidade de Cincinnati. Detecção de actividade de luciferase foi utilizado para identificar inibidores de RDM. Neste rastreio, foi identificado um composto (3- [2- (4-fluorobenzil) imidazo [2,1-beta] [1], [3] tiazol-6-il] -2H-cromen-2-ona; daqui em diante iMDK, Figura 2A) que reproducibly inibido de proteína endógena MDK EXPRE ssion. Foram avaliadas a eficácia da iMDK pela sua capacidade para inibir especificamente a expressão do RDM em H441 células. Tal como mostrado na Figura 2B, iMDK inibida MDK endógeno numa forma dependente da dose, mas não inibiu a PTN (pleiotrofina), que tem uma homologia considerável a MDK [17]. Nem iMDK inibir outro factor de crescimento, VEGF, na H441 pulmão células de adenocarcinoma de 48 horas após o tratamento.
A. Estrutura de iMDK (3- [2- (4-fluorobenzil) imidazo [2,1-beta] [1], [3] tiazol-6-il] -2H-cromen-2-ona). B. MDK mas não PTN ou VEGF foi suprimida por iMDK dependentemente da dose em células H441 48 horas após o tratamento. A análise de imunotransferência foi realizada como descrito em Métodos.
iMDK inibe a viabilidade celular de células que expressam MDK de carcinoma do pulmão de células não-pequenas
Para determinar a eficácia e especificidade da iMDK na supressão MDK-expressando células tumorais, nós tratados ambas as células MDK-positivos e MDK-negativas com iMDK e viabilidade celular avaliada. RDM é expresso em células HEK293 de rim embrionário, células de adenocarcinoma de pulmão H441 e células de carcinoma de células escamosas do pulmão H520 mas não em células de carcinoma do pulmão A549 ou células NHLF não transformadas (Figura 1A). Estes cinco linhas celulares foram tratadas com uma gama de concentrações iMDK (0 a 500 nM) e a viabilidade celular foi avaliada 48 horas após o tratamento. A inibição do crescimento por iMDK era dependente da dose, induzida no MDK-positiva HEK293, H441 e H520 células, mas não a células A549 ou células não transformadas NHLF (Figura 3A, S1) MDK-negativo. Morfologicamente, a supressão do crescimento de células H441 foi dependente da dose, observada 48 horas após o tratamento com iMDK (Figura 3B). A supressão do crescimento celular por iMDK foi parcialmente bloqueada pelo pré-tratamento com RDM recombinante (25 nM) em células H441 MDK-positivos; No entanto, o pré-tratamento com RDM recombinante não alterou significativamente o crescimento celular em células A549 MDK-negativa (Figura S2). Esta descoberta sugere que o efeito supressor sobre o crescimento celular por iMDK é mediada, pelo menos em parte, pela inibição da expressão de RDM.
B. A inibição do crescimento por iMDK foi aumentada no MDK-positiva HEK293, H441 e H520 células, mas não a células A549 ou células normais NHLF MDK-negativo após 48 horas de tratamento. A viabilidade celular foi avaliada por ensaio de exclusão de azul de tripano como descrito nos Métodos. A significância estatística foi definida como p 0,01 (*). inibição do crescimento dependente da dose foi observada por iMDK morfologicamente em H441 células de adenocarcinoma de pulmão. São mostradas microfotografias de contraste de fase de células H441 48 horas após o tratamento iMDK (barra de escala mostra 100 mm).
iMDK induz a apoptose em células de adenocarcinoma de pulmão H441
A fim de compreender o mecanismo pelo qual iMDK inibe o crescimento de células H441, avaliou-se as células para a apoptose 48 horas após o tratamento com iMDK. Como mostrado na Figura 4A, altamente condensados e parcialmente núcleos fragmentados foram observados em células H441, mas não em células normais NHLF após o tratamento com iMDK, indicando que a apoptose induzida em iMDK MDK-expressando células H441. células positivas TUNEL foram também aumentadas significativamente em células H441 após tratamento iMDK horas de um modo dependente da dose (Figura 4B), confirmando ainda a indução de apoptose por iMDK. Tal como mostrado na Figura 4C, formas clivadas de caspase-3, um marcador de apoptose foi induzida por iMDK mesmo nas concentrações mais baixas (5 nM) em células H441 após 48 horas de tratamento. sub-L
0 /L
1 conteúdo de ADN de células H441 foi altamente aumentou de 1,24% (controlo de DMSO) a 37,00% (10 nM) e 60,91% (25 nM) 72 horas após o tratamento com iMDK. No entanto, sub-L
0G
1 ADN conteúdo de células NHLF foi minimamente aumentado de 0,32% (controlo de DMSO) a 0,52% (10 nM) e 1,51% (25 nM), após o tratamento com iMDK (Figura 4D) . Colectivamente, estes resultados indicam que iMDK induz selectivamente apoptose em MDK-H441 expressando células de adenocarcinoma de pulmão, mas não em células normais NHLF que não expressam MDK.
iMDK dependente da dose, aumento da apoptose em células H441, mas não em células normais NHLF . As células foram tratadas com as concentrações indicadas de iMDK durante 72 horas e depois coradas com corante Hoechst 33342 e analisado sob um microscópio de fluorescência, tal como descrito em Methods (barra de escala mostra 50 um). A apoptose foi induzida em células H441 após o tratamento 48 horas iMDK a uma concentração de 25 nM (painel superior, mostra a barra de escala 200? M). células positivas TUNEL foram aumentadas por tratamento iMDK de um modo dependente da dose (painel inferior). TUNEL coloração foi realizada como descrito em Métodos. A significância estatística foi definida como p 0,05 (#). A. caspase-3 clivada, um marcador de apoptose, foi aumentada em células H441 após tratamento iMDK. As células H441 foram tratados durante 48 horas com iMDK nas concentrações indicadas e de colheita de análise de imunotransf erência como descrito nos Métodos. induzida D. iMDK sub-G
0 /G
1 conteúdo de DNA em células H441. As células foram tratadas com iMDK durante 72 horas e o teor de ADN foi medida por coloração com iodeto de propídio e análise de citometria de fluxo como descrito em Métodos.
iMDK suprime a PI3K e induz as vias apoptóticas em células de adenocarcinoma de pulmão H441
PI3K está envolvido na tumorigénese através da activação AKT, que por sua vez aumenta a factores anti-apoptóticos, como XIAP e de survivina, e diminui um factor pró-apoptótica BAD [25] – [27]. Desde MDK activa a actividade de PI3K [16], [28], procurou-se determinar se a via PI3K foi suprimida pela inibição MDK iMDK mediada em células H441. A fosforilação de PI3K e AKT foram suprimidos por iMDK em uma dose (Figura 5A) e forma dependente do tempo (Figura 5B), indicando que a via PI3K /AKT é inibida por iMDK. factores anti-apoptóticos, XIAP e survivina, foram reduzidas enquanto que o factor pró-apoptótica, Bad, foi induzida por iMDK numa dose e dependente do tempo da forma (Figura 5), indicando que a via de apoptose é induzida por iMDK. MDK também é conhecida para activar ERK (uma MAPK) em células não tumorigénicas normais [16], [28]; No entanto, ERK e p38MAPK não foram inibidas por iMDK H441 em células de adenocarcinoma de pulmão (Figura S3). Estes resultados indicam que iMDK suprime a via de PI3K /Akt, mas não a via da MAPK e por sua vez provoca a apoptose em células H441.
. Dependentemente da dose, a fosforilação de PI3K e AKT e a expressão de XIAP e de survivina, factores anti-apoptóticos, foram reduzidos, enquanto a expressão de Bad, um factor pró-apoptótica, foi aumentada 48 horas após o tratamento com iMDK. É mostrado de imunotransferência realizada como descrito em Métodos. B. dependente do tempo, a fosforilação de PI3K e AKT e a expressão de XIAP e de survivina foram diminuiu enquanto a expressão de Bad foi aumentada por tratamento com iMDK a uma concentração de 50 nM. De imunotransferência foi realizada como descrito em Métodos.
iMDK suprime o crescimento do tumor de pulmão e induz a apoptose em um modelo de murganho de xenoenxerto
A fim de determinar se a administração sistémica de iMDK suprime o crescimento do tumor
in vivo
, iMDK (9 mg /kg) foi injectado por via intraperitoneal ou 3 ou 5 vezes por semana em ratinhos nus portadores de xenotransplantes derivados de células de adenocarcinoma de pulmão H441 14 dias após a inoculação do tumor. Lung xenoenxertos de tumor continuou a crescer no controlo (tratado com DMSO) grupo, enquanto o crescimento do tumor de pulmão foi preso nos grupos tratados com iMDK. O volume dos tumores no grupo tratado com iMDK foi significativamente mais baixa do que no grupo controlo (Figura 6A e 6B). MDK e PI3K fosforilada foram observadas em tumores de pulmão de ratos de controlo, mas não nos murganhos tratados com iMDK (Figura 6C), consistente com
in vitro
estudos (Figura 5). fragmentação de ADN detectadas por coloração TUNEL foi induzida em tumores de ratos tratados com iMDK mas não nos que a partir de ratinhos de controlo (Figura 6D), o que indica que induz a apoptose iMDK
In vivo
bem. Notavelmente, o tratamento de iMDK não influenciaram os níveis de peso corporal e séricos de AST e ALT nos ratos (Figura S4), sugerindo que iMDK não causa toxicidade sistémica.
A. Volume dos tumores derivados de células de adenocarcinoma de pulmão H441 foi reduzida após tratamento com iMDK (9 mg /kg) em um modelo de murganho de xenoenxerto. DMSO foi usado para o grupo de controlo. iMDK foi administrado 3 vezes /semana ou 5 vezes /semana, como mostrado. Oito ratos foram usados em cada grupo. O volume do tumor foi monitorizada todos os dias após a inoculação de células H441. O crescimento do tumor é expresso como o volume médio do tumor; barras representam SD. A significância estatística foi definida como p 0,01 (*). B. É mostrada uma imagem de tumores de xenoenxerto de derivados a partir de células H441, que são dissecados a partir de ratinhos de xenoenxerto de 10 dias após o tratamento com iMDK. Expressão de MDK e fosforilação de PI3K (pPI3K) foram reduzidos pelo tratamento iMDK em tumores de xenoenxerto. Expressão de uma angiogénese marcador CD31 /PECAM-1 foi inibida por iMDK embora a expressão de um factor de crescimento VEGF angiogénese não foi alterada. A imuno-histoquímica foi realizada utilizando as secções de tumor de xenoenxerto, como descrito em Métodos. O controlo é a partir do grupo administrado DMSO. (Barra de escala mostra 100 mm). iMDK apoptose induzida
in vivo
. TUNEL com os tumores de xenoenxertos tratados com DMSO (controlo) ou iMDK foi realizada como descrito em Métodos (barra de escala 200 mostra um).
Desde RDM é conhecida por induzir a angiogénese [29], que se procurou inibição da angiogênese por iMDK pode, em parte, contribuir para a redução dos tumores pulmonares
in vivo
. Como mostrado na Figura 6C, a expressão de VEGF, um outro factor de crescimento de angiogénese [30], não foi alterada, de acordo com
In vitro
estudo (Figura 2); No entanto, a expressão de CD31 /PECAM-1, um marcador de angiogénese [30], foi reduzida em tumores de pulmão tratados por iMDK, indicando que inibe a angiogénese iMDK independentemente de VEGF e, por sua vez inibe a tumorigénese pulmão
In vivo
. Estes
in vivo
resultados indicam que iMDK é provável que seja um anti-tumorigénica /droga angiogénicos terapêutica promissora alvo cancro do pulmão de expressar MDK sem efeitos colaterais.
Discussão
A o sucesso de pequenas moléculas que inibem especificamente função de EGFR no mutante
EGFR
-driven adenocarcinoma de pulmão tem promovido terapia alvo molecular para câncer de pulmão [4], [5], [31], [32]. Por outro lado, os tratamentos orientadas para o mutante
KRAS
-driven adenocarcinoma do pulmão e carcinoma de células escamosas do pulmão não foram desenvolvidos com excepção de que a quimioterapia alvo tanto as células cancerosas e células normais que proliferam [7] – [9]. No presente estudo, nós identificamos uma pequena molécula iMDK composto que inibe a expressão do RDM, um factor de promoção do crescimento tumoral. iMDK inibiu a via PI3K /AKT e suprimiu
KRAS
adenocarcinoma de pulmão -mutated através da indução de apoptose
in vitro
e
in vivo
. iMDK não prejudicar a viabilidade das células proliferantes normais NHLF. Além disso, nenhuma toxicidade sistémica óbvio foi observada em camundongos tratados com iMDK, apoiar a utilidade potencial de iMDK para a terapia do adenocarcinoma do pulmão MDK-dependente
.
RDM é conhecida para activar não só da via PI3K /Akt, mas também o MAPK via neuronal em cultura primária [16] e do miocárdio [28]; No entanto, no nosso estudo iMDK inibida somente a via PI3K mas não a via MAPK, e, na verdade, activada a via da MAPK em células de adenocarcinoma de pulmão H441 (Figura S3). O mecanismo pelo qual iMDK inibe apenas o PI3K mas não a via MAPK é desconhecido. A sobre-regulação da via de MAPK de activação pode ser compensatória pela regulação negativa da via PI3K nas células H441. O tratamento de células H441 com o inibidor de MAPK (PD0325901) ou o inibidor de PI3K /AKT (LY294002) não influenciou a expressão do RDM (Figura S5 e dados não mostrados), sugerindo que a supressão de MDK por iMDK não é mediada através da MAPK e PI3K /AKT.
Desde RDM é altamente expresso em hepatocelulares, gástrico, colorrectal e da próstata [17], o inibidor iMDK RDM pode ser útil para o tratamento de tumores não-pulmonares bem. Além disso, a expressão MDK está associada com várias doenças inflamatórias, incluindo artrite reumatóide e aterosclerose [19], [33].
Mdk
-knockout ratinhos são resistentes ao desenvolvimento de artrite reumatóide, impedindo a migração de leucócitos inflamatórios e diferenciação de osteoclastos [33]. Os ratinhos knockout também são resistentes a formação da neointima, uma característica comum da aterosclerose e reestenose [34]. Estes resultados sugerem que iMDK podem ser úteis para o tratamento destas doenças não tumorigénicas bem.
Além iMDK, identificamos uma outra pequena molécula composto que também suprimiu a expressão de RDM. O outro composto tem um Cl F em vez de na estrutura da molécula iMDK e exerce um efeito dose semelhante para iMDK (dados não mostrados), indicando que iMDK pode ser estruturalmente modificado para ser mais eficaz e seguro. Uma vez que a extensão de inibição de
MDK
ARN foi inferior à da proteína MDK (dados não mostrados), iMDK pode ter como alvo a proteína MDK directamente. iMDK ou marcado com biotina iMDK irá ser necessária para identificar moléculas ou factores que se associam directamente com iMDK, o que levará à compreensão do mecanismo (s) pelo qual iMDK inibe a expressão do RDM marcada com radioisótopo.
em resumo, nós determinamos que a iMDK inibidor MDK suprime o cancro do pulmão de não pequenas células expressando MDK
in vitro
e
in vivo
sem danificar as células normais. Embora mais estudos são necessários, incluindo a identificação de iMDK alvos diretos, modificação estrutural adicional e validação de segurança, iMDK parece ser um tratamento promissor para
KRAS
adenocarcinoma mutante pulmonar e carcinoma de células escamosas e, possivelmente, para o tratamento de outros tipos de câncer e doenças inflamatórias crónicas.
Informações de Apoio
Figura S1. inibição
Crescimento por iMDK foi aumentada em células que expressam MDK. iMDK inibição do crescimento induzida em células de carcinoma do pulmão H441 MDK-positivas e células de rim embrionário HEK293, mas não em células de carcinoma do pulmão A549 MDK-negativas. Barras, DP.