Abstract

Fundo

Para melhorar a qualidade de vida de pacientes com câncer colorretal, é importante estabelecer novos métodos de triagem para o diagnóstico precoce do cancro colorectal.

Metodologia /Apreciação Principais

Realizamos soro análise metaboloma utilizando cromatografia gasosa /espectrometria de massa (GC /MS). Em primeiro lugar, a precisão do nosso método analítico com base no soro metabolômico-MS GC /foi avaliada calculando os valores de% de RSD de níveis séricos de vários metabolitos. Em segundo lugar, foi examinado o intra-dia (de manhã, durante o dia e à noite) e inter-dia (entre 3 dias) variâncias dos níveis de metabolito no soro. Em seguida, os níveis de metabolitos no soro foram comparados entre pacientes com cancro colo-rectal (n = 60; N = 12 para cada fase de 0 a 4) e em voluntários saudáveis ​​da mesma idade e sexo (n = 60) como um conjunto de treino. A metabólitos cujos níveis exibida significativa mudanças foram submetidos à análise de regressão logística múltipla utilizando o método de seleção de variáveis ​​stepwise e um modelo de previsão de câncer colorretal foi estabelecida. O modelo de previsão foi composta de 2-hidroxibutirato, ácido aspártico, quinurenina, e cistamina e a sua AUC, a sensibilidade, a especificidade e a precisão foram 0,9097, 85,0%, 85,0%, e 85,0%, respectivamente, de acordo com os dados do conjunto de treino. Em contraste, a sensibilidade, a especificidade e a precisão de CEA foram 35,0%, 96,7%, e 65,8%, respectivamente, e os de CA19-9 foram de 16,7%, 100%, e 58,3%, respectivamente. A validade do modelo de previsão foi confirmada utilizando pacientes com câncer colorretal (N = 59) e voluntários saudáveis ​​(N = 63) como um conjunto de validação. No conjunto de validação, a sensibilidade, a especificidade e a precisão de previsão do modelo foram de 83,1%, 81,0%, e 82,0%, respectivamente, e estes valores foram quase os mesmos que os obtidos com o conjunto de treino. Além disso, o modelo apresentado alta sensibilidade para detecção de estágio 0-2 câncer colorretal (82,8%).

Conclusões /Significado

O nosso modelo de previsão estabelecida através de GC /soro baseado no MS análise metabolômica é valiosa para a detecção precoce do cancro colorectal e tem o potencial para se tornar um novo teste de rastreio para o cancro colorectal

Citation:. Nishiumi S, Kobayashi T, Ikeda a, Yoshie T, Kibi M, Izumi Y, et al. (2012) uma abordagem diagnóstica Novel soro Metabolomics-base para o cancro colorectal. PLoS ONE 7 (7): e40459. doi: 10.1371 /journal.pone.0040459

editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 28 Março, 2012; Aceito: 07 de junho de 2012; Publicação: 11 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Nishiumi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações para o Programa COE global, centro mundial de excelência para a Educação e Investigação sobre a transdução Medicina na próxima geração do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia (MEXT) do Japão (TK, TY, MK, TA, e MY); um Grant-in-Aid para a Investigação Científica em áreas inovadoras do MEXT do Japão (SN e TA); o Programa de Educação para médicos especializados no Programa de Apoio para a Melhoria da Pós-Graduação de Educação Escolar do MEXT do Japão (AI); e auxílios a pesquisa do projeto (Desenvolvimento de tecnologia fundamental para a análise e avaliação de produtos agrícolas funcionais e alimentos funcionais) do Ministério da Agricultura, Florestas e Pescas (MAFF) do Japão (MY). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal é uma das causas mais comuns de morte por câncer em países desenvolvidos [1]. Os métodos de tratamento baseados em cirurgia colonoscopia e têm avançado rapidamente, e um grande número de pacientes com câncer colorretal alcançar melhorias após a terapia. No entanto, avançado câncer em estágio colorectal reduz a qualidade de vida dos pacientes que receberam tratamento cirúrgico ou quimioterapia. Portanto, métodos que permitem a detecção e diagnóstico de câncer colorretal precoce estão actualmente a ser procurado. O exame de sangue oculto nas fezes (FOBT) é o método de rastreio mais comumente utilizado para o diagnóstico de câncer colorretal e é um método não invasivo e de baixo custo. No entanto, o FOBT tem baixa sensibilidade, especialmente para o cancro colorectal fase inicial. A colonoscopia é uma abordagem mais precisa e fiável para o diagnóstico de cancro colorectal, mas é difícil para os pacientes idosos ou severamente doentes a sofrer colonoscopia, e o seu custo elevado é também um problema. Assim, exames envolvendo uma combinação de métodos de rastreio convencionais têm sido utilizados para o diagnóstico de cancro colo-rectal; No entanto, estes exames detectam apenas cerca de 40% dos cancros colorrectais [2]. Portanto, é necessário estabelecer novos métodos de triagem para o diagnóstico precoce do cancro colorectal que são altamente sensíveis, específicos, fácil, e não invasivo.

O genoma humano tinha sido completamente identificados até o final de 2003. Desde então, , proteômica, que é o estudo abrangente de todo o conjunto de proteínas expressas por um genoma, tem sido extensivamente estudada, e muitos pesquisadores tentaram aplicar a análise proteômica para a área médica a fim de encontrar marcadores diagnósticos eficazes e elucidar condições patológicas desconhecidos [ ,,,0],3]. Recentemente, metaboloma, que é o estudo abrangente de metabolitos de baixo peso molecular, também foi desenvolvido. Na investigação clínica envolvendo a análise do metaboloma usando uma combinação de líquido de elevado rendimento, cromatografia /espectrometria de massa (LC /MS) e cromatografia gasosa /espectrometria de massa (GC /MS), Sreekumar et ai. demonstraram que a sarcosina é um intermediário metabólico potencialmente importante para a invasão de células de cancro da próstata e agressividade [4]. Além disso, uma análise abrangente e quantitativa dos metabolitos carregados em tecidos tumorais e normais obtidos a partir de pacientes colorectal e cancro gástrico foi realizada utilizando espectrometria de electroforese capilar em massa (CE /MS) [5]. Assim, vários tipos de amostras clínicas foram analisados ​​por análise de metaboloma usando ressonância magnética nuclear (RMN), GC /MS, LC /MS, a CE /MS, e /ou matriz de laser assistida dessorção espectrometria de ionização de massa (MALDI-MS) em a fim de elucidar os mecanismos início da doença e descobrir novos biomarcadores [6]. Entre estas técnicas, GC /MS tem uma longa história e é mais fácil de usar do que CE /MS ou MALDI-MS, embora CG /EM apresenta baixa sensibilidade em comparação com LC /MS. Além disso, existem mais bases de dados de resultados de análise de metabolitos de soro baseados em MS GC /de soro de LC /metabolito resultados da análise baseados em MS. Além disso, a GC /MS pode ser aplicado a estudos de grande escala com relativa facilidade devido à sua elevada repetibilidade. Portanto, no presente estudo, os níveis de metabolitos no soro de pacientes com cancro colo-rectal e voluntários saudáveis ​​foram analisados ​​por análise de GC /MS para estabelecer novas ferramentas de diagnóstico para o cancro colorectal, e a estabilidade e inter-dia e intra-dia variações destes níveis de metabolitos no soro também foram avaliadas. Usando um conjunto de treinamento composto por pacientes com câncer colorretal (N = 60) e voluntários saudáveis ​​(N = 60), um modelo de cancro colorectal previsão foi estabelecida através da análise de regressão logística múltipla utilizando o método de seleção de variáveis ​​stepwise. Em seguida, a validade do modelo de previsão foi avaliada utilizando um conjunto de validação consiste em pacientes com câncer colorretal (N = 59) e voluntários saudáveis ​​(N = 63).

Métodos

Ética e participantes

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética na Universidade de Kobe Graduate School of Medicine, e realizada entre fevereiro 2009 e dezembro de 2011. as amostras humanas foram utilizados de acordo com as diretrizes do Hospital Universidade de Kobe, e informado por escrito consentimento foi obtido de todos os assuntos. Para calcular o desvio padrão relativo (RSD)% para os resultados da análise metaboloma soro obtidos por GC /MS, as amostras de sangue foram coletadas de um voluntário do sexo masculino de 30 anos de idade saudável após jejum no início da manhã, e o soro foi separado por centrifugação a 3000 xg durante 10 min a 4 ° C. O soro foi transferido para um tubo limpo e guardado a -80 ° C até à sua utilização. Para avaliar a variação intra-dia, em níveis de metabólitos de soro, amostras de sangue total foram coletadas de voluntários saudáveis ​​(n = 16) às 8:00 am-9: 00 antes do pequeno almoço, 12:00 pm-1: 00 antes do almoço, e 6:00 pm-7: 00 antes do jantar. Para avaliar a variação inter-dia em níveis de metabolitos no soro, amostras de sangue total (n = 16) foram recolhidas a 08:00-9: 0:00 antes do pequeno almoço, uma vez por dia para um total de 3 dias. Para o conjunto de treinamento, 60 amostras de soro cada foram obtidas a partir de pacientes com câncer colorretal e em voluntários saudáveis ​​após jejum no início da manhã. Para o conjunto de validação, 59 e 63 amostras de soro foram coletadas de pacientes com câncer colorretal e em voluntários saudáveis, respectivamente. As amostras de soro dos pacientes com câncer colorretal foram coletadas no Hospital Universitário de Kobe. Nenhum dos pacientes de câncer tinham quaisquer doenças que complicam. Os pacientes foram diagnosticados pela microscopia, biópsia ou ressecção cirúrgica e classificados utilizando a sexta edição da União Internacional Contra classificação Câncer (UICC). As amostras de soro a partir de voluntários saudáveis ​​foram obtidos a partir de University Hospital Kobe e duas outras instalações. No Hospital Universitário Kobe, confirmou-se que não há nenhuma anormalidade de exames de sangue, exames endoscópicos, diagnóstico por imagem e /ou entrevista médica. Em duas outras instalações, voluntários saudáveis ​​foram selecionados por meio de exames de saúde, incluindo exames de sangue, exames endoscópicos, diagnóstico por imagem e /ou entrevistas médicas. Os indivíduos que tinham sido diagnosticados como necessitando de terapia, exames detalhados, e /ou observações não foram tratados como voluntários saudáveis. As características de todos os pacientes estão resumidas na Tabela 1, Tabela S1, S2 e Tabela.

Procedimentos Experimentais

A extracção de metabolitos de baixo peso molecular foi realizada de acordo com o método descrito em nosso relatório anterior [7]. Resumidamente, 50 uL de soro foram misturados com 250 ul de uma mistura de solventes (MeOH: H

2O: CHCl

3 = 2,5: 1: 1) contendo 10 ul de 0,5 mg /ml de ácido 2-isopropylmalic (Sigma -Aldrich, Tóquio, Japão) dissolvido em água destilada como um padrão interno, e, em seguida, a solução foi agitada a 1200 rpm durante 30 min a 37 ° C, antes de serem centrifugados a 16.000 xg durante 3 min a 4 ° C. Duzentos e vinte e cinco ul do sobrenadante resultante foi transferido para um tubo limpo, e 200 ul de água destilada foram adicionados ao tubo. Depois de ser misturada, a solução foi centrifugada a 16.000 x g durante 3 min a 4 ° C, e 250 ul do sobrenadante resultante foi transferido para um tubo limpo, antes de ser liofilizada utilizando um liofilizador. Por oximação, 40 ul de 20 mg de cloridrato de metoxiamina /ml (Sigma-Aldrich, Tóquio, Japão) dissolvido em piridina foram misturados com uma amostra liofilizada, antes de ser agitada a 1200 rpm durante 90 min a 30 ° C. Em seguida, foram adicionados 20 ul de N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetamida (MSTFA) (GL Ciência, Tóquio, Japão) para derivatização, e a mistura foi incubada a 1200 rpm durante 30 min a 37 ° C. A mistura foi então centrifugada a 16000 xg durante 5 min a 4 ° C, e o sobrenadante resultante foi submetido a medição GC /MS.

De acordo com o método de descrever em um relatório anterior [8], GC /MS a análise foi realizada utilizando um Ultra GCMS-QP2010 (Shimadzu Co., Quioto, Japão) com uma coluna capilar de sílica fundida (CP-SIL 8 CB de drenagem baixa /MS; 30 m × 0,25 mm de diâmetro interno, espessura da película: 0,25 m; Agilent Co., Paio Alto, CA). A temperatura de entrada da frente era 230 ° C. A taxa de fluxo do gás hélio através da coluna era de 39,0 cm /seg. A temperatura da coluna foi mantida a 80 ° C durante 2 min e, em seguida, aumentado de 15 ° C /min até 330 ° C e manteve-se durante 6 min. A linha de transferência e fonte de iões temperaturas foram de 250 ° C e 200 ° C, respectivamente. Vinte scans por segundo foram registrados sobre a faixa de massa 85-500 m /z usando a Velocidade de digitalização Protocolo Avançado (ASSP, Shimadzu Co.). Neste estudo, a tensão de detecção foi confirmada a cada dia, antes da análise de GC /MS, porque este valor reflecte o grau de contaminação no instrumento. Além disso, as amostras em branco foram medidos antes da medição das amostras de soro. Durante a análise de GC /MS, as 20 amostras por um dia foram medidos, e o septo e forro de vidro na entrada de GC foram trocados a cada 100 injecções para a coluna.

O processamento de dados foi realizada de acordo com os métodos descritos em relatórios anteriores [8], [9]. Resumidamente, os dados de MS foram exportados em formato netCDF. A detecção de pico e alinhamento foram realizadas utilizando o software MetAlign (Wageningen UR, Holanda). Os dados resultantes foram exportados em formato CSV e depois analisados ​​com software in-house analítica (AIoutput). Este software permite a identificação de pico e semi-quantificação utilizando uma biblioteca metabólito in-house. Por semi-quantificação, a altura do pico de cada ião foi calculada e normalizada para a altura do pico de ácido 2-isopropylmalic como um padrão interno. Os nomes foram atribuídos a cada pico do metabolito com base no método descrito em um relatório anterior [9]. Todos os dados obtidos a partir das amostras de soro foram submetidas a software MetAlign ao mesmo tempo, porque as mesmas condições de alinhamento necessários para ser realizada durante toda a análise de dados. Na análise de GC /MS, picos múltiplos são, por vezes, detectado por um metabolito particular devido ao TMS-derivatização, forma isomérica, etc Em tais casos, o pico que a maioria reflectiu o nível do metabolito foi adoptado para a avaliação semi-quantitativa.

estatística

os pacientes (N = 119) foram atribuídos aos conjuntos de treinamento e validação da seguinte forma. As amostras de doentes com cancro colorectal para o conjunto de treinamento foram coletados sem critérios de seleção predefinidos, e 12 pacientes com câncer colorretal foram selecionados para cada estágio da doença (N = 60). Como para os voluntários saudáveis ​​utilizados para o conjunto de treino, foram preparadas as amostras da mesma idade e sexo controlada (N = 60). No estudo conjunto de treinamento, os níveis de metabólitos foram comparados entre os pacientes com câncer colorretal e voluntários saudáveis, utilizando o teste de Mann-Whitney. Entre os metabólitos que apresentaram níveis significativamente diferentes entre os grupos (

p Art 0,05), foram selecionados os metabolitos com RSD valores% de não mais de 20% e que não apresentam significativa intra-dia ou inter- dia desvios de acordo com o Wilcoxon signed-rank e teste Steel-Dwass, respectivamente. Os metabolitos seleccionados foram submetidos a um método de selecção de variáveis ​​por passos, seguida por análise de regressão logística múltipla, e estas análises foram realizadas utilizando as condições padrão de JMP9 (SAS Institute Inc., Cary, NC). A multicolinearidade dos metabólitos seleccionados através do método de seleção de variáveis ​​stepwise foi confirmada pelo cálculo dos seus fatores de inflação da variância (VIF). AICc, que é Critério de Informação de Akaike (AIC) com uma correção para tamanhos de amostra finitos, foi calculada a elucidar o número ideal de fatores a serem incluídos no modelo preditivo. Nagelkerke R

2 também foi calculado para avaliar a adequação do modelo de logística multivariada. análise receiver operating characteristic (ROC) foi realizada utilizando JMP9 (SAS Institute Inc.), e o valor ideal de corte e AUC, especificidade, sensibilidade e acurácia foram calculados. No estudo conjunto de validação, o modelo de previsão foi reavaliado utilizando amostras diferentes, ea especificidade, sensibilidade e precisão do modelo foram examinadas usando o valor de corte obtido a partir do conjunto de treinamento.

foram considerados valores p

de menos de 0,05 para indicar uma diferença significativa.

Resultados

No nosso /sistema de análise metabolômica baseado no MS GC, que principalmente direcionados solúvel em água metabolitos, 132 metabolitos foram detectados nos soros dos sujeitos (Tabela S3). Entre os 132 metabolitos, um metabolito; isto é, ácido 2-isopropylmalic, foi usado como um padrão interno, e 5 metabolitos foram provavelmente extraída a partir de não-soro, por exemplo, que foram derivados a partir de tubos eppendorf. Portanto, estes 6 metabolitos foram excluídos das análises subsequentes. Dado que o ácido oxalacética foi convertido em piruvato durante o processo de pré-tratamento, ácido oxalacética foi detectado como piruvato em nosso sistema. Portanto, é descrito como ‘piruvato + ácido oxalacético’ nas mesas de apoio e como ‘piruvato “, que foi realmente detectado por análise de GC /MS, neste manuscrito. Devido às suas estruturas semelhantes, ácido cítrico e ácido isocítrico foram detectadas ao mesmo tempo de retenção pelo nosso sistema. Portanto, eles são descritos como “ácido cítrico + isocítrico ‘. Desde cisteamina foi convertido para cistamina durante o processo de pré-tratamento, cisteamina foi detectado como cistamina pelo nosso sistema. Portanto, é descrito como ‘cisteamina + cistamina’ nas mesas de apoio e como ‘cistamina’, o qual foi realmente detectado por análise de GC /MS, neste manuscrito. Desde cisteína foi convertido em cistina durante o processo de pré-tratamento, cisteína foi detectado em cistina pelo nosso sistema. Portanto, é descrito como ‘cisteína + cistina’ nas mesas de apoio e como ‘cistina’, o qual foi realmente detectado por análise de GC /MS, neste manuscrito.

Para avaliar a estabilidade deste sistema humano usando no soro, os níveis séricos de vários metabolitos foram analisados ​​separadamente utilizando amostras de soro (N = 10) obtidos a partir de um voluntário saudável (sexo masculino, 30 anos de idade), e em seguida, os valores de RSD% dos metabolitos foram calculados (Tabela S3). A percentagem de metabolitos com valores DPR% de menos de 20% e 30% foi de 68,5% e 86,5%, respectivamente. Em seguida, o inter-dia (entre os 3 dias) e intra-dia (manhã, dia e noite) variâncias dos metabólitos de soro foram avaliadas por meio do teste de Wilcoxon assinado-rank e teste de Steel-Dwass, respectivamente (Tabela S3), porque o intra-dia e /ou inter-dia variação significativa é susceptível de conduzir à baixa sensibilidade e especificidade na utilização clínica. Muitos metabólitos não apresentaram significativas inter-dia e intra-dia variações, mas 30 metabólitos, por exemplo dihidroxiacetona e triptofano, demonstrou variações significativas. Na análise de GC /MS, picos múltiplos são, por vezes, detectado por um metabolito particular devido ao TMS-derivatização, forma isomérica, etc Em tais casos, o pico que a maioria reflecte o nível do metabolito foi adoptado para a avaliação ulterior. Para estes metabolitos, os termos ‘_1’, ‘_2’, e ‘(TMS)’ foram adicionados às extremidades dos seus nomes de acordo com o método de um relatório anterior [9]. Os picos excluídos são indicados pelo termo “menor” na Tabela S4, e após a exclusão de picos do “menor” um total de 107 metabólitos tiveram seus níveis de comparação entre os pacientes colorectal câncer e voluntários saudáveis ​​(Figura 1, Tabela S4).

A média dobrar mudanças nos níveis de metabolitos de 107 observados numa comparação entre os pacientes com cancro colorectal (N = 60) e em voluntários saudáveis ​​(n = 60) (conjunto de treino) são mostrados na Figura 1. em GC /MS análise, picos múltiplos são, por vezes, detectado por um metabolito particular devido ao TMS-derivatização, forma isomérica, etc Em tais casos, o pico que a maioria reflectiu o nível do metabolito foi adoptado para a avaliação ulterior. Além disso, cada metabolito tinha o termo ‘_1’, ‘_2’, ou ‘(TMS)’ adicionado ao fim do seu nome, tal como descrito no relatório anterior [7]. Este número não inclui os metabolitos de fundo ou pequenos metabólitos derivados de pico.

No estudo conjunto de treinamento, os níveis de metabolitos no soro dos pacientes com câncer e voluntários de saúde colorectal foram comparadas pelo teste de Mann-Whitney (Tabela S4). O conjunto de treinamento foi composto por pacientes Câncer Colorretal (N = 60) e voluntários saudáveis ​​pareados por idade e sexo (N = 60) (Tabela 1, Tabela S1). Não houve diferença significativa na média de idade ou valores de BMI entre os dois grupos (Tabela 1). Neste estudo, cancro colorrectal também foi classificada em 2 grupos; isto é, o grupo 1 incluiu fase 0, 1, 2 e doença (ausência de invasão e metástase) e grupo 2 o estádio 3 e 4 da doença (presença de invasão e metástase). A partir dos resultados da análise de GC /MS, 27 metabolitos que satisfeitas as seguintes condições foram seleccionados como candidatos biomarcadores: um valor de% RSD de 20%; não significativa (p≥0.05) intra-dia ou inter-dia variações de acordo com o Wilcoxon signed-rank e teste Steel-Dwass; e a presença de uma diferença significativa (p 0,05) entre os níveis dos pacientes com cancro colo-rectal e voluntários saudáveis ​​de acordo com o teste de Mann-Whitney. Curvas ROC foram produzidas usando os dados para estes 27 metabólitos, (figura S1), eo valor de corte, a AUC, a sensibilidade, especificidade e precisão de cada metabólito foram calculados (Tabela 2). Como resultado, ácido nonanóico (C9), ácido p-hidroxibenzóico exibida sensibilidade relativamente elevada, com valores de 86,7% e 90%, respectivamente. Em relação à especificidade, cistamina e cistina ambos exibiram valores de 90%, e a ornitina (86,7%), citrulina (85,0%), e palmitoleato (85,0%) também demonstrou relativamente elevada especificidade. No entanto, não houve metabolitos com valores de precisão superior a 80%, o que sugere a necessidade de realização de avaliações usando vários biomarcadores de metabólitos.

Como um novo método de avaliação, a aplicabilidade de um modelo de regressão logística múltipla envolvendo biomarcadores múltiplos metabolito foi examinada. Entre as 27 metabólitos, foram selecionados os 10 metabólitos que apresentaram as maiores diferenças entre os níveis nos pacientes com câncer colorretal e aqueles nos voluntários saudáveis ​​e tinham os níveis mais altos nos pacientes com câncer colorretal em comparação com os voluntários saudáveis: cistamina, cistina, aspártico ácido, arabinose, ácido p-hidroxibenzóico, ácido glutâmico, 2-hidroxibutirato, quinurenina, meso-eritritol, lactitol e (Tabela 3). A maioria destes metabolitos apresentaram níveis significativamente alterados na fase de 0-4 (n = 60), fase 0-2 (n = 36), e grupos de estágio de 3-4 (n = 24). Entre estes metabolitos, arabinose, meso-eritritol, lactitol e são frequentemente consumidos na dieta. Portanto, os restantes 7 metabolitos foram submetidos a um método de selecção variável por passos. Como resultado, 2-hidroxibutirato, ácido aspártico, quinurenina, e a cistamina foram selecionados. Estes 4 metabolitos não exibir multicollinearity (dados não mostrados). Em seguida, um modelo de regressão logística múltipla para predizer o câncer colorretal foi estabelecido com base nos dados para estes metabólitos (Tabela 4)

O modelo de previsão é a seguinte:.

p = 1 /[1 + e – {- 8,32 + 286,59 (2-hidroxibutirato) 33,87 (ácido aspártico) 1.634,96 (quinurenina) 78,78 (cistamina)}]

O Nagelkerke R

2 valor foi 0,4533. A AUC, a sensibilidade, especificidade e precisão deste modelo foram 0,9097 {intervalo de confiança de 95% (IC 95%): 0,8438-0,9495}, 85,0%, 85,0% e 85,0%, respectivamente (Tabela 5, Figura 2). Apesar de termos seleccionado 2, 3, 5 ou 6 metabólitos através do método de seleção de variáveis ​​stepwise e então realizada ainda múltiplas análises de regressão logística, não foi possível estabelecer um modelo melhor (dados não mostrados). Pelo contrário, quando foram utilizados os dados do conjunto de treino, a sensibilidade, a especificidade e a precisão de CEA foram 35,0%, 96,7%, e 65,8%, respectivamente, e os de CA19-9 foram de 16,7%, 100%, e 58,3% , respectivamente. O nosso modelo de previsão também mostraram alta sensibilidade (83,3%) no grupo de pacientes estágio 0-2 colorectal cancer, enquanto que CEA e CA19-9 exibido sensibilidades de 30,6% e 5,6%, respectivamente.

O sólido curva representa a curva ROC para o modelo preditivo criado a partir do conjunto de treino. A AUC e os valores de corte foram 0,9097 {intervalo de confiança de 95% (IC 95%): 0,8438-0,9495} e 0,4945, respectivamente. A sensibilidade, especificidade e precisão deste modelo são resumidos na Tabela 5.

Os 27 metabólitos selecionados no conjunto de treinamento (Tabela 2) e do modelo de previsão estabelecidos foram examinadas usando o conjunto de validação, que foi composta por pacientes câncer colorretal (N = 59) e voluntários saudáveis ​​(N = 63) (Tabela 1, Tabela S2). Em relação aos 27 metabólitos, a sensibilidade, especificidade e precisão do conjunto de treinamento foram parcialmente correlacionado com os do conjunto de validação, e os coeficientes de correlação para estes parâmetros foram 0,425, 0,655 e 0,587, respectivamente (Figura S2). No entanto, nenhum dos metabolitos apresentam alta sensibilidade, a especificidade e os valores de precisão (tabela 2). Pelo contrário, quando o conjunto de validação foi usada a sensibilidade, a especificidade e a precisão do modelo de previsão foram 83,1%, 81,0%, e 82,0%, respectivamente, e estes valores foram quase os mesmos que os obtidos com o conjunto de treino (Tabela 5). Além disso, o modelo também exibido alta sensibilidade para detecção de estágio 0-2 câncer colorretal (82,8%).

Discussão

Neste estudo, nós investigamos um novo método de triagem para o diagnóstico precoce da câncer colorretal com base em CG metabolômica /MS. Embora o conjunto de treinamento incluiu pacientes com câncer colorretal estágio inicial, como estádio 0 ou estágio 1, o modelo de previsão exibido alta AUC (0,9097), sensibilidade (85,0%), e os valores de precisão (85,0%), que foram maiores do que as de marcadores tumorais séricos (CA19-9 e CEA). Além disso, quando o conjunto de validação foi utilizado o modelo também exibiram elevada sensibilidade para o cancro colo-rectal fase precoce (83,1%). Tomados em conjunto, a patogênese do câncer colorretal parece levar a alterações nos níveis de uma variedade de metabólitos de soro, embora estas flutuações variam de pequenas a grandes.

As avaliações de dados obtidos por metabolômica deve ser tratado com cuidado. Por exemplo, entre os metabolitos de soro detectados pelo nosso sistema de GC metabolômico /baseado em MS, foram observadas intra-dia e inter-dia variâncias. Por exemplo, as concentrações de triptofano observadas no período da tarde e durante a noite foram significativamente diminuídos em comparação com os detectados pela manhã (Tabela S3 e Figura S3), e essas diferenças podem ser devido aos efeitos da dieta e /ou da actividade diária. Estudos anteriores também demonstraram intra-dia e inter-dia variância nos níveis de alguns aminoácidos [10], [11], [12]. Por isso, é importante para avaliar as variações inter-dia e intra-dia os níveis séricos de metabolito no metabolômico pesquisa, e amostras de sangue colhidas antes do pequeno almoço foram usadas neste estudo. Além disso, a precisão dos dados obtidos por análise instrumental de amostras de soro deve ser avaliada cuidadosamente, porque ele pode ser afectado pelo método utilizado. Portanto, para descobrir biomarcadores novo metabólito fiáveis, foram calculados os valores de% de RSD para os níveis de metabolito no soro obtidos por análise de GC /MS e, em seguida, avaliada a inter-dia e intra-dia variações na concentração de cada metabolito no soro. Na análise de GC /MS, picos múltiplos são, por vezes, detectado por um metabolito particular. Por exemplo, há variações no número de moléculas que se ligam a TMS certas moléculas, e, portanto, os picos maiores e menores são detectados. Os picos menores pode ser instável, o que pode conduzir a uma interpretação incorrecta dos dados. Na verdade, no presente estudo os valores DPR% obtido omitindo os resultados para os metabolitos derivados do pico secundário foram melhores do que os obtidos utilizando todos os dados: quando se utilizaram todos os dados, a percentagem de metabolitos com valores DPR% de menos do que 20 % e 30% foi de 68,5% e 86,5%, respectivamente. Em contraste, quando os resultados para os metabolitos derivados do pico menor foram omitidos, que eram 72,0% e 90,0%, respectivamente. Assim, é esperado que a avaliação rigorosa dos dados obtidos por metabolômica para produzir informações úteis. Com base nestas avaliações, 27 metabolitos foram seleccionados como candidatos metabolito biomarcadores, mas estes metabolitos apresentado valores de AUC individuais de 0,6-0,8 e relativamente baixa sensibilidade ou especificidade (Tabela 2), indicando que os biomarcadores individuais metabolito não são práticos para o rastreio da doença e /ou diagnóstico e que o uso de múltiplos biomarcadores pode ser melhor para a descoberta de candidatos com elevada sensibilidade e especificidade, embora metabolômicos abordagens têm sido amplamente utilizado para descobrir biomarcadores única doença. Em seguida, com o objectivo de avaliar a utilidade de biomarcadores múltiplos para o diagnóstico de cancro colo-rectal, análise de regressão logística múltipla usando o método de selecção de variáveis ​​por passos (neste estudo) e análise de componentes principais (PCA) (dados não mostrados) foram realizados. No entanto, PCA não produziu resultados valiosos. PCA é um método analítico para a análise de um número reduzido de variáveis; isto é, é uma técnica de redução de dimensão, e não tem variáveis ​​dependentes. Pelo contrário, a análise de regressão logística múltipla com o método de selecção de variáveis ​​por passos pode ser utilizado para seleccionar o subconjunto óptima de variáveis ​​e requer variáveis ​​dependentes. Assim, PCA pode não ser adequado para estudos em larga escala porque pode produzir diferenças inesperadas entre os grupos comparados, embora PCA supervisionado, parcial menos de análise quadrados discriminante (PLS-DA) e ortogonais PLS-DA (OPLS-DA) pode ser aplicável para estabelecer os modelos de diagnóstico, porque a discriminação entre pacientes com câncer colorretal e controles foi mostrado através OPLS-dA [13]

O modelo de predição estabelecida foi composta de 4 metabolitos.; isto é, 2-hidroxibutirato, ácido aspártico, quinurenina, e cistamina (cisteamina + cistamina). 2-hidroxibutirato é formado como um subproduto durante a formação de α-cetobutirato através de uma reacção catalisada pela desidrogenase de lactato desidrogenase ou α-hidroxibutirato. Num estudo anterior [13], foi observado o aumento do nível de ácido 2-hidroxibutírico no soro de doentes com cancro colorectal, sendo consistente com os nossos resultados. Desidrogenase de soro α-hidroxibutirato e o total de actividade de lactato desidrogenase de pacientes de cancro do ovário foram significativamente maiores do que os de pacientes com tumor ovariano benigno [14], mas o nível de ácido láctico no cancro colo-rectal foi menor do que em voluntários saudáveis ​​(Tabela S4) . Portanto, 2-hidroxibutirato não seria produzido no sangue pela lactato desidrogenase, mas a produção enzimática de 2-hidroxibutirato desidrogenase por α-hidroxibutirato pode ser causado no sangue e /ou 2-hidroxibutirato iria ser secretada a partir de células.