Abstract

Nós relatamos aqui o desenvolvimento, caracterização funcional e molecular de, um cancro da bexiga emparelhado isogênico sistema de modelo de cultura celular para estudar platina resistência aos medicamentos. A linha celular de cancro da bexiga humano 5637 foi cultivada em dez meses com aumentos por passos da concentração de oxaliplatina para gerar uma linha celular sub 5637R resistente à droga. O ensaio MTT foi utilizado para medir a citotoxicidade de várias drogas cancerosas da bexiga. contagem de cintilação líquida permitiu a quantificação da absorção de droga e de efluxo celular de oxaliplatina radiomarcado e carboplatina. O impacto de inactivação intracelular de droga foi avaliada por modulação química dos níveis de glutationa. Oxaliplatina e carboplatina-DNA formação de aduto e reparação foi medido utilizando espectrometria de massa acelerador. factores de resistência, incluindo a apoptose, a sinalização do factor de crescimento e outros foram avaliadas com RNA-Seq de ambas as linhas de células e incluída confirmação de transcritos seleccionados por RT-PCR. A oxaliplatina, carboplatina, cisplatina e gemcitabina foram significativamente menos citotóxica para células 5637R em comparação com as células 5637. Em contraste, doxorrubicina, metotrexato e vinblastina teve nenhuma diferença linha celular dependente da citotoxicidade. Após a exposição a doses terapeuticamente relevantes de oxaliplatina, células 5637R tinham níveis aduto droga inferiores,-DNA do que 5637 células. Esta diferença foi parcialmente explicada por mecanismos de danos pré-DNA, tais como a absorção de drogas e inactivação intracelular de glutationa, bem como de reparação mais rápido aducto-DNA oxaliplatina. Em contraste, ambas as linhas celulares não tinham diferenças significativas na absorção celular carboplatina, o efluxo de fármaco e formação do aduto-DNA e reparação, sugerindo mecanismos de resistência distinto para estes dois fármacos estreitamente relacionadas. Os estudos funcionais foram aumentadas por análise de RNA-Seq, que demonstrou uma mudança significativa na expressão dos transcritos de 83, incluindo 50 genes conhecidos e 22 novos transcritos. A maioria das transcrições não foram previamente associados com chemoresistance câncer de bexiga. Este sistema modelo e as características fenotípicas associados e os dados genotípica tem o potencial para identificar alguns novos detalhes de mecanismos de resistência de importância clínica para o câncer de bexiga

Citation:. Wang S, Zhang H, Scharadin TM, Zimmermann M, Hu B , Pan AW, et al. (2016) Molecular Dissecção da resistência induzida Platinum através de Análise de expressão funcional e Gene in a Cell Culture Modelo de câncer de bexiga. PLoS ONE 11 (1): e0146256. doi: 10.1371 /journal.pone.0146256

editor: Aamir Ahmad, Escola de Medicina da Universidade Estadual Wayne, United States |

Recebido: 08 de julho de 2015; Aceito: 15 de dezembro de 2015; Publicação: 22 de janeiro de 2016

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Data Availability:. Quaisquer dados RNA-Seq não apresentadas no documento estão disponíveis online em https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra. dados de RNA-Seq foram atribuídos a adesão números de identificação SRR1820076 e SRR1820077 para a linha parental 5637; . E SRR1820079 e SRR1820080 para a linha 5637R (representando dois experimentos independentes para cada linha de células)

Financiamento: amostras AMS foram analisadas no Laboratório Nacional Lawrence Livermore, sob os auspícios do contrato DOE DE-AC52-07NA27344 e apoiada pelo NIH Resource /NCRR for Biomedical Accelerator Mass Spectrometry P41 RR013461 e DOE LDRD conceder 08-LW-100 (PTH e KT), e pelo Cancer Society Institutional Research Grant americano (CXP). Este estudo também foi apoiado pela VA Carreira de Desenvolvimento Award-2 (CXP), um suporte Grant NCI Cancer Center (RDW) um cancro Investigador Principal Prêmio de Liderança Team (CXP) e NIH prêmios HHSN261201200048C, HHSN261201200084C, R01CA155642 (PTH) e T32 CA108459-08 (TS). Os autores agradecem a Susan e Gerry Família do fundo Knapp. Este trabalho foi realizado, em parte, sob os auspícios do Departamento de Energia dos EUA por Lawrence Livermore National Laboratory, no âmbito do contrato DE-AC52-07NA27344. O trabalho relatado aqui não representam as opiniões ou pareceres da Department of Veterans Affairs ou o Governo dos Estados Unidos

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e os autores deste manuscrito ter a seguinte interesses concorrentes : Chong-Xian Pan, Paul Henderson e George Cimino são acionistas de Aceleração Medical Diagnostics Incorporated, cujo objetivo é comercializar o uso de adutos-DNA de drogas como biomarcadores da resistência à quimioterapia

Introdução

. medicamentos à base de platina estão entre as drogas anticâncer mais frequentemente prescritos, incluindo cisplatina, carboplatina e oxaliplatina. A cisplatina tem sido utilizado para tratar uma ampla gama de doenças malignas, tais como carcinomas testicular, do pulmão, dos ovários, bexiga, cabeça e pescoço, e outras. Para todos os agentes à base de platina, a resistência aos medicamentos intrínseca ou adquirida é a principal razão para o insucesso do tratamento (Fig 1A).

(A) As principais vias de platina (Pt) a morte celular induzida por drogas. Após administração, a absorção celular e efluxo determina a acumulação intracelular dos agentes de PT, a qual pode ser inactivado por as moléculas contendo tiol intracelulares. Eventualmente, os agentes Pt induz danos no ADN, incluindo adutos-DNA de drogas, o que provoca a parada do ciclo celular e reparo do DNA. ADN formação de aduto e reparação determina o destino das células, apesar de outros factores também desempenham um papel importante, tais como proteínas pro- e anti-apoptóticas. (B) Diagrama que mostra a formação de aductos e oxaliplatina carboplatin–DNA e as posições dos marcadores de radiocarbono em cada fármaco utilizado para o presente estudo, a fim de possibilitar a quantificação da formação de aduto de DNA-fármaco e reparação por espectrometria de massa de acelerador.

A ação anticancerígena de medicamentos à base de platina é mais conhecido por cisplatina, que entra nas células por ambos difusão passiva e transporte ativo. Por exemplo, um transportador de cobre (CTR1) é conhecida por contribuir para o influxo cisplatina e modula a sensibilidade ao fármaco in vitro [1, 2]. Dois P-tipo de adenosina trifosfato cobre-transporte-de efluxo (ATP7A e ATP7B) também mediar níveis cisplatina intracelulares [3]. Outros transportadores activos incluem o transportador humano orgânica catiónica (hOCT) e a múltiplas drogas e toxina humana extrusão (hMATE), que são encontrados apenas em determinados tipos de células humanas, consistente com a observação de que diferentes tecidos pode variar na sua acumulação de platina [4] .

Uma vez que a cisplatina está dentro da célula, a glutationa (GSH) e outros tióis actuam como agentes redutores para extinguir a toxicidade de platina. Existe alta correlação entre os níveis intracelulares de GSH e resistência à cisplatina

in vitro

[5-7]. proteínas metalotioneína são uma família de proteínas ricas em sulfidrilo que participam na ligação de metais pesados ​​e de desintoxicação e são aumentados em alguns resistentes cisplatina tumores da bexiga [8]. Alterações de níveis de GSH e genes envolvidos na síntese de GSH, bem como metaloproteínas, também têm sido relatados para as linhas de células de cancro resistente a oxaliplatina [9, 10].

A cisplatina e os seus metabolitos hidroxilados aquated ou agem como agentes de alquilação bifuncionais para o ADN [11]. Os aductos ADN-droga resultantes bloqueiam a replicação e a divisão celular, e activar a apoptose [2]. Outras espécies, tais como ligações cruzadas cisplatina-DNA-proteína, são também passíveis de contribuir para a toxicidade da cisplatina [12, 13].

resposta celular a carboplatina (ver estrutura na Figura 1B) se pensa ser muito semelhante ao exposição a cisplatina vez que ambas as drogas formar estruturas de ADN-droga de reticulação idênticos, excepto que reaja com o ADN carboplatina mais lentamente do que a cisplatina [14]. Clinicamente, a cisplatina e a carboplatina têm uma eficácia semelhante, mas não idêntica, provavelmente devido a diferenças na bioquímica e regimes de dosagem.

A oxaliplatina (Figura 1B) actua de forma semelhante à cisplatina, exercendo a sua toxicidade através da formação de aduto de DNA-droga [15 -17]. Uma vez que os aductos de ADN-oxaliplatina têm diferentes propriedades químicas e biológicas a partir de aductos ADN-cisplatina, que não mostra a resistência cruzada completa com cisplatina e é mais eficaz em, por exemplo, inibindo a síntese do ADN [18-20]. Além disso, as diferenças entre a cisplatina e oxaliplatina foram descritas para as cascatas intracelulares induzidos por lesão de DNA relacionadas com a droga apoptose e paragem do ciclo celular [21].

Quase todos os aductos ADN-fármaco à base de platina são substratos para a excisão de nucleótidos reparação (NER) [2]. taxas de reparo do DNA aumento foram documentados correlacionar-se com a resistência aos medicamentos de platina [5, 22-25]. adutos-DNA Platinum também são substratos para o sistema DNA mismatch reparação (MMR). proteínas MMR têm uma afinidade muito maior para cisplatina do que para adutos-DNA oxaliplatina [26, 27]. Tem sido relatado que um defeito MMR actividade resulta em um aumento da resistência das linhas de células à cisplatina, mas não a oxaliplatina [19], o que pode explicar a eficácia relativa de oxaliplatina em cancros colo-rectais, que são muitas vezes deficiente na MMR [28, 29] .

análise de caminho molecular tem sido muito bem sucedido em pesquisas de laboratório na elucidação de mecanismos de resistência a medicamentos à base de platina. No entanto, as assinaturas moleculares resultantes da resistência aos medicamentos raramente são aplicáveis ​​para a clínica. Uma das principais razões para o enorme fosso entre a pesquisa de laboratório e aplicação clínica é a natureza altamente complexa de mecanismos de resistência contra medicamentos citotóxicos. Ao nível celular, mais de 700 genes que estão envolvidos na resposta celular a um tratamento à base de platina [30].

Esta complexidade nos motivou a gerar uma linha celular de cancro da bexiga quase isogénicas para a finalidade de estender a análise de mecanicista platina resistência ao cancro da bexiga, para que o tratamento à base de platina é a primeira linha na Fase II e maior doença [31, 32]. Apresentamos neste trabalho uma análise fenotípica e genotípica de uma linha de células de câncer de bexiga parental 5637 e uma linha celular filha que foi tornado resistente aos medicamentos à base de platina pela exposição a concentrações crescentes de oxaliplatina ao longo de vários meses. Colocámos a hipótese de que este par de linhas de células que exibem diferenças na acumulação de drogas de platina, inactivação intracelular e a formação de ADN-droga e reparar consistente com a sua sensibilidade para cada droga, e que a análise destas linhas celulares quase isogénicas expressão do gene irá resultar em número razoável de hipóteses testáveis ​​que podem ser específicos para o câncer de bexiga. As linhas celulares foram testadas quanto à sensibilidade a vários agentes quimioterapêuticos vulgarmente utilizados no tratamento de cancro da bexiga. As linhas celulares também foram avaliadas em detalhes com respeito às diferenças mecanicistas em resposta a [

14C] oxaliplatina e [

14C] carboplatina. O

14C tracer determinação do consumo de drogas e de efluxo activado por contagem de cintilação líquida (LSC) e formação de aduto-DNA de drogas e reparação por espectrometria de massa de acelerador (AMS). As linhagens de células também foram analisadas para expressão de transcritos de RNA muda de RNA-Seq, o que levou à identificação de vários conhecidos e alguns novos transcritos no que diz respeito à resistência aos medicamentos à base de platina. A contribuição dos genes representados por estas transcrições para chemoresistance é em grande parte desconhecido. A elucidação desses detalhes mecanicistas em trabalho posterior pode vir a ajudar a terapia personalizada projeto para superar chemoresistance e orientar o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos contra o câncer de bexiga.

Materiais e Métodos

Drugs

oxaliplatina (5 mg /ml) foi comprado de Sanofi-Aventis (Bridgewater, NJ, EUA) e

oxaliplatina marcado com 14C ([

14C] oxaliplatina) (actividade específica de 58 mCi /mmol) e [

14C] carboplatina (54 mCi /mmol) foram adquiridos a Moravek Biochemicals. Misturas de oxaliplatina marcado com carbono radioactivo e não marcado ou carboplatina (USP grau farmacêutico) foram usadas a fim de minimizar o uso de radiocarbono, e alcançar as diferentes actividades específicas necessárias para este estudo. As soluções de fármaco foram preparadas imediatamente antes da utilização. Outras drogas foram obtidos a partir da UC Davis Cancer Center Farmácia (USP grau farmacêutico).

As linhas celulares

linhas celulares de cancro da bexiga humanos foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA ) e cultivadas com a forma recomendada a menos que especificado de outra forma. Para desenvolver linhas celulares sub-Pt-resistentes, 5637 (HTB-9), as células foram cultivadas em torno do IC

50 concentrações de oxaliplatina intermitentemente com aumento gradual da concentração de oxaliplatina. As concentrações de oxaliplatina utilizadas variaram desde 1,5 uM a 15 uM, que são fisiologicamente relevante considerando a concentração máxima de plasma em seres humanos é de cerca de 10 uM [33]. Após 10 meses de cultura, a linha sub-celular resistente 5637R foi desenvolvido. Para confirmar que 5637R originado a partir da linha celular parental 5637, as amostras de ambas as culturas foram enviados para o serviço de autenticação da linha celular ATCC para a verificação de células por o protocolo de ATCC. Especificamente, quinze curtas em tandem repeat (STR) loci mais o sexo determinação locus amelogenina, foram amplificados usando o PowerPlex comercialmente disponível

® Kit 16hs da Promega. A amostra linha celular foi processado utilizando o ABI Prism

® 3130 xl Genetic Analyzer. Os dados foram analisados ​​usando GeneMapper ID v 3.2 software (Applied Biosystems). controlos positivos e negativos adequados foram usadas durante todo o procedimento de teste.

Ensaio MTT para determinar a IC

50

O IC

50 valores foram determinados após incubação das células durante 72 horas com diferentes As concentrações de agentes quimioterapêuticos vulgarmente utilizados no tratamento de cancro da bexiga, como previamente descrito [34].

a oxaliplatina e exposição a carboplatina e AMS análise

As células foram semeadas em placas de 60 mm a uma densidade de 1 x 10

6 células /prato e deixou-se ligar durante a noite numa atmosfera humidificada de 37 ° C que contém 5% de CO

2. Na hora 0, as células foram doseadas e incubadas com 10 pM de oxaliplatina suplementada com 5.000 dpm /ml de [

14C] oxaliplatina ou carboplatina 100 uM, suplementado com 50.000 dpm /mL de [

14C] carboplatina. A incubação de 24 horas foi usado para imitar o

in vivo

oxaliplatina meia-vida (16,8 horas) em pacientes [35, 36]. As células foram então lavadas duas vezes com solução tamponada com fosfato (PBS) e em seguida mantida com meio de cultura livre de drogas. O DNA foi colhido em pontos de tempo ao longo de 24-48 horas, tal como indicado, e purificado com um kit de purificação de ADN Promega Wizard. Dez microgramas de ADN por amostra foi convertida grafite e medido por AMS para

14C quantificação como anteriormente descrito [37]. Triplicado conjuntos de experimentos AMS foram realizadas e os dados foram representados como tempo vs adutos-DNA oxaliplatina por 10

8 nt.

A determinação dos níveis de glutationa intracelular

intracelular glutationa total (GSH) nível foi detectado com um kit colorimétrico de detecção de GSH por protocolo do fabricante (BioVision, mountain View, CA). Aproximadamente 10

7 células foram lavadas com PBS gelado, e lisaram-se em tampão de lise de GSH. Após incubação em gelo durante 10 minutos, uma solução de ácido sulfossalicilico foi adicionado, e o sobrenadante foi recolhido para a medição de absorvância a 410 nm. GSH padrão incluída no kit foi usada para gerar uma curva padrão para determinar as concentrações de GSH da amostra.

Estatísticas

Foi utilizado resumos quantitativos dos danos de ADN, IC

50 e AUC ( área sob a curva) valores, separadamente, por experiência, linha celular e hora (média e desvio padrão). Foram calculadas estatísticas com n = 3 para cada linha celular. análise de variância, de IC de dados

50 e AUC foram baseadas em um one-sided

t

-teste. Todos os testes foram a uma taxa de erro experiência-wise de 0,05 e todas as análises usadas SAS /STAT

® ou MedCalc

® software.

RNA-Seq e qRT-PCR

O RNA total foi isolado utilizando Qiagen RNeasy Mini kit. Co-ADN genómico purificado foi quantificado utilizando um ensaio de PCR quantitativo específico para o gene 18S com o ADN genómico humano como o padrão de quantidade. Uma vez que o ARN total tinham altos níveis de contaminação com ADN genómico (previsto para contabilizar 15-68% do total lê), um passo de tratamento com ADNase adicional foi adicionada ao protocolo de purificação de ARN. Este passo reduz a contaminação de ADN para níveis esperados para produzir 0,33% do total lê. rRNA foi esgotada a partir das amostras utilizando o kit RiboZero H /M /R do epicentro. bibliotecas de sequenciação foram feitas a partir de 40 ng de ARN utilizando rRNA empobrecido ScriptSeq V2 da Epicentre RNA-Seq Biblioteca Preparation Kit. Estas amostras foram sequenciados em 1/3 de 101 pista HiSeq PE cada um em Los Alamos National Laboratory

Os dados de sequenciamento em bruto foram processados ​​pelo casava 1,8 software. (Illumina, San Diego, CA) e aparadas para a qualidade (Q

30, Phred escala). Análise de dados de RNA-Seq foi efectuada utilizando um fluxo de trabalho padrão TopHat-botão de punho com a montagem do genoma humano (fev 2009, GRCh37 /hg19) [38, 39]. A expressão de um transcrito foi considerada significativamente regulada se FDR (p-valor corrigido para ensaios múltiplos) era inferior a 0,05.

Para qRT-PCR, o RNA foi isolado a partir de pratos subconfluentes utilizando o Qiagen RNeasy Mini Kit de acordo com a as instruções do fabricante. O ADNc foi sintetizado utilizando o kit de Thermo Scientific RevertAid RT. qRT-PCR foi realizada utilizando o master mix EconoTaq PLUS 2X em um instrumento BioRad CFX96 Real-Time System. Foram utilizados os seguintes iniciadores: TSPAN7 (ACCAAACCTGTGATAACCTGTCT, AGGGAGATATAGGTGCCCAGA), AKR1C2 (ATTGGAATGACATACTGCATCCT, GTTCAACCGTTTCTTACCTGTGG), AKR1C1 (CGCCTGCAGAGGTTCCTAAAA, ATCAATATGGCGGAAGCCAG), Cyr61 (CCCGTTTTGGTAGATTCTGG, GCTGGAATGCAACTTCGG), HTRA1 (TCCCAACAGTTTGCGCCATAA, CCGGCACCTCTCGTTTAGAAA), e AQP3 (CCGTGACCTTTGCCATGTG, CGAAGTGCCAGATTGCATCATAA). Quaisquer dados de RNA-Seq não apresentadas no documento está disponível online em https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra. dados seq RNA Raw foram atribuídos a adesão números de identificação SRR1820076 e SRR1820077 para a linha parental 5637; e SRR1820079 SRR1820080 e para a linha de 5637R (representando dois experimentos independentes para cada linha de células).

Resultados

A geração da linha celular 5637R através de resistência induzida por droga é descrito a seguir, juntamente com um variedade de fenótipos e genótipos caracterizações. Salvo indicação em contrário, as comparações entre as duas linhas de células são apresentados na ordem de 5637R contra 5637, respectivamente.

Indução de Platinum Resistência às Drogas

A linha de células 5637R foi desenvolvido ao longo de 10 meses da cultura com um aumento gradual na concentração de oxaliplatina nos meios de comunicação. A citotoxicidade de oxaliplatina para a linha 5637R diminuiu aproximadamente 10 vezes em comparação com a linha celular parental (IC

50 de 26,1 uM em comparação com 2,45 uM, p 0,0001, Tabela 1). Inesperadamente, não fomos capazes de desenvolver um 5637 derivado resistente após a exposição prolongada à carboplatina. Para assegurar que 5637R originado a partir das células parentais 5637, uma alíquota de cada linha celular foi enviado para ATCC para a determinação de fidelidade clonal. Os 15 curta em tandem repeat (STR) loci mais amelogenina da linha 5637 de células utilizado para este estudo foram uma correspondência exata para a linha ATCC célula humana 5637 (HTB-9) no banco de dados ATCC. A linha de 5637 tinha três alelos que 5637R faltava enquanto todos os outros alelos analisados ​​foram os mesmos para ambas as linhas celulares, sugerindo que 5637R é um derivado de 5637.

Quimioterapia de citotoxicidade de drogas

Células foram cultivadas com uma gama de concentrações de cisplatina, carboplatina, gemcitabina, doxorubicina, metotrexato e vinblastina durante 72 horas, seguido por avaliação da viabilidade pelo teste de MTT (valores médios apresentados na Tabela 1). Estas drogas foram escolhidos por causa de seu uso frequente no tratamento de cancro da bexiga. A linha celular 5637R foi também mais resistente a cisplatina, mas a um grau muito menor do que para a oxaliplatina (IC

50 2,99 uM contra 0,59 uM para 5,637, p = 0,049), e a carboplatina (IC

50 = 72,18 uM contra 24,34 uM, p 0,0001). Era também mais resistente a gemcitabina (IC

50 = 1,44 uM em comparação com 0,12 uM, p = 0,0015), mas ambas as linhas celulares foram igualmente sensíveis à doxorubicina (IC

50 = 0,27 contra 0,29 uM, p = 0,45) , metotrexato (IC

50 = 1,24 uM em comparação com 2.01 | iM, p = 0,18) e vinblastina (IC

50 = 0,61 nm versus 0,60 nM, P = 0,48).

A absorção e de efluxo

Para determinar a absorção de droga, as células foram incubadas com [

14C] oxaliplatina ou [

14C] carboplatina, e amostrado a vários pontos de tempo ao longo de 24 horas, seguido de isolamento das células e análise LSC de acumulação de droga intracelular . A linha de 5637R teve um pico de nível de oxaliplatina intracelular modesta, mas significativamente inferior às 24 horas (248,6 ± 24,7 X 10

6 moléculas por célula contra 303,7 ± 14,2 X 10

6 moléculas por célula para 5637 células, p = 0,290 ) (Figura 2A). Em contraste, ambas as linhas celulares tinham níveis semelhantes de absorção de carboplatina às 24 horas (1241 ± 192 X 10

6 por molécula de células versus 1113 ± 58 X 10

6 molécula por célula, p = 0,334), (fig 2B ).

(AB) Comparação de captação celular e de efluxo. captação celular A. de oxaliplatina. células 5637R tinha diminuído a absorção celular. B: 5637 e 5637R tinham taxas de efluxo celular semelhantes. (CD) diferenças de efluxo celular carboplatina entre as duas linhas de células oxaliplatina e não foram estatisticamente significativas.

Para determinar o efluxo de drogas, as células foram expostas a [

14C] oxaliplatina ou [

14C ] carboplatina durante 4 horas, lavaram-se com PBS e cultivadas em meio isento de drogas durante 24 horas. O meio de cultura foi amostrada por LSC em diferentes pontos de tempo para a determinação da taxa de efluxo. Não houve diferença significativa em oxaliplatina ou efluxo de carboplatina entre as duas linhas de células (o efluxo às 24 horas foi de 1514 ± 78 X 10

6 moléculas em comparação com 1693 ± 244 x 10

6 moléculas por célula para a oxaliplatina, P = 0,293 (Fig 2C), e 542,3 ± 44,5 X 10

6 moléculas contra 482,5 ± 35,9 X 10

6 moléculas por célula para carboplatina, p = 0,14) (Fig 2D)

inativação intracelular.

5637R células tinha uma concentração de GSH média significativamente maior do que 5637 células (/proteína de 53,91 ± 0,83 nmol mg contra 1,20 ± 46,93 nmol /mg de proteína. P = 0,003) (Figura 3A). Para determinar se a concentração mais elevada de GSH contribuiu para quimiorresistência, ambas as linhas de células foram cultivadas na presença de sulfoximina de butionina (BSO), um inibidor da sintetase de gama-glutamilcisteína, que é necessário para a biossíntese de GSH [40]. tratamento BSO diminuição de GSH em ambas as linhas celulares de um modo dependente da dose (Fig 3B). Exposição de 5637R células a 50 um BSO seguido de [

14C] exposição oxaliplatina aumentou os níveis médios de aduto-DNA oxaliplatina às 24 h de 285,4 ± 15,3 adutos por 10

8 nucleótidos para 424,6 ± 67,7 adutos por 10

8 nucleótidos, mas não foi estatisticamente significativa (p = 0,113). No entanto, o tratamento BSO diminuiu significativamente a oxaliplatina IC

50 a partir de 26,08 uM para células 5637R a 12,95 uM para o tratamento BSO (p = 0,002, Fig 3C). Em contraste, o tratamento BSO teve pouco efeito sobre a sensibilidade de 5637 células para oxaliplatina (IC

50 de 2,45 ^ M sem tratamento contra 2,36 uM com exposição BSO, dados não mostrados. Inesperadamente, a exposição BSO não teve impacto sobre a carboplatina IC

50 valores para qualquer uma das linhas de células (dados não apresentados).

(a) Comparação de formação de aduto-DNA carboplatina entre 5637 e 5637R. (B) Comparação e correlação de IC

50 com valores carboplatin- aduzir AUC, os níveis de adutos quatro horas após a administração e reparo do DNA. (C) Comparação de captação celular e efluxo de carboplatina entre 5637 e 5637R células.

droga-DNA formação de aduto e reparação

as células foram cultivadas com [

14C] oxaliplatina a 10 uM (a concentração humana pico aproximado oxaliplatina no plasma durante a quimioterapia) durante 24 horas, seguido por lavagem e a cultura durante mais 24 horas [33]. Este protocolo imita grosseiramente as

exposição in vivo

de oxaliplatina (concentração sanguínea diminuição exponencial ao longo de aproximadamente um dia). As células foram colhidas em vários pontos temporais ao longo de 48 horas de extracção de ADN e por espectrometria de massa acelerador (AMS) análise utilizando métodos previamente relatada [41]. Resumidamente, AMS funciona por quebrar as moléculas em uma amostra em átomos, que são então identificados e quantificados em um pequeno acelerador de partículas [42]. Se a amostra é marcada com um raro isótopo tal como

14C, a concentração de átomos de radiocarbono no feixe de partículas pode ser usado para calcular a concentração de fármaco no sangue, tecidos, células e componentes subcelulares, tais como proteínas e ADN. análise AMS tipicamente requer a conversão de amostras de grafite antes da análise, que pode ser feito usando um processo de elevado rendimento em paralelo. Houve um aumento dependente do tempo nos níveis de aductos ADN-oxaliplatina durante uma incubação de 24 horas, seguido por um decréscimo gradual durante os subsequentes 24 horas, devido a uma combinação de reparação do ADN e a diluição do sinal por síntese de ADN. Em todos os pontos de tempo, os níveis de aducto-DNA em células de oxaliplatina 5637R foram menores do que os níveis de aduto em 5637 células (Fig 4A). Às 48 horas, as células 5637R tinha aductos de ADN muito mais baixas do que as células parentais 5637 (78 ± 4 505 ± 63 contra aductos por 10

8 nucleótidos, p 0,0001, Tabela 2). A AUC de adutos-DNA oxaliplatina integrados sobre o tempo de estudo 48 horas foi significativamente menor para 5637R células (9.426 ± 2.457 adutos-hr por 10

8 nucleótidos contra 27,720 ± 2,985 adutos-hr por 10

8 nucleótidos, p = 0,001, Tabela 2).

Comparação de formação de aduto oxaliplatina e carboplatina-ADN entre 5637 e 5637R células. As células resistente à quimioterapia 5637R tinham níveis mais elevados de aduto-DNA oxaliplatina em todos os pontos de tempo em comparação com mais de tratamento de células sensíveis 5637.

Para os estudos de reparo de DNA, as células foram expostas a [

14C] oxaliplatina durante 24 h, lavou-se e ainda cultivadas em meio isento de oxaliplatina. A diminuição de aductos ADN-oxaliplatina em vários pontos de tempo ao longo das próximas 24 horas foi usada para calcular a velocidade de reparação de ADN-aduto de drogas. células 5637R tinha uma taxa de reparação de 3,48 ± 0,15 adutos por 10

8 nucleótidos /hora e 1,34 ± 0,30 adutos por 10

8 nucleótidos horas para 5637 células (p = 0,0004, Tabela 2).

a formação e reparação de aductos ADN-carboplatina foi determinado de forma semelhante, mas com exposição à droga mais curtos (uma exposição de 4 horas seguida por lavagem e uma incubação de 20 horas em meio isento de fármaco), a fim de imitar o mais rápido

in vivo

semivida no plasma em comparação com a oxaliplatina. níveis aduto-DNA carboplatina e as taxas de reparação do ADN de drogas não foram significativamente diferentes entre as duas linhas de células (AUC de 4,527 ± 895 contra 4,211 ± 1,678 monoaduto-hr /10

8 nucleótidos, p = 0,69, Tabela 2; e drogas as taxas de reparação -ADN de 6,30 ± 3,10 contra 9,31 ± 6,74 aductos /10

8 nucleótidos /h, p = 0,34 para 5637R e 5637 células, respectivamente, (Figura 4B).

RNA-Seq análise de 5637 e células

5637R

o ARN total foi isolado a partir de células subconfluentes que foram cultivadas na ausência de drogas de quimioterapia, e utilizada para a análise por ARN-seq. a partir de experiências independentes em duplicado, havia um total de 83 RNAs com expressão estatisticamente significativa alterações, das quais 50 foram associados com genes conhecidos, um microRNA conhecido e 22 novas transcrições. (p 0,05, S1 figo e S1 Tabela) Os restantes 10 transcrições representam genes que não fornecem expressão mensurável em todas as repetições, mas ainda pode ser de relevância para a resistência às drogas. Quatro genes de relevância conhecida às chemoresistance (TSPAN7, AKR1C2, AKR1C1 e Cyr61) mostraram-se significativamente aumentado no 5637R linha de células resistentes e dois genes (HtrA1 e AQP3) foram reprimidos em comparação com o dos pais A linha de células 5637 (Tabela 3). Os resultados de RNA-seq foram confirmados por análise de qRT-PCR de transcritos selecionados de RNA isolados a partir de culturas confluentes cultivadas sem drogas em duplicado (Fig 5).

Quatro genes (TSPAN7, AKR1C2, AKR1C1, e Cyr61) têm aumentado os níveis de 5637R células e dois genes (HtrA1 e AQP3) têm níveis diminuiu nas células resistentes. (A) Fold alterações nos níveis de genes quimiorresistência em relação às células parentais 5637, tal como determinado pela RNA-seq. (B) Fold alteração nos níveis de transcrição de genes chemoresistance em relação às 5637 células parentais, conforme determinado por qRT-PCR.

Discussão

Depois de dez meses de cultura de células sob pressão da exposição oxaliplatina , a linha de células resistentes resultante é retido uma linhagem 5637, conforme determinado por análise de STR, o que justifica a sua designação como 5637R. Nossos resultados são comparáveis ​​a outros achados de células linhas celulares de cancro resistentes parentais e oxaliplatina [43-46]. É intrigante e surpreendente que a exposição de carboplatina de 5637 células sob condições experimentais semelhantes, não produziu uma linha celular resistente a carboplatina, mesmo que as células 5637R são significativamente resistentes a carboplatina. Este é um resultado inesperado considerando o início clínico quase universal de resistência em cancros avançados no tratamento com regime à base de platina. A dificuldade de induzir resistência carboplatina em 5637 células pode ser devido à resistência cruzada conhecida pobre entre oxaliplatina ou carboplatina e cisplatina [2]. Oxaliplatina pode induzir um conjunto diferente dos espectros de mutação em comparação com a carboplatina, o que tem sido relatada em

Hprt

ensaio de mutação genética em células CHO para uma comparação entre a cisplatina e oxaliplatina [47]. Independentemente de como eles foram gerados, o par de linhas de células resultante representa um sistema modelo útil para a resistência ao fármaco induzida, especialmente considerando o seu relativamente poucos fenotípica e diferenças genotípicas.

O par 5637 /5637R foi avaliada pelo ensaio de MTT para resistência a oxaliplatina e várias drogas que são utilizadas no tratamento de cancro da bexiga. A oxaliplatina, carboplatina e gemcitabina foram significativamente menos citotóxica para células 5637R. A doxorrubicina, metotrexato e vinblastina foram igualmente tóxicas para ambas as linhas celulares. Este resultado não é surpreendente, considerando resistência adquirida a uma droga, muitas vezes seleciona para um ou mais percursos mecanicistas que têm múltiplas drogas como substratos. Na clínica, a resposta à terapia baseada em platina primeira linha é de 40-50% para o músculo invasivo cancro da bexiga, mas uma vez que a resistência se segue, os tratamentos subsequentes têm apenas 10-25% as taxas de resposta [48, 49]. Embora muito trabalho adicional é necessária, os dados MTT do nosso sistema modelo indicam que é viável ter resposta citotóxica substancial à quimioterapia subsequente após o início da resistência de platina drogas se o tratamento correto está selecionado.

Talvez a mais mecanismo de resistência à droga comum é a modulação de acumulação de droga intracelular via mudanças na taxa de captação e de efluxo [42].