Sumário

toxinas proteicas bacterianas geneticamente modificados são atractivas para sistemas de administração de proteínas exógenas para o citosol de células de mamífero. A toxina binária C2 de

C. botulínica

emergiu como veículo de entrega poderoso, que repousa sobre a sua ligação componente /translocação C2IIa e o domínio C2IN adaptador geneticamente modificado que agem em conjunto para provocar a absorção celular. A proteína supressora de tumor p53 tem uma função fundamental na supressão de carcinogénese e é frequentemente inactivado por diferentes mecanismos em células tumorais humanas. Assim, construiu-se uma proteína de fusão C2IN-p53, que é internalizado em células cancerosas por C2IIa. Para este fim, a construção de fusão C2IN-p53 foi sobre-expressa em

E. coli

com boa solubilidade, purificado por cromatografia de afinidade de heparina e proteína identidade foi confirmada por immunoblotting. Nós demonstramos que a proteína de fusão é capaz de se ligar à p53-ADN de consenso com elevada afinidade de um modo específico da p53

In vitro

. Em seguida, a internalização de C2IN-p53 foi monitorizada em células HeLa por fraccionamento celular e análise de imunotransferência, que revelou uma translocação C2IIa mediada da proteína de fusão para o citosol. A absorção também foi mostrado na A549 e as células Saos-2 com eficiência semelhante. Estas conclusões foram corroboradas por imunofluorescência confocal análises de células HeLa e A549 C2IN-p53 /C2IIa-tratados, exibindo a localização predominantemente citoplasmática da construção de fusão

Citation:. Fahrer J, J Rausch, Barth H (2013) uma proteína celular permeável Fusão Baseado em

Clostridium botulinum

C2 Toxina para Entrega de p53 Tumorsuppressor em células cancerosas. PLoS ONE 8 (9): e72455. doi: 10.1371 /journal.pone.0072455

Autor: Mark Isalan, Centro de Regulação Genômica, Espanha |

Recebido: 02 de junho de 2013; Aceito: 18 de julho de 2013; Publicação: 05 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Fahrer et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Faculdade de Medicina da Universidade de Ulm (Bausteinprojekt L.SBN.0060 para JF) e um Stipendium pesquisa da Experimental Medicine Programa de Ulm para JR. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a toxina C2 de

Clostridium botulinum

é o protótipo de toxinas binárias actina-ADP-ribosilação [1] e consiste no componente enzima C2I, que mono-ADP-ribosylates G-actina e o separado C2II componente de ligação /translocação. C2II devem sofrer clivagem proteolítica na sua extremidade N-terminal para gerar o C2IIa biologicamente activo, que medeia a captação de C2I para o citosol da célula hospedeira [1]. Em solução, C2IIa forma um heptâmero denotado como pré-poros e se liga ao seu receptor encontrados na superfície das células de todos os tipos de células de mamífero até agora testadas [2]. Após a montagem com C2I, o complexo C2I /C2IIa entra na célula por endocitose mediada por clatrina em forma PI3K- e AKT-dependente [3], [4]. Em resposta à acidificação que ocorre no início de endossomas, C2IIa é submetido a um interruptor conformacional, provocando a sua inserção na membrana endossomal, onde forma uma poro de trans-membrana [5]. Isto permite a translocação de C2I para o citosol, que é promovida por chaperonas da célula hospedeira, tais como Hsp90 e peptidil prolil

cis /trans

isomerases [6], [7]. Subsequentemente, C2I catalisa a transferência covalente de ADP-ribose para G-actina utilizando NAD

+ como co-substrato [8]. Esta modificação covalente resulta em um colapso do citoesqueleto de actina e, finalmente, provoca a morte celular dependente de caspase [9].

Devido às suas propriedades, a toxina C2 binário tem sido utilizado em vários estudos como um sistema de entrega de facilitador versátil a absorção de proteínas exógenas no citosol da célula hospedeira [10]. O domínio N-terminal de C2I (C2IN) liga-se a C2IIa e é crucial para a internalização C2IIa-mediada, mas não compreendem o domínio da enzima que é responsável pelo efeito citotóxico. Portanto, o adaptador de C2IN podem ser ligados a proteínas de interesse por meios genéticos, seguido de expressão de proteínas de fusão recombinantes. Anteriormente, C2IN foi fundido com o factor de virulência de SpvB

Salmonella enterica

para desencadear a sua internalização em células de mamíferos [11]. Um outro exemplo importante envolve o bacteriana ADP-ribosiltransferase C3, um inibidor selectivo da Rho GTPase, que também foi expressa como proteína de fusão C2IN e abriu o caminho para elucidar a sinalização mediada por Rho-em células eucarióticas [10], [12]. Recentemente, C2IN tem sido associada à proteína estreptavidina, gerando um sistema versátil de mamífero para a entrega de moléculas marcadas com biotina (macro) [13] de ligação à biotina.

A proteína p53 supressor de tumores é um factor de transcrição que é activado em resposta a diversos estímulos de estresse, tais como insultos genotóxicos e hipoxia [14]. p53 é um jogador-chave na manutenção da integridade genômica e exerce actividade anti-cancro, governando a progressão do ciclo celular e induzir a morte celular por apoptose em células severamente danificados. Actua principalmente como um indutor da transcrição de uma ampla gama de genes envolvidos na paragem do ciclo celular e senescência, e a apoptose de reparação do ADN [15], mas também é capaz de desencadear a apoptose de uma maneira independente de transcrição [16]. De importância, a p53 é inactivada encontrada em muitos tumores humanos devido a mutações adquiridas no seu DNA domínio central [17] e o aumento da degradação proteolítica de ligação depois de (poli) ubiquitinação [18]. Devido às suas funções centrais na supressão do tumor, p53 está no foco das estratégias de investigação e numerosos biomédicos e clínicos têm sido desenvolvidos para restaurar p53 em células tumorais deficientes em p53 [19]. Uma abordagem promissora visa a entrega do gene de p53 em células tumorais por diferentes veículos. Foi recentemente demonstrado que as microsferas poliméricas carregadas com nanopartículas de ADN-quitosano que alberga o gene p53 humano são eficientemente internalizados em células do hepatoma humano [20]. Outro estudo relatou a captação simultânea do gene p53 e o agente antineoplásico doxorrubicina através de um sistema de nanopartículas híbrido em células HeLa [21]. Uma outra estratégia interessante repousa sobre a internalização da proteína p53 ligado a peptídeos (poli) que facilitam a sua absorção. Para este fim, a p53 foi fundido com hormona libertadora de gonadotropina (GnRH), que permite a absorção das proteínas de fusão em células de tumor da GnRH-positiva por endocitose mediada pelo receptor [22]. Além disso, mostrámos muito recentemente que a proteína p53 de biotina-conjugado é internalizado em uma forma não-covalente pelo sistema de transporte C2-estreptavidina [23].

Aqui relatamos a geração de uma proteína de fusão, em que p53 humana foi ligado ao domínio C2IN adaptador por engenharia genética, facilitando assim a sua entrega pelo C2IIa ligação /unidade de translocação em células cancerosas. Mostra-se que a actividade de ligação a ADN específica recombinante C2IN-p53 da proteína de fusão é exibido

In vitro

e demonstram a absorção C2IIa-dependente de C2IN-p53 para o citosol de diversas linhas celulares de cancro, tais como carcinoma de colo do útero HeLa e A549 células de adenocarcinoma de pulmão.

resultados

a engenharia genética, expressão e purificação de GST-marcado C2IN-p53

cDNA p53 humano foi clonado no frame com o domínio adaptador C2IN em ordem para gerar o plasmídeo de expressão de p-GEX2T-C2IN-p53, o qual contém a construção de fusão C2IN-p53 marcada com GST (Fig. 1A). Aqui, o domínio C2IN medeia a captação C2IIa-dependente da proteína de fusão para o citosol da célula hospedeira, enquanto que a porção de p53 é suposto exercer efeitos anti-proliferativos sobre internalização. A proteína de fusão foi sobre-expresso subsequentemente a 16 ° C em

E. células de E. coli Rosetta

expressão e dependente do tempo foi analisada por coloração com Coomassie e transferência de Western (Fig. 1B). A coloração de Coomassie revelou uma banda de cerca de 97 kDa de acordo com o peso molecular esperado de GST-C2IN-p53, o que aumentou ao longo do tempo. Em consistência, a detecção de imunotransferência com um anticorpo monoclonal dirigido contra a p53 humana também apresentada uma banda de proteína com um peso molecular emergente semelhante. expressão máxima da proteína de fusão foi encontrada após 20 h, no entanto, com alguns produtos degradações. A expressão da construção, à temperatura mais elevada (29 ° C) resultou em níveis de expressão mais elevados com a facilidade de consideravelmente mais produtos de degradação (dados não mostrados). Assim, culturas bacterianas colhidas após 20 horas foram lisadas por sonicação e o ligado obtido foi carregado numa coluna de permuta aniónica. GST-C2IN-p53 foi recuperado no fluxo de passagem (dados não mostrados) e, em seguida injectada numa coluna de heparina-Sepharose. A GST-C2IN-p53 ligada foi eluída por um gradiente de sal monitorizada por absorvância de UV e as fracções recolhidas foram avaliadas para o teor de p53 por Western blot (Fig. 1C). A proteína de fusão marcada com GST foi detectada principalmente nas fracções C4-C6, que corresponde ao terceiro pico no cromatograma FPLC. Estas fracções foram reunidas e dialisadas contra tampão de baixa salinidade, o que resulta em uma concentração média de fusão de 250 ng de proteína /ml. De nota, a purificação por afinidade da proteína de fusão glutationa-Sepharose por não era possível. Além disso, a trombina clivagem para remover a tag não foi eficaz, razão pela qual esta etapa de purificação foi omitido.

A

. Esquema da construção de fusão GST-p53-C2IN.

B

. curso de tempo de expressão GST-C2IN-p53 em

E. coli

Rosetta. As amostras foram colhidas depois de pontos de tempo indicados (0, 1, 3, 6 e 20 h) e sujeitos a SDS-PAGE seguido por coloração com Coomassie (topo) ou análise de transferência de Western utilizando um anticorpo de p53 (em baixo). GST-p53-C2IN é indicado por uma seta.

C

. A purificação da proteína de fusão GST-p53-C2IN por cromatografia de afinidade de heparina. GST-C2IN-p53 foi isolado a partir de extractos de células inteiras por cromatograf ia à base de heparina e eluída por um gradiente linear de sal tal como monitorizado por absorvância no UV. Subsequentemente, as fracções recolhidas durante a cromatografia de afinidade foram caracterizados por análise de imunotransf erência com o anticorpo p53.

Tomados em conjunto, uma estrutura de fusão que consiste em C2IN e p53 foi clonado com sucesso, expressa e purificada por cromatografia de afinidade de heparina, com um rendimento suficiente .

In vitro

caracterização de GST-C2IN-p53

O isolado recombinante GST-C2IN-p53 foi caracterizado pela primeira vez por transferência de Western com anti-C2IN, anti-p53 e anticorpos anti-GST (Fig. 2A). Para além da proteína de fusão, alguns fragmentos de degradação menores foram também visível, particularmente ainda depois de tempos de exposição longos. Em seguida, foi determinada a capacidade de ligação a ADN específica da GST-C2IN-p53

In vitro

por meio de um ensaio de desvio de mobilidade electroforética (EMSA), uma vez que esta é uma propriedade importante para as suas funções dependentes de transcrição. Este ensaio baseia-se na ligação de p53 a um duplex de oligonucleótido biotinilado que contém a sequência de consenso encontrado no promotor de MDM2. A incubação deste dúplex com GST-C2IN-p53 resultou na formação de complexos de elevado ADN peso /GST-C2IN-p53 moleculares de uma maneira dependente da concentração, com o desaparecimento do oligonucleótido livre já a 250 ng e a ocorrência de um ADN específico complexo -protein a 500 ng proteína de fusão. Ao mesmo tempo, o GST-C2IN-p53 foi detectada por um anticorpo anti-C2IN. Como controlo, C2IN recombinante (~26 kDa) foi incluído, o qual não produz nenhum complexo visível, justificando assim o dependente de p53 de ligação ao ADN da proteína de fusão. Deve também ser mencionado que a ligação de C2IN p53-ADN foi semelhante ao de p53 de tipo selvagem (dados não mostrados), indicando que não houve perda de actividade de ligação a ADN devido a engenharia genética.

A. Detecção de

diferentes domínios da proteína de fusão através de Western blotting. Quantidades crescentes de GST-C2IN-p53 (50, 100 e 200 ng) foram separadas por electroforese e subsequentemente analisadas por transferência de Western com diferentes anticorpos (anti-C2IN, anti-p53, anti-GST).

B

. de GST-p53-C2IN purificado ligação de ADN-. quantidades crescentes de GST-p53-C2IN foram incubadas com um duplex de oligonucleótido marcado com biotina contendo um elemento responsivo p53 (p53-RE). A formação do complexo foi então monitorizada por PAGE nativa, seguido por detecção com estreptavidina-POD (STV-POD). C2IN serviu como controlo negativo e foi visualizada por um anticorpo C2IN. A estrela denota uma porção de biotina, enquanto que o círculo representa a GST-tag da proteína de fusão.

Colectivamente, a identidade de GST-C2IN-p53 foi confirmada por meio de anticorpos específicos e a proteína de fusão era activa

in vitro

, como ele exerceu actividade de ligação a ADN específica.

internalização C2IIa mediada de GST-C2IN-p53 em células cancerosas

em seguida, abordaram a questão de saber se GST-p53-C2IN é internalizado em células cancerosas através C2IIa. As experiências iniciais foram realizadas em células HeLa por causa da sua expressão fortemente reduzida de p53 endógeno [24]. As células HeLa foram incubadas durante diferentes tempos com GST-p53-C2IN mais C2IIa e, em seguida, submetido a digitonina baseado no fraccionamento de células. detecção Immunoblot com o anticorpo p53 revelou um aumento dependente do tempo de GST-C2IN-p53 em células HeLa extraídos (Fig. 3 A, painel da esquerda), que inclui a proteína de membrana de células-ligado e internalizado residente em vesículas. GST-C2IN-p53 foi mostrado para translocar para o citosol com um máximo após 5 h (Fig. 3A, painel da direita), que também foi detectado por um anti-C2IN (dados não mostrados). No entanto, GST-p53-C2IN não era detectável no citosol após 24 h (dados não mostrados), que pode ser uma consequência da sua degradação proteossoma. Como controlo negativo, as células foram desafiadas com GST-C2IN de p53 na ausência de C2IIa. Aqui, GST-C2IN-p53 foi detectada em células extraídas, mas não no citoplasma, que pode ser um resultado de ligação não específica. antigénio precoce endossoma 1 (EEA1), uma proteína marcadora para vesículas endossomais primeiros [25] foi encontrada apenas em células extraídas, mas não no citosol, demonstrando preparação bem sucedida da fracção citosólica sem contaminação cruzada por endossomas precoces (Fig. 3A, os melhores painel).

A.

absorção de C2IN-p53 em células de carcinoma de colo do útero HeLa monitorados pelo fracionamento celular. As células HeLa foram incubados com GST-C2IN-p53 e C2IIa para até 5 h. Em seguida as células, o fraccionamento de células à base de digitonina foi realizado e extraídos, bem como fracções citosólicas foram sujeitos a SDS-PAGE e subsequente transferência de Western. Internalizado GST-C2IN-p53 foi detectada por anticorpos anti-p53. Hsp90 foi detectado como controle de carga, enquanto EEA1 foi visualizado para descartar uma contaminação cruzada da fração citosólica com início endossomas.

B

. internalização C2IIa dependente de GST-C2IN-p53 em adenocarcinoma A549 pulmão e células de osteossarcoma Saos-2 (

C

). As células foram tratadas e processadas como descrito acima, excepto que Rab5 foi detectado como marcador para os primeiros endossomas.

Estimulados por estes resultados, outras linhas celulares de cancro, incluindo células de adenocarcinoma pulmonar A549 (p53-wt) e Saos células de osteossarcoma -2 (p53-negativos) foram analisados. A entrega C2IIa-dependente de GST-p53-C2IN para o citosol foi comparável ao observado nas células HeLa (Fig. 3B e C). Deve ser mencionado que alguns GST-C2IN de p53 também foi detectável em extraídas células Saos-2 na ausência de C2IIa, que pode ser atribuída a uma ligação não específica à superfície de células e subsequente pinocitose (Fig. 3C). Apenas quantidades negligenciáveis ​​de a proteína de fusão foram visualizadas em células A549 permeabilizadas-digitonina na ausência de C2IIa, indicando a absorção C2IIa-dependente específica nestas células (Fig. 3B). Por favor note que a detecção da pequena GTPase Rab5, uma proteína marcadora estabelecido para endossomas precoces [26], foi usada como controlo de qualidade para a preparação de citosol.

Além disso, a especificidade de captação e localização subcelular da GST-C2IN -p53 foi analisado em mais detalhe por meio de microscopia confocal de imunofluorescência das células HeLa tratadas durante 5 horas com GST-C2IN-p53 na ausência ou na presença de C2IIa. Para visualizar os núcleos, as células foram contrastadas por PARP-1 e 0,75 uM secções ópticas foram obtidas e avaliadas para GST-C2IN-p53 utilizando um anticorpo C2IN. Apenas quantidades muito pequenas de GST-p53-C2IN foram encontrados na ausência de C2IIa, o que evidencia a especificidade de captação C2IIa-dependente. A maior parte internalizado GST-p53-C2IN exibida localização citoplasmática, mas também foi detectado no núcleo, onde é co-localizado com a PARP-1, como evidenciado pela coloração amarela no canal resultante da concentração (Figura 4A..). Além disso, confirmou a entrega C2IIa dependente de GST-C2IN-p53 em células A549, que mostrou uma distribuição intracelular comparável como observado em células HeLa (Fig. 4B).

A

. A microscopia confocal de absorção de GST-C2IN-p53 em células HeLa. As células foram tratadas com GST-C2IN-p53 e C2IIa durante 5 h. Como controle, as células foram deixados sem tratamento ou incubadas sem C2IIa. Subsequentemente, as células foram fixadas, permeabilizadas e coradas para C2IN com um anticorpo policlonal seguido por um anticorpo secundário acoplado a Alexa 633 (vermelho). A PARP-1 foi detectada com um anticorpo monoclonal e subsequente coloração por um anticorpo secundário conjugado com Alexa 488-visualizar os núcleos (verde). imagens Z-Stack foram registradas em 0,75 mm secções ópticas e processado por ImageJ. Imagens representativas dos mesmos são mostrados. Barra de escala: 10 ^ m.

B

. Entrega de GST-C2IN-p53 em células A549. As células foram tratadas e processadas como descrito acima. imagens Z-Stack foram adquiridas em 0,75 mm secções ópticas e processado por ImageJ. Imagens representativas dos mesmos são mostrados. Barra de escala:.. 10 um

Em resumo, demonstramos que GST-C2IN-p53 é eficientemente internalizados para o citosol de várias linhas de células cancerosas de forma C2IIa dependente específica

Discussão

o presente estudo baseia-se uma proteína de fusão geneticamente modificado baseado em toxina C2 não-tóxico, que proporciona a proteína supressora de tumores p53 no citosol de várias linhas celulares de cancro. Aqui, a p53 foi clonado em grelha com o domínio C2IN adaptador que medeia a interacção com a ligação a C2IIa /unidade de translocação, que conduz à sua absorção celular subsequente. O constructo foi expressa como proteína de fusão GST-marcados e purificado por cromatografia de afinidade de heparina. No entanto, a GST-tag foi mostrado para ser deficiente em ligação ao glutationo e não podia ser removido por clivagem da trombina, o que pode ser devido a impedimento estérico a bloquear o acesso da trombina para o seu local de clivagem. No entanto, a restante porção de GST-na extremidade N-terminal da proteína de fusão não impediu o ADN de ligação da proteína de fusão mediada por p53

In vitro

, nem a sua absorção C2IIa-dependente para o citosol de células alvo . Isto está em linha com os resultados anteriores mostram que a GST-tag N-terminal faz nem inibir a entrega eficiente mediada por C2II de GST-C2I [27], nem a da toxina de fusão GST-C2IN-C3lim [28] para o citosol de células HeLa células. Isto é notável, uma vez que o enrolamento correcto da proteína p53 é essencial para a sua actividade de ligação ao ADN e é afectada por uma variedade de factores, incluindo o estado redox [29] e outros [30].

Uma estratégia alternativa envolve biotina-rotulagem de p53 recombinante e a sua subsequente conjugação ao transportador C2-estreptavidina, como muito recentemente demonstrado pelo nosso grupo [23]. No entanto, a ligação covalente de p53 para o adaptador C2IN como aqui apresentado oferece uma estabilidade superior em comparação com a conjugação de biotina-p53 para C2IN-estreptavidina de uma forma não-covalente [23], uma vez que repousa sobre uma porção estreptavidina com a diminuição da biotina afinidade de ligação [13], [31]. Por outro lado, isto permite a libertação intracelular do ligando marcado com biotina,

por exemplo

. por competição com biotina endógena.

A seguir, foi demonstrada a absorção mediada por C2IIa da proteína de fusão GST-p53-C2IN em várias linhas de células cancerosas, em que translocado para o citosol como confirmado por imunotransferência de detecção sobre células fracionamento. Esta é uma descoberta interessante tendo em conta que o poro tanslocation formado por C2IIa em membranas de vesículas endossomais acidificadas é bastante estreito [32] e pode restringir a translocação de GST-C2IN-p53. Portanto, um desdobramento parcial da proteína de fusão pode ser necessária, como observado por outros parceiros de fusão à base de C2IN [33]. Nós não analisaram a funcionalidade p53 da proteína de fusão em células vivas após internalização e, assim, não se pode excluir que o processo de translocação com putativo desdobramento de C2IN-p53 pode ter afectado a sua função como factor de transcrição, que tem de ser investigada em estudos futuros . Não foram observadas diferenças significativas em relação à internalização citosólica entre as linhas celulares testadas. De nota, p53 endógena foi detectável em células não extraídos nem no citosol de todas as linhas celulares com as configurações utilizadas para análise de Western blot. Este não é notável, uma vez que células HeLa e as células Saos-2 foram relatados para exibir muito baixa até níveis indetectáveis ​​proteína p53 [24], [34]. Além disso, mostrámos recentemente p53 endógeno em células A549 não esforçados por microscopia confocal utilizando apenas alta intensidade do laser [35] ou por indução de dano do ADN por doxorrubicina (dados não mostrados). No entanto, alguma ligação não especifica da proteína de fusão na ausência de C2IIa foi revelado em extraída HeLa e as células Saos-2. GST-p53-C2IN acumulado no citosol após 5 h, mas que já não era detectável após 24 horas (dados não mostrados). Em consistência, uma degradação citosólica também tem sido relatada para outras proteínas de fusão à base de C2IN, tais como C2IN-C3 [36], C2IN-SpvB [37] e C2IN-estreptavidina [38]. Após internalização em células HeLa e A549 GST-C2IN-p53 foi detectada principalmente no citoplasma e menos proeminente no núcleo tal como observado por microscopia confocal. Isto está de acordo com a noção de que p53 é encontrada no citoplasma de células não esforçados, devido à exportação nuclear CRM1-dependente em associação com proteínas MDM2 [39], [40]. No entanto, é preciso ter em mente que a localização subcelular de p53 é rigidamente controlado por uma rede de modificações pós-translacionais e interações proteína [41], que também pode ser influenciada pela GST-tag ou o C2IN-domínio.

Devido à expressão ubíqua do receptor C2IIa em todas as células de mamífero testadas [42], a proteína de fusão GST-p53-C2IN pode ser entregue em uma ampla gama de linhas de células tumorais e de células primárias. A fim de alcançar uma distribuição direccionada, é concebível para modificar o componente de ligação C2IIa /translocação. Para este fim, o domínio C-terminal de C2IIa que interage com o receptor da superfície celular pode ser modificada por engenharia genética, preservando a capacidade de se translocalizar C2IIa C2IN para o citosol [43]. O C2IIa modificada podia então ser fundida com polipéptidos tais como o factor de crescimento epidérmico (EGF) ou somatostatina, que promovem a ligação de EGF ou somatastatin-receptor que são frequentemente sobre-expressa em células cancerosas [44], [45]. Esta estratégia tem sido descrito para o antigénio protector (PA), o componente de ligação /translocação das toxinas binárias antraz que está intimamente relacionado com C2IIa. A forma mutante do PA deficiente em reconhecimento do receptor era C-terminal fundido com EGF humano e dirigido a absorção de LF e EF em células EGF-receptor de rolamento [46].

Um cenário potencial para o

em vivo

administração de C2IN-p53 na terapia de tumores seria uma injecção intratumoral da proteína de fusão em complexo com C2IIa nativa ou modificada com grupos C2IIa segmentação como discutido acima. Esta estratégia pode inicialmente ser testada em xenoenxertos de ratinho obtidos após a injecção de células HeLa e pode então ser traduzidos nas clínicas para o tratamento de tumores sólidos. No entanto, a entrega selectiva em células tumorais ea exclusão de efeitos imunogénicos putativos induzidos pela proteína de fusão são pré-requisitos fundamentais para

in vivo

aplicação.

Em conclusão, nós construímos uma proteína de fusão bem sucedida que manteve o seu DNA dependente de p53 actividade de ligação ao

in vitro

e é internalizada através do seu domínio C2IN para o citosol de várias linhas celulares de cancro que utilizam o componente de ligação C2IIa /translocação.

Materiais e Métodos

Clonagem da proteína de fusão p53-C2IN

ADNc p53 humana foi amplificado por PCR a partir do plasmídeo p53 RcCMV-humana, que foi gentilmente cedido pelo Dr. Michael Schwarz (Universidade de Tuebingen, Alemanha). Para este fim, os iniciadores p53-I (5′-GAATTCAGATCTGAGGAGCCGCAGTC-3 ‘) e p53-II (5′-GAATTCGGATCCTCAGTCTGAGTCAGG-3’) foram usadas que permitiu a inserção de um

Bgl II e uma

Bam

sítio de restrição H1. O produto de PCR obtido foi então ligado em pCR-Blunt vectorial por meio do kit de clonagem de PCR Zero Blunt (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) e transformado em competente

E. coli DH5a células

. O plasmídeo pCR-p53 foi isolado e amplificação correcta foi verificada por sequenciação de ADN (GATC, Konstanz, Alemanha). Posteriormente, isolado plasmídeo pCR-p53 foi digerido com

Bgl

II e

Bam

H1 para liberar cDNA p53 e ligado no plasmídeo pGEX2T-C2IN que tinha sido linearizado com

Bam

H1. Após a transformação em competentes

E. células de E. coli,

correcta inserção de ADNc de p53 no plasmídeo resultante pGEX2T-C2IN-p53 foi verificada por PCR de colónia e análise com enzimas de restrição. Finalmente, a construção de fusão C2IN-p53 foi sequenciado com o pGEX2T 5’e primers 3′-seqencing (GATC, Konstanz, Alemanha).

Expressão e purificação do recombinante C2IN-p53

a construção de fusão C2IN-p53 gerado foi overexpressed como proteína de fusão GST-marcado em

E. coli Rosetta

e purificada até à homogeneidade por cromatografia de afinidade. Para este fim,

E. células de E. coli transformadas com

Rosetta pGEX2T-C2IN-p53 foram cultivadas até uma densidade óptica de 0,6 e a expressão da proteína foi induzida por adição de isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG). As culturas bacterianas foram então incubadas durante 20 h a 16 ° C e colhidas por centrifugação. A lise celular foi realizada por sonicação em tampão contendo 0,1% de Triton X-100 e detritos celulares foi sedimentado por centrifugação a 20 000

g

durante 15 min a 4 ° C. O lisado clarificado foi carregado numa coluna Fast Flow de Q-Sepharose (GE Healthcare, Munique, Alemanha) e o fluxo através contendo GST-C2IN-p53 foi colhido. Subsequentemente, a amostra foi injectada sobre uma coluna de heparina-Sepharose (GE Healthcare Alemanha) e eluída por um gradiente de sal linear de NaCl variando de 0 até 1 m. As fracções com GST-C2IN-p53 foram então reunidas e dialisadas contra um tampão que consiste em 20 mM HEPES /KOH pH 7,4, NaCl 50 mM e DTT 5 mM. identidade Proteína de isolado de GST-C2IN-p53 foi confirmada por 10% SDS-PAGE e subsequente análise de Western blot utilizando um anticorpo policlonal C2IN criados em coelhos [10], um anticorpo monoclonal de p53 (DO-1, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemanha ) e um anticorpo GST (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha), respectivamente. Para analisar a expressão dependente do tempo de GST-p53-C2IN, alíquotas de 100 ul de cultura bacteriana foram recolhidas e submetidas a 10% de SDS-PAGE seguido por coloração com Coomassie e imunotransf erência como descritas acima.

Expressão e purificação de C2IN e C2IIa

C2IN (~26 kDa) e C2II (~81 kDa) foram expressos como proteínas GST-marcado em

e. coli

BL21 e purificada por cromatografia de afinidade de glutationa, como descrito anteriormente [1], [10]. Após isolamento das proteínas, a fracção de GST foi removido por clivagem por trombina e C2II (~61 kDa) foi activada por digestão com tripsina para se obter C2IIa como relatado [1]. A pureza das proteínas foi analisada por 12,5% de SDS-PAGE e subsequente coloração com Coomassie.

de ligação ao ADN de p53 ensaio

O específica de GST-tagged C2IN-p53 foi determinada através de uma ligação de ADN-electroforética ensaio de desvio de mobilidade (EMSA). Para este fim, utilizou-se um oligonucleótido duplex abrigando um local de ligação da p53 MDM2 do promotor, tal como descrito anteriormente [47]. A ligação de C2IN-p53 com os resultados oligonucleótido duplex em complexos de elevado peso molecular de ADN-p53 com mobilidade electroforética reduzida. Quantidades crescentes de GST-p53-C2IN (0-2000 ng de proteína) foram pré-incubados em tampão de ligação de ADN durante 10 min seguido da adição de biotina-duplex oligonucleótido marcado na extremidade (6 nM). A formação do complexo foi deixada a ocorrer durante um adicional de 20 min antes da terminação da reacção por adição de tampão de carga EMSA em gelo. As amostras foram em seguida separados por 6% (w /v) de PAGE nativa e transferidas para uma membrana de nylon carregada positivamente (GE Healthcare, Munique, Alemanha) por blotting semi-seco. Posteriormente, a membrana foi fixado para 60 minutos a 90 ° C e bloqueadas com 2% (w /v) de BSA em PBS-T. complexos de oligonucleótido duplex e ADN-p53-C2IN biotinilados livres foram detectados com estreptavidina-peroxidase (1:15,000) usando quimioluminescência aumentada.

de SDS-PAGE e imunotransferência análise

As proteínas foram separadas por SDS- PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose (Whatman, Dassel, Alemanha) numa câmara húmida-blot (GE Healthcare, Munique, Alemanha). A membrana foi bloqueada com 5% (w /v) de leite seco não gordo em PBS contendo Tween-20 [0,1% (v /v), PBS-T] durante 1 h à temperatura ambiente (RT). Subsequentemente, a membrana foi incubada com o respectivo anticorpo primário diluído em PBS-T durante 1 h a RT. Depois de se lavar a membrana 3 vezes com PBS-T, foi sondada com o anticorpo secundário adequado acoplado a peroxidase de rábano (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemanha) durante 1 h. Depois de mais passos de lavagem, as proteínas foram detectadas por quimiluminescência utilizando o Immobilon Ocidental HRP quimioluminescente Substrato (Millipore, Schwalbach, Alemanha).

cultura celular

HeLa células de adenocarcinoma e carcinoma de colo do pulmão A549 foram mantidas a 37 ° C e 5% (v /v) CO

2 em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de vitelo inactivado pelo calor (FCS), L-glutamato (2 mM), 100 U /mL de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. Saos-2 osteossarcoma células foram mantidas em meio 5A de McCoy modificado suplementado com 2 mM de L-glutamina, 10% de FCS inactivado por calor e antibióticos. As células foram rotineiramente tripsinizadas e reseeded três vezes por semana.

baseada em Digitonin fracionamento celular

fracionamento celular de HeLa, A549 ou células Saos-2 foi realizada essencialmente como descrito anteriormente [13], [ ,,,0],48]. Resumidamente, as células foram cultivadas em placas de 12 poços durante a noite e tratada com um complexo de GST-p53-C2IN (2,5 ug /ml) e C2IIa (5 ug /ml) para os pontos de tempo indicados. Como um controlo, as células foram deixadas não tratadas ou incubadas com GST-C2IN de p53 na ausência de C2IIa.