Sumário

Há uma necessidade de reduzir o número de cistoscopias em pacientes com hematúria. Atualmente não há biomarcadores confiáveis ​​para detectar o câncer de bexiga. Neste trabalho, nós avaliamos uma nova simples em casa fabricada, dispositivo de GC-sensor no diagnóstico de cancro da bexiga com base em compostos voláteis. saídas do sensor de 98 amostras de urina foram usadas para construir e testar modelos de diagnóstico. As amostras foram colhidas a partir de 24 pacientes com carcinoma de transição (urotelial) célula (idade 27-91 anos, média 71 anos) e 74 controlos que apresentam sintomas urológicos, mas sem uma malignidade urológica (idade 29-86 anos, média de 64 anos); os resultados foram analisados ​​utilizando duas abordagens estatísticas para avaliar a robustez da metodologia. Um método de análise discriminante linear de dois grupos usando um total de 9 pontos no tempo (o que equivale a 9 biomarcadores) atribuídos corretamente 24/24 (100%) dos casos de câncer e 70/74 (94,6%) controles. Sob leave-one-out validação cruzada 23/24 (95,8%) dos casos de câncer foram previu corretamente com 69/74 (93,2%) dos controles. Para a análise de mínimos quadrados parciais discriminante, os leave-one-out valores corretos previsão de validação cruzada foram 95,8% (casos de câncer) e 94,6% (controles). Estes dados são uma melhoria em relação aos relatados por outros grupos que estudam gases do espaço interno e também superiores às técnicas clínicas atuais. Este novo dispositivo apresenta potencial para o diagnóstico de cancro da bexiga, mas os dados deve ser reproduzido em um estudo maior

Citation:. Khalid T, Branco P, De Lacy Costello B, Persad R, Ewen R, Johnson E , et ai. (2013) Um estudo piloto Combinando um dispositivo GC-Sensor com um modelo estatístico para a Identificação de cancro da bexiga de Headspace urina. PLoS ONE 8 (7): e69602. doi: 10.1371 /journal.pone.0069602

editor: Wei-Chun Chin, da Universidade da Califórnia, em Merced, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de fevereiro de 2013; Aceito: 10 de junho de 2013; Publicação: 08 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Khalid et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

cONFLITO dE iNTERESSES:. Eu li a política da revista e tem as seguintes conflitos: Christopher Probert, Ben de lacy Costello, Norman Ratcliffe e Richard Ewen tem um pedido de patente GB (GB 0.920.315,9 ) que protege o desenho do sistema de detecção. Confirmamos que os autores Christopher Probert, Ben de Lacy Costello, Norman Ratcliffe e Richard Ewen tem uma patente relativa a pertinente material a este artigo. O título da patente é um “dispositivo e método para analisar amostras para diagnosticar a doença”. Os números são associados (WO2011061308, EP2010067859, GB0920315.9). Confirmamos que isso não altera a nossa adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de partilha, conforme detalhado no guia para os autores.

Introdução

Mais de 10.000 pacientes são diagnosticados com câncer de bexiga no Reino Unido anualmente e metade morrerá da doença [1]. A maioria dos pacientes (80%) apresentam com hematúria indolor que deve ser investigado [2]. Daqueles com hematúria visível 19% terão câncer de bexiga enquanto para hematúria não-visível a taxa é de apenas 5% [3]. Hematúria, embora importante, tem uma baixa probabilidade pré-teste de diagnóstico de cancro da bexiga para os quais não existem testes de triagem. Consequentemente, cistoscopia continua sendo o padrão ouro para a detecção da doença em pacientes com hematúria [4]. Cistoscopia é um procedimento freqüentemente realizado eo custo para o SNS, de investigar pessoas acharam não ter câncer de bexiga, é de £ 33,5 milhões por ano [3], com base em uma tarifa atualmente em torno de £ 400. Cistoscopia é um procedimento caro, invasivo e indigno. Há uma necessidade de uma alternativa barata, menos invasivo.

casos de câncer de bexiga apresentam em um estágio inicial pode ser tratada por ressecção transuretral sem a necessidade de cirurgia de grande porte extirpative. Além disso, esta doença em estágio inicial tem excelente taxa de sobrevivência de 5 anos ( 94%) em relação a 50% de sobrevida em 5 anos para a doença mais avançada, então um teste de rastreio não-invasivo que identifica o câncer em um estágio inicial da urina headspace tem o potencial para revolucionar o atendimento ao paciente. Apesar de ressecção, a maioria (50-70%) se repitam e 10-30% evoluem para doença avançada [5], cheques cistoscopia, consequentemente, frequentes são necessárias que respondem por 71% dos custos do tratamento de câncer de bexiga [6]. Estes fatores fazem com que o câncer de bexiga é o câncer mais caro por paciente para administrar [7]. Várias opções de triagem em massa têm sido considerados, incluindo a vareta hematúria, NMP22, ou UroVysion [8]. No entanto, estes marcadores, bem como citologia de urina, têm falta de sensibilidade [9]. Actualmente, não há biomarcadores pode ser recomendado para a prática clínica devido à sua fraca sensibilidade e especificidade, embora haja alguma evidência que os biomarcadores podem ser de utilidade no controlo de recorrência ou rastreio de indivíduos com alto risco [10]. New biomarcador seletiva (s) para câncer de bexiga iria reduzir a incerteza diagnóstica e morbidade relacionada à vigilância. Pode reduzir os custos e melhorar a qualidade de vida dos pacientes, evitando testes de diagnóstico invasivos desnecessários. Ele também pode melhorar o prognóstico para os doentes através da detecção precoce da doença potencialmente letal e simultaneamente diminuir o encargo económico de clínicas hematúria [11]. Existe alguma evidência para suportar a hipótese de que o cancro da bexiga está associada com a presença de compostos orgânicos voláteis específicos (COV) no gás emitido a partir de amostras de urina. Em 1999 Spanel et ai. informou que o formaldeído era mais abundante na urina de homens com câncer de bexiga do que daqueles com câncer de próstata e controles saudáveis ​​[12]. Um estudo em que os cães foram treinados para responder às amostras de urina de pacientes com câncer de bexiga deu uma taxa de sucesso média de 41% em comparação com os 14% esperados pelo acaso [13]. Mais recentemente, o mesmo grupo relatou que o cão melhor executar poderia identificar 73% dos cancros do [14]. Enquanto isso, a análise de VOC usando a tecnologia de e-nariz foi encontrado para ter sensibilidade e especificidade de 70% para o diagnóstico de cancro da bexiga de controles saudáveis, caindo para 60% e 67%, respectivamente, ao testar com controles de urina de pacientes com doenças urológicas não malignas [ ,,,0],15]. Neste relatório, nós descrevemos os dados de um estudo-piloto que mostra o potencial para um romance, in-house dispositivo sensor de VOC fabricado para diagnosticar com precisão o câncer de bexiga.

Métodos

recrutamento de pacientes

Um total de 98 pacientes do sexo masculino, com idades entre 27-91 anos, apresentando a clínicas de urologia em Bristol foram recrutados após a obtenção do consentimento informado. Todos haviam sido submetidos a uma avaliação clínica para os seus sintomas. Demografia para os grupos de pacientes estudados são apresentados na Tabela 1; havia 3 controles por paciente com câncer. Cada paciente fornecida uma amostra de urina na manhã antes da sua análise ou cistoscopia. As amostras foram classificadas quando a avaliação clínica foi concluída. Quando o câncer de bexiga (n = 24) foi encontrado, grau e estágio do câncer foram registrados (Tabela 2); a maioria foi bem diferenciado ou grau intermediário (G

1, G

2) e numa fase precoce (T

a) confinado ao revestimento da bexiga. Houve 74 controles, os pacientes que foram submetidos a investigação por sintomas de obstrução do fluxo da bexiga e ou hematúria; seus sintomas e co-morbidades relevantes foram: 31 tinha levantado PSA sem malignidade, 24 tinham hipertensão, 19 tiveram hematúria visível, 15 tiveram sintomas do fluxo da bexiga, diabetes 7, 4 hematúria não-visível, 2 tiveram cálculos do trato renal e 1 tinha sofrido renal transplante de cirurgia.

Diagnóstico

No. dos pacientes

gama Idade em anos (mediana)

Tabagismo

bexiga cancer2427 – 91 (média de 71) 7 fumantes; 17 não-fumantes (9 ex-fumantes) controle (não-câncer) 7429-86 (média de 64) 15 fumantes; 59 não-fumantes (17 ex-fumantes) Tabela 1.

CSV Baixar estágio CSV tumor

Tumor (TNM)

Grade

T

aN

0M

x

T

1N

0M

x

T

2N

0M

x

G

16NilNilG

2101NilG

3151Table 2.

Os tumores foram classificados de acordo com as orientações da OMS de 1973. G

1: bem diferenciado (semelhante às células normais encontradas na bexiga – câncer de crescimento lento) G

2: nível intermediário de diferenciação (mistura de G

1 G

3) G

3: pouco diferenciado (parece muito diferente a partir de células da bexiga normais – mais agressivo). O estadiamento do tumor é determinado de acordo com o critério de TNM (tumor, nó, metástase). T

a: o câncer é apenas na camada mais interna do revestimento da bexiga. T

1: o câncer começou a crescer dentro do tecido conjuntivo sob o revestimento da bexiga. T

2: o tumor cresceu através do tecido conjuntivo no músculo. Todos os pacientes também são classificados N

0 (Nenhum envolvimento do nó de linfa regional) M

x (status metástase não foi avaliada). CSV Baixar CSV

A aprovação ética para o estudo foi obtido a partir Comitê de Ética em Pesquisa Wiltshire; cada participante revisada uma ficha de informação e deram consentimento por escrito.

Armazenamento das amostras

Alíquotas de

urina fresca (0,75 ml) foram transferidos para, frascos de headspace de vidro com tampo de septo ( Sigma Aldrich, Dorset, Reino Unido) e foram congeladas a -20

oC até à análise. Em um estudo anterior verificou-se que o congelamento não teve nenhum efeito detectável sobre a composição volátil das amostras [16].

Headspace Análise

Cada amostra de urina foi descongelado por imersão do frasco em banho-maria a 60

oC por 30 segundos. Posteriormente, cada amostra foi tratada com um volume igual (0,75 ml) de hidróxido de sódio (1M; Fisher Scientific, Leicestershire, Reino Unido) e a mistura equilibrada a 60

oC num banho de água durante 50 minutos antes da extracção de dois centímetros

3 de ar headspace. Headspace ar foi extraído utilizando uma seringa estanque de gás de Hamilton (10 ml, Fisher Scientific, Leicestershire, Reino Unido) e foram então imediatamente injectados para dentro da entrada de um cromatógrafo de gás acoplado a um sistema de detecção do sensor.

O VOCs de amostras de urina foram analisadas usando um sistema de sensor in-house fabricado. O dispositivo composto por um forno de cromatografia gasosa convencional (Clarus® 500, Perkin Elmer) equipado com uma coluna capilar disponível comercialmente (longo SPB

TM-1 coluna capilar ENXOFRE 30 metros com um diâmetro interno de 0,32 mm e uma espessura de película de 4 mm de (Sigma Aldrich, Dorset, Reino Unido)) que foi conjugado a um sensor de óxido de metal aquecido (450

oC) usado como o detector. O sensor de óxido de metal de um composto de óxido de estanho, óxido de zinco mistura (50: 50% em peso). A preparação e caracterização do sensor tem sido relatada noutro local [17]. O injector de GC foi aquecida a uma temperatura pré-estabelecida de 150

oC e foi equipado com um forro de quartzo de 1 mm. O ar comprimido (BOC, Guilford, Reino Unido) foi utilizado como gás portador a uma pressão de 35 psi e foi passado através de um purificador de ar (300 mL Supelcarb

TM hidrocarboneto armadilha, Sigma-Aldrich, Dorset, Reino Unido). O programa de temperatura GC utilizado foi o seguinte: temperatura do forno GC inicial realizada em 30

oC durante 6 minutos, depois aumentada a uma taxa de 5

oC /min a 100

oC com uma espera 22 minutos, dando um tempo de execução total de 42 minutos.

O sistema de sensor de GC foi calibrado diariamente usando um padrão de gás certificada (1% de tolerância) de etanol 50 ppm no ar misturado (air Products Plc, gases especializadas, Crewe CW1 6AP) .

Depois de gás do espaço interior (2 centímetros

3) foi injectado no dispositivo os compostos voláteis foram separados de acordo com as suas propriedades químicas e eluída a partir da coluna em momentos específicos. Os voláteis eluídas a partir da coluna e impingidas ao sensor. Os compostos voláteis adsorvidos e feito reagir na superfície de óxido metálico aquecido do sensor produzindo simultaneamente uma mudança reversível na resistência eléctrica. A alteração da resistência eléctrica contra o perfil de tempo para o sensor produzido um cromatograma de amostra específica. Estes cromatogramas tempo de resistência foram interpretados estatisticamente com base em sua participação no grupo

A análise estatística

A resistência foi amostrado em intervalos de 0,5 segundos para 42 minutos (t = 1, 2, …., 5040. ). O utilitário de características altamente específicas dos perfis, as baixas frequências da ordem dos perfis, e funcionalidades mais amplas no perfil dos dados no desenvolvimento de uma boa classificador foi investigada. Como não há ouro abordagem padrão para este tipo de dados, foram investigados dois métodos independentes de análise estatística.

Métodos 1 e 2 foram baseados em padronização de cada perfil de resistência, para que cada um tinha um valor médio de 0 e um desvio padrão de 1 [15]. Esta transformação assegura que cada perfil dos doadores, está na mesma escala que permite uma comparação equitativa entre grupos de doenças, invariantes de efeitos de escala e de localização, preservando os mínimos e máximos relativa dentro de cada perfil. validação estatística dos modelos foi realizada por meio de validação cruzada leave-one-out, que fornece uma indicação do modelo de robustez e desempenho preditivo em amostras invisíveis frescos.

Método 1.

Isto foi baseado em uma entre-grupos comparação dos perfis de resistência normalizados, utilizando de dois grupos de análise discriminante linear implementar o algoritmo de seleção passo a passo para a frente para garantir a) o número de preditores no modelo não exceda o menor tamanho de grupo e b) a inclusão de uma variável de previsão faz não resultar em problemas de multi-colinearidade. A robustez dentro de amostra das propriedades de previsão do modelo derivado foi avaliada por meio de validação cruzada leave-one-out. Esta estratégia de modelagem foi concebido para investigar se uma descrição parcimoniosa simples de separação entre grupos-existia com base em diferenças muito específicas nos perfis entre os grupos.

método 2.

mínimos quadrados análise discriminante parcial (PLS -DA) foi usado para construir um classificador dois grupos para a discriminação dos casos de câncer de bexiga dos controles. PLS-DA é uma técnica de classificação supervisionado estabelecida utilizada em análises sensormetric e é uma técnica de extracção de informação e de redução de dados concebido para maximamente separadas duas ou mais grupos e é particularmente adequado para os dados dimensionais e multi-colineares elevados. Esta abordagem é considerada como sendo melhor do que as abordagens alternativas que utilizam análise de componentes principais sobre uma ampla gama de problemas de classificação [18]. Neste contexto, PLS-DA foi considerado a partir de um aspecto prova de conceito isto é pode um pequeno número de factores latentes extraídos a partir dos dados de todo o conjunto discriminação entre casos e controlos. Adotamos um procedimento de extracção utilizando até dez fatores latentes e usou uma classificação leave-one-out para avaliar dentro a precisão da classificação amostra

Resultados

saídas de sensores foram comparados nos dois grupos.; pacientes com câncer de bexiga (24) e pacientes sem câncer (74). Duas abordagens estatísticas independentes foram levados para determinar se havia diferenças na saída do sensor. Para cada método, os pacientes com cancro foram comparados com aqueles sem; o tamanho da amostra foi pequeno demais para ser capaz de comparar os padrões com grau ou estágio (Tabela 1).

A Figura 1 mostra cromatogramas típicos de resistência normalizada versus tempo para dois controles e dois pacientes com câncer de bexiga. Os cromatogramas das duas amostras de pacientes de cancro da bexiga são muito semelhantes como são aqueles das duas amostras de controlo. No entanto, é evidente que as amostras de controlo diferentes das amostras de cancro da bexiga. A diferença mais óbvia é um pico a cerca de 3200 (meio segundo), que está presente em ambas as amostras de cancro da bexiga, mas ausente de ambos os controles. A análise dos cromatogramas mostraram que 20/24 amostras de cancro da bexiga teve um pico mensurável nesta região. Nas amostras de controlo, os picos na região dos espectros eram predominantemente ausente. Para realçar este ponto, a Figura 2 mostra sobrepostos cromatogramas em média para cada grupo, mostrando claramente o recurso a 3200 segundos meio no grupo de cancro da bexiga, que está ausente do grupo de controle.

Figura 3 mostra a estabilidade do tempo de retenção do sistema de três picos comuns que abrangem o intervalo de tempo de retenção, onde a maioria dos picos detectados eluir. Os dados apresentados são para 24 amostras selecionadas de controlo (que se estendem por toda a duração sete meses do estudo) e as amostras de cancro da bexiga 24. Não existe uma tendência perceptível em termos de tração ao longo do tempo (amostras 1-24 controles e 25-48 câncer de bexiga são exibidos em ordem de data de execução). Há um dia para o outro flutuação nos tempos de retenção de medição de

circa

± 1%. Além disso, um padrão de etanol foi executada diariamente a fim de avaliar o tempo de retenção e a sensibilidade do sistema. O tempo de retenção de etanol durante o curso do estudo tinham uma média de 329,2 segundo meio (S.D. 3,97), em linha com os resultados da amostra de picos. A largura média dos picos é cerca de 100 segundos meio e pode ser de até 200 segundos meio de tempos de retenção mais elevados. Portanto, a variabilidade de aproximadamente ± 1% foi encontrado para ter um efeito negligenciável sobre a precisão da previsão dos modelos estatísticos (ver secção Statistical Analysis Método 1 abaixo).

Não é um dia mínimo para dia flutuação

circa

± 1%.

a sensibilidade média de etanol ao longo de um período de dois meses foi de 98,5% (SD 10.6) (R

0-R

g /R

0 × 100, em que R

0 é a resistência de linha de base e R

g é a resistência na presença de etanol). Embora a sensibilidade do sensor foi mantida a um nível razoavelmente constante a resistência de linha de base foi sujeito a deriva. Para contrariar este efeito e para ajudar a comparação visual e estatística dos resultados da escala de resistência foi padronizado utilizando a metodologia descrita acima.

Estatística Método de Análise 1