Abstract

As células tumorais em ascite são uma importante fonte de recorrência da doença em pacientes com câncer de ovário. Numa tentativa de identificar e perfil da população de células de ascites obtidos a partir de pacientes de cancro do ovário, um novo método foi desenvolvido para aderente separada (AD) e células (NAD) não aderentes em cultura. Vinte e cinco pacientes foram recrutados para este estudo; 11 quimioterapia pela primeira vez (CN) e 14 resistente à quimioterapia (CR). células AD de ambos os pacientes CN e CR exibiu morfologia mesenquimais com um perfil de antigénio das células-tronco mesenquimais e fibroblastos. Por outro lado, as células NAD tinha uma morfologia epitelial com a expressão aumentada do antigénio CA-125 (CA125), a molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM) e citoqueratina 7. células NAD desenvolvido tumores infiltrantes e ascite dentro de 12-14 semanas após a injecção intraperitoneal (ip) em nu ratinhos, enquanto que as células permaneceram AD não tumorigénico de até 20 semanas. posterior comparação de marcadores seletivos epiteliais, células mesenquimais e cancro da haste (CSC) entre AD e NAD populações de pacientes CN e CR demonstrou uma tendência reforçada na expressão do mRNA da caderina-E, EpCAM, STAT3 e Oct4 na população NAD de pacientes CR. Uma tendência semelhante da expressão de ARNm aumentada de CD44, MMP9 e Oct4 foi observada na população de pacientes AD CR. Assim, usando um método de purificação romance, demonstramos pela primeira vez que uma separação distinta de células de ascite em populações não tumorigénicas tumorigénicas e mesenquimais epiteliais. Também demonstramos que as células de ascites de pacientes CR são predominantemente epitelial e mostram uma tendência para o aumento da expressão de mRNA de genes associados com CSCs, em comparação com as células isoladas a partir de ascites de pacientes NC. À medida que as células tumorais nas ascite de pacientes com câncer ovariano desempenhar um papel dominante na recorrência da doença, uma profunda compreensão da biologia do microambiente ascite de pacientes CR e NC é essencial para intervenções terapêuticas eficazes

Citation:. Latifi Um, Luwor RB, Bilandzic H, Nazaretian S, Stenvers K, Pyman J, et al. (2012) Isolamento e Caracterização de células tumorais de ascite de ovário pacientes com câncer: Molecular Fenótipo de resistente à quimioterapia ovarianos tumores. PLoS ONE 7 (10): e46858. doi: 10.1371 /journal.pone.0046858

editor: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de julho de 2012; Aceito: 10 de setembro de 2012; Publicação: 08 de outubro de 2012

Direitos de autor: © Latifi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este foi apoiado pela Fundação da Mulher Câncer, Nacional de Saúde e Pesquisa médica do Conselho da Austrália (JKF, RegKey # 441101), a National Breast Cancer Foundation (EWT; cancro da mama empatia Rede, Austrália) e do Programa de Infra-estrutura de Apoio Operacional do Governo de Victoria (Austrália). Os financiadores não tiveram nenhum papel na desugn estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem

Introdução

Em 2009, a Associação americana de câncer Research relatou câncer de ovário como a malignidade ginecológica com o rácio mais elevado caso a mortalidade [1]. resultados Esta alta taxa de mortalidade do diagnóstico em um estágio avançado quando o câncer se espalhou para dentro da cavidade peritoneal e metástase para órgãos vitais. metástase do cancro do ovário ocorre quer directamente a partir dos cistos de inclusão corticais dos ovários ou a partir da extremidade da fímbria da trompa de Falópio [2], e espalha-se por extensão directa para órgãos adjacentes (por exemplo, órgãos extraovarian pélvicos, cólon, bexiga, fígado, etc.) , ou através da ligação de células de cancro do ovário esfoliadas que sobrevivem como agregados celulares ou esferóides. Os esferóides são transportadas pelo fluido do tumor peritoneal (ascite) para circundante órgãos na cavidade peritoneal. semeadura extensa destes esferóides sobre o útero, cólon sigmóide e omento é frequentemente encontrado em estágio avançado e doença recorrente [3].

estratégias atuais de tratamento para pacientes com câncer de ovário em estágio avançado resultar em remissão inicial em até 80% dos pacientes [4]. No entanto, após um período de remissão curto (normalmente 6-22 meses) recorrência ocorre em quase todos os pacientes [4]. Isto é principalmente devido à capacidade das células tumorais para evadir a citotoxicidade associada a quimioterapia por meio de quimioresistência adquirida. Recentemente, quimiorresistência também tem sido associada com a aquisição de epitelial para mesenquimal (EMT) em células cancerosas [5] – [6]. Classicamente, EMT permite que as células epiteliais estacionários para se tornar móveis e invasiva, a fim de se espalhar e recolonizar dentro dos tecidos circundantes [7]. Estas características de EMT ter sido demonstrado que se correlacionam com um fenótipo CSC-like [8] – [9], corroborado recentemente em casos clínicos pelo mesenquimais e “tumor inicial” fenótipos das células tumorais residuais em pacientes com cancro da mama sobreviventes terapia convencional [ ,,,0],10]. O fenótipo da CSC foi mostrado para ser regulada de forma dinâmica pelo microambiente do tumor [11], o elemento-chave necessário para micro e colonização macro-metastático envolve não só EMT mas também mesenquimais para a transição epitelial (MET) [12] – [13 ]. O continuum de EMT e MET tem sido descrito como plasticidade epitelial mesenquimal (EMP) [11]. Essa colonização metastática define a capacidade das células tumorais disseminadas EMP transformadas se auto-renovar e diferenciar, as que definem as características celulares de CSCs [14].

Embora a presença de ascite tem sido associada com mau prognóstico, a origem e fenótipo de células cancerosas em ascite, e sua associação com chemoresistance e recorrência é mal compreendida. inspecção microscópica da ascite foi previamente revelado uma imagem complexa heterogéneo consistindo de células individuais e esferóides [15]. As células não-cancerosas dentro dos ascite incluem células inflamatórias, fibroblastos associados ao cancro, as células mielóides imaturas e células mesoteliais activados, os quais influenciam o comportamento das células do tumor e a resposta à quimioterapia [16]. Também a contribuir para a heterogeneidade da ascite é uma população de CSCs que pode resistir a quimioterapia e dar origem a uma hierarquia de proliferação de células tumorais com a diferenciação progressiva potencial [17], [18]. Estes CSCs, quando purificado por triagem e xenoenxertados em ratinhos nus, têm sido mostrados para gerar uma carga de tumor significativamente maior em comparação com as células tumorais, não triados, [19], sugerindo o maior potencial tumorigénico das CSCs.

(A) NAD esferóides e (B) células AD foram semeadas em placas baixas de fixação imediatamente após a coleta. características morfológicas das células AD (C) esferóide NAD e (D) em plástico de cultura de tecidos após 24 h seguintes semeadura. As imagens foram analisadas por microscopia de contraste de fase. Ampliação foi de 100 ×, barra de escala = 50 mm. As imagens são representativas de (N = 25) amostras. (E) [

3H] -timidina nas células DA e em células dispersas de esferóides foi realizada como descrito em Métodos e Materiais. O gráfico é uma representação de uma amostra de ascite realizadas em triplicado. (F) Efeito de cisplatina sobre o {[3H

] -timidina} proliferação de NAD e as células DA obtido a partir de ascites de doentes com cancro do ovário. O gráfico é uma representação de três experiências independentes, realizados em três amostras de NAD e AD independentes em triplicado. Significativamente diferente entre AD contra células NAD, ** p . 0,01

Nossa hipótese é que a recorrência em pacientes com câncer de ovário é largamente ditada pelo grau em que o tumor e células estromais associadas na cavidade peritoneal sobreviver quimioterapia, e que um estudo comparativo dos ARNm isolados a partir de células de ascites de doentes com cancro CN contra ovário CR pode proporcionar uma ligação em falta importante para a compreensão da doença recorrente. O objetivo geral deste estudo foi investigar o perfil de mRNA diferencial de células de ascite de pacientes CN e CR, a fim de identificar os produtos de genes que podem contribuir para a sobrevivência e disseminação de células cancerosas residuais após a quimioterapia. Nós também destinado a compreender a propensão metástase das células tumorais nas ascites de doentes com cancro do ovário. Para alcançar este objectivo, foi desenvolvido um novo método de purificação para isolar populações distintas de células a partir de ascites de doentes com cancro do ovário. Usando esta técnica simples células ascites foram separadas em duas populações distintas de células com fenótipos epiteliais e mesenquimais bem definidas, respectivamente. As células isoladas a partir de ascites CR tinha um fenótipo mais epiteliais e mostrou uma tendência no sentido de uma maior expressão dos genes associados com a CSC, quando comparado com as células isoladas a partir de ascites de pacientes NC. Estes resultados sugerem que o microambiente do tumor ascite pode ser diferente em pacientes antes e após a quimioterapia, e pode ainda ter um papel na recaída de pacientes de cancro do ovário pós-quimioterapia.

células purificado a partir de ascites de CN (n = 11 ) e CR (n = 14) pacientes de cancro do ovário foram incubadas com IgG de controlo ou anticorpos primários relevantes contra os respectivos antigénios, seguido de anticorpo conjugado ficoeritrina secundário. Os resultados são representativos de (n = 25 amostras independentes). O histograma preenchido em cada figura representa IgG controle, linhas pretas indicam a expressão da proteína em células respectivos.

Materiais e Métodos

Anticorpos e reagentes

anticorpos monoclonais e policlonais contra CA125, proteína de superfície de fibroblastos (FSP) e CD44 foram obtidos a partir de Merck Millipore (MA, EUA). Os anticorpos monoclonais contra a citoqueratina 7 (7 cit) e N-caderina foram obtidos a partir de Zymed Laboratories (San Francisco, EUA). Os anticorpos policlonais contra a E-caderina, vimentina e EpCAM foram obtidos a partir de Cell Signaling Tecnologia (Beverly, MA, EUA). Os anticorpos policlonais contra CD73, CD105, CD90, e CD34 foram obtidos a partir de safira Bioscience (NSW, Austrália).

células purificadas NAD e Ad foram avaliadas por imunof luorescência utilizando o anticorpo monoclonal de ratinho (verde) como descrito nos Métodos e materiais. coloração de células foi visualizada usando o anticorpo secundário fluorescente marcado com Alexa 488 (verde), e os núcleos foram detectados por DAPI (azul) coloração. As imagens são representativos de três amostras independentes. Ampliação foi de 200 ×; barra de escala = 50 uM.

estudo imunofluorescência foi realizada em células NAD e ad purificado como descrito na Figura 3. As imagens são representativos de três amostras independentes. Ampliação foi de 200 ×; barra de escala = 50 mm.

Os pacientes

declaração de ética humana.

A ascite foi coletada de pacientes com diagnóstico de estágio avançado de carcinoma de ovário seroso, depois de obter informado por escrito consentimento ao abrigo de protocolos aprovados pela Research and Ethics Comité Humano (HREC # 09/09) do Hospital das mulheres reais, Melbourne, Austrália.

o diagnóstico histopatológico, incluindo os tipos de tumor e estágio foram determinados por patologistas independentes como pessoal parte do diagnóstico clínico (Tabela 1). Ascite foi obtido de pacientes durante a cirurgia com carcinoma primário (pacientes CN). Em outros casos, a ascite foi recolhida a partir de um grupo de pacientes no momento da recorrência (pacientes CR). Esses pacientes tinham desenvolvido a doença recorrente no prazo de 6-20 meses de primeira linha de quimioterapia. Os pacientes neste grupo não foram todos tratados da mesma forma que tinham recebido previamente combinações de quimioterapia consistindo em paclitaxel, carboplatina e outros fármacos tais como doxorrubicina, gemcitabina, docetaxel, topotecano ciclofosfamida e depois de cada episódio recorrente (Tabela 1). As amostras foram recolhidas a partir de doentes durante o regime de tratamento tal como descrito na Tabela 1.

qPCR foi realizado em populações NAD e ad purificada como descrito nos Métodos e Materiais. Os rendimentos foram convertidos para fentogramas com base na curva padrão para cada produto de PCR, e os níveis de mRNA resultantes foram normalizados para o nível de mRNA 18S por amostra. Os dados foram calculados a partir dos resultados de oito amostras independentes avaliadas em triplicado. Significativamente diferente no AD contra células NAD * (p 0,05) e ** (p 0,01).

Preparação de células de ascite de ovário pacientes com câncer

O volume de ascite variar entre pacientes. pacientes NC tiveram menor volume de ascite (100 ml-2L), em comparação com pacientes CR (100 ml-17 L). No entanto, a fim de normalizar o protocolo experimental apenas 500 ml de ascite foi usado para recolher as células. Contaminando as células vermelhas do sangue no sedimento de células de ascite foram removidos por lise hipotónica em MilliQ estéril H

2O. A maior parte das células de ascites foram semeadas em placas de baixo de fixação (Corning Incorporated, NY) em MCDB: meio DMEM (50:50) suplementado com soro de crescimento bovino fetal (10%), glutamina (2 mM) e penicilina /estreptomicina (2 mM ) (Life Technologies, CA, EUA). As células foram mantidas a 37 ° C na presença de 5% de CO

2. Sob estas condições, as células NAD flutuou como esferóides no meio, enquanto as células DA ligado a placas de fixação de baixo. Depois de 2-3 dias, flutuantes esferóides NAD (dispersas por pipetagem) e células AD foram selecionados para CA125, EpCAM, cit 7 e FSP por citometria de fluxo. as células DA foram mantidas em frascos de cultura de tecidos de plástico, enquanto esferóides NAD foram mantidas em placas de fixação de baixo. As células foram passadas semanalmente e experimentos foram realizados dentro de 1-2 passagens.

A imagem de contraste de fase de microscópio de células NAD aderiram ao plástico antes de preparar a suspensão de células para i.p. (A) injecção; (B) coloração H e E de agarose incorporado amostra do paciente antes da injeção; imagem (C) de tumor sólido obtido a partir de um rato catorze semanas após a injecção i.p. injecção de células de NAD (5 × 10

6); (D) coloração H e E de células NAD rato ascite incorporados em agarose; comparação de citometria de (E) fluxo da expressão do CA 125, CD44 e EpCAM entre o paciente e as células de ascites de ratinho. Os resultados são representativos de duas amostras independentes. O histograma preenchidos em cada figura representa IgG de controlo, linhas pretas indicam a expressão de proteínas em células humanas, as linhas a tracejado indicam a expressão da proteína em células de ascites de ratinho.

contagens de células e Ensaio de Proliferação

células dA e NAD esferóides recolhido a partir de 1 ml de ascite foram deixados aderir em placas de cultura de tecidos, durante 24 h, após o que, as células foram tripsinizadas e contadas pelo método de exclusão de azul de tripano. O número de células DA e as células dentro dos esferóides NAD foram calculadas e a percentagem de células viáveis ​​nas populações AD e esferóides NAD foi avaliado por cálculo do número total de células presentes em ambos os AD e NAD populações de 1 ml de ascite de cada paciente.

imagens histológicas de (a) de tumor, (B) fígado, (C) e tracto GI (D) pâncreas de um rato injectado IP com células NAD (5 × 10

6). As setas no tumor (A) indicam bolsos de células tumorais rodeados por tecido conjuntivo. (B-D) setas indicam células tumorais que invadem os respectivos órgãos. coloração com H e E de (E) e de ovário de rim (F) a partir de um ratinho injectado com células de NAD (5 × 10

6). As setas indicam células tumorais circundantes os órgãos sem invasão. Ampliação foi de 200 × para todos, com exceção dos ovários que teve aumento de 100 ×, barra de escala = 50 mm.

3 [H] ensaio -timidina foi realizada como descrito anteriormente [20] . Resumidamente, 1 × 10

5 células NAD ou AD foram semeadas em triplicado em placas de 24 poços. Após 2, 4 e 6 dias, 0,5 ^ Ci de [

3H] timidina a cada poço, e as células foram incubadas a 37 ° C durante um adicional de 16 h. As células foram lavadas com PBS, colhidas e lisadas em 1% de Triton e a incorporação de [

3H] timidina foi medida por contagem de cintilação líquida (Hidex 300SL, LKB Instruments, Austrália).

distribuição percentagem de células totais em AD e o NAD populações de ascite de CN (n = 5) e CR (n = 5) pacientes foi determinado por ensaio de exclusão de azul de tripano. Os resultados são a média ± SEM de cinco amostras independentes avaliadas em triplicado. Significativamente diferentes em CR contra amostras NC, ** (p 0,01).

Para a determinação da concentração de inibidor do crescimento (GI50), 1 × 10

5 NAD ou AD células foram autorizados a aderir em placas de 24 poços durante 24 h em triplicado. Ambas as células NAD e Ad foram tratadas com diferentes concentrações de cisplatina (0,5 ug /ml-10 ug /ml) durante 48 h antes da adição de 0,5 uCi de [

3H] timidina durante 16 h. O nível de [

3H] timidina foi determinada como descrito acima.

qPCR foi realizado como descrito nos Métodos e Materiais em NAD e AD populações puras de células isoladas a partir de ascites de CN (N = 4) e CR (n = 4) As amostras de ascites. Os resultados são expressos como descrito na Figura 5 para quatro amostras independentes avaliadas em triplicado.

qPCR foi realizado como descrito na Figura 9, sobre o NAD e AD populações puras de células isoladas a partir de amostras de ascites CN e CR. Os resultados são expressos como descrito na Figura 9. Significativamente diferente em CR contra amostras NC, * (P 0,05).

Análise por imunofluorescência

Análise por imunofluorescência foi realizada como descrito anteriormente [21 ]. As imagens foram capturadas usando o laser Leica TCS SP2, e visto na estação de trabalho utilizando o software HP SP2 Leica Microsystems TCS.

qPCR foi realizado em células NAD e AD isolado como descrito na Figura 9. Os resultados são expressos como descrito na Figura 9. significativamente diferentes em CR contra amostras NC, * (p 0,05).

Os antígenos foram classificados como de alta expressão (

+++), expressão moderada (

++), baixa expressão (

+), e sem expressão (

-.)

Análise de citometria de fluxo

A citometria de fluxo método foi descrito anteriormente [21]. Todos os dados foram analisados ​​utilizando o software celular Quest (Becton-Dickinson, Bedford, MA, EUA). Os resultados são expressos como intensidade média de fluorescência (MIF).

Extração de RNA e quantitativa em tempo real (Q-PCR)

extracções de ARN, a síntese de ADNc e determinação quantitativa de níveis de mARN de vários genes eram realizada como descrito anteriormente [21]. Sentido e anti-iniciadores foram desenhados contra sequências humanas publicadas para E-caderina, N-caderina, Vimentin, Oct4, MMP2, MMP9, EpCAM e CD44. extracção em gel dos produtos de PCR foi realizada utilizando o kit de extracção de gel Qiaex II agarose (Qiagen Austrália), de acordo com o protocolo do fabricante e quantificada utilizando o ND-1000 Nanodrop espectrofotómetro (NanoDrop Technologies Inc de Wilmington, DE, EUA). As sequências e os produtos foram verificados como descrito anteriormente [22]. pares de primers usados ​​incluem 5-3 ‘: E caderina (Entrez Gene ID 999, símbolo aprovado CDH1) forward-GGCACAGATGGTGTGATTACAG; GTCCCAGGCGTAGACCAAGAAA reversa; N-caderina (Entrez Gene ID 1000, o símbolo aprovado CADH2) prospectivas AAACAGCAAGCACGGGTTA; reversa CTTAGGATTGGGGGCAAAAT; vimentina (Entrez Gene ID 7431, símbolo aprovado VIM) CCTACAGGAAGCTGCTGGAA prospectivas; GGTCATCGTGATGCTGAGAA reversa; MMP2 (Gene Entrez ID 4313, símbolo aprovado MMP2) AAGGGGATCCAGGAGCTCTA prospectivas; GCTTGTCACGTGGTGTCACT reversa; MMP9 (Entrez Gene ID 4318, símbolo aprovado MMP9) TTGACAGCGACAAGAAGTGG prospectivas; reversa GCCATTCAC GTCGTCCTTAT; EpCAM (Entrez Gene ID 4072, símbolo aprovado EpCAM) prospectivas CGTCAATGCCAGTGTACTTCAGTT; reversa TCCAGTAGGTTCTCACTCGCTCAG; CD44 (Entrez Gene ID 960, símbolo aprovado CD44) prospectivas CCAATGCCTTTGATGGACCA; reversa TGTGAGTGTCCATCTGATTC; Entrez Gene Oct4 ID 5460, símbolo aprovado POU5F1): prospectivas CTCCTGGAGGGCCAGGAATC; CCACATCGGCCTGTGTATAT reversa; 18S (Entrez Gene ID 100008588, símbolo aprovado RN18S1) forward-GTAACCCGTTGAACCCCATT; CCATCCAATCGGTAGTAGCG reversa. A expressão do mRNA da STAT3 foi determinada utilizando sonda STAT3 (Applied Biosystems, Victoria, Austrália). PCR em tempo real foi realizado usando a mistura de SYBR Applied Biosystems ABI (Victoria, Austrália), utilizando Applied Biosystems ABI 7900 HT rápida máquina em tempo real. Os rendimentos foram convertidos a FG (fentogramas) com base na curva padrão para cada produto e os níveis de mRNA resultantes foram normalizados para o nível de mRNA 18S por amostra. Cada experiência foi realizada, independentemente, um mínimo de três vezes.

doentes com cancro do ovário aos Mais diagnóstico (etapa IIIc /IV) presente com ascite (NC), que consiste de células do estroma de tipo fibroblasto e muito poucas células tumorais. A maioria destes pacientes (~ 80%) após cirurgia e a primeira linha de retorno com a quimioterapia do cancro recorrente associada com ascite (CR). Durante o curso do tratamento de quimioterapia e recidivas subsequentes, a percentagem de células estromais na ascite é diminuída gradualmente e o paciente com cancro recorrente apresenta com ascite que consiste principalmente de CA125

+++ /EpCAM

+++ /STAT3

+++ resistente à quimioterapia, as células tumorais NAD epiteliais. Estes CA125

+++ /EpCAM

+++ /STAT3

+++ células tumorais ricos são a eventual fonte de aderências extraovarian. Estas aderências são a causa última da mortalidade dos pacientes.

Os estudos em animais

declaração

ética animal.

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Utilização de animais de laboratório do Nacional de Saúde e Pesquisa médica do Conselho da Austrália. O protocolo experimental foi aprovado pelo Ludwig /Departamento de Cirurgia, Hospital Royal Melbourne e da Universidade do Comitê de Ética Animal da Melbourne (Project-006/11), e foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Mulher Hospital Royal Melbourne, Austrália. ratos fêmeas Balb /c nu /nu (idade, 6-8 semanas) foram obtidos a partir do Centro de Recursos Animais, Western Australia. Os animais foram alojados em um ambiente padrão livre de patógenos com acesso a comida e água.

NAD e células AD foram isolados das ascite de três CR pacientes (Tabela 2). 5 × 10 i.p.

6 células por grupo foram injectados com uma agulha de calibre 26 em dez ratinhos (seis com NAD e quatro com células AD). Os ratos foram inspeccionados semanalmente e a progressão do tumor foi monitorizado com base na saúde geral e peso do corpo até um ponto final pré-determinado foi alcançado. critérios de ponto de extremidade incluído perda de peso corporal superior a 20% do peso corporal inicial, anorexia, padrões gerais de bem-estar diminuída como o movimento reduzida e letargia resultante da falta de interesse em atividades diárias. Os ratinhos foram sacrificados e os órgãos (tais como fígado, estômago, pulmão, tracto gastrointestinal, pâncreas, útero, músculo esquelético, cólon, rim, peritoneu, dos ovários e do baço), tumores sólidos e fluido ascítico foram recolhidas para uma análise mais aprofundada. desenvolvimento metastático foi documentado pelo patologista Hospital da Mulher reais de acordo com o exame histológico (H E coloração) dos órgãos. células do tumor ascitico a partir de ratinhos foram mantidos em placas de fixação e baixos foram embebidas em agarose a 3% (w /v) para a H coloração de E. caracterização subsequente de CA125, EpCAM e expressão de CD44 em células recolhidas a partir das ascites de ratos foi realizada como descrito acima

Análise Estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando GraphPad Prism (versão 5;. GraphPad Software Inc., San Diego, CA) e Microsoft Excel. Se todo o conjunto de amostras, os meios foram mostrados para ter uma variação de p 0,05 pelo teste F, em seguida, um teste t paramétrico foi conduzido para variâncias desiguais desemparelhados. Os dados foram consideradas significativamente diferentes se p . 0,05

Resultados

Morfologia de células coletadas de ascite de pacientes com câncer

células Ascite derivada de ambos CN (n = 11) e pacientes Cr (n = 14) foram avaliadas por microscopia de contraste de fase após a sementeira em placas de baixo de fixação durante 24 h. Foram observadas duas populações distintas de células: (i) os agregados multicelulares (esferóides) que flutuava como estruturas tridimensionais em meio de crescimento sem o acessório (NAD) (Figura 1A), e (ii) células individuais semelhantes a fibroblastos em forma de fuso que aderidas às placas de fixação de baixo (AD) (Figura 1 B).

uma avaliação morfológica da população NAD revelou numerosas três agrupamentos dimensionais de esferóides fracamente compactado com uma lúmen central (Figura 1A). Houve uma variação considerável na morfologia e tamanho dos esferóides de diferentes pacientes, bem como dentro dos ascite do mesmo paciente. Em alguns casos, os esferóides foram sob a forma de pequenas bolas com um aro exterior definido, enquanto outros exibida agregados soltos de grupos de células pequenas (Figura 1A). Após 24 h de cultura em plástico de cultura de tecido, a maioria dos esferóides em anexo e uma transformação clara a partir de uma estrutura tridimensional para achatada aglomerados celulares contendo várias camadas de células aderentes que crescem em cima uns dos outros foi observado (Figura 1C). A periferia dos esferóides exibiram células alongadas que se deslocam para fora dos esferóides, enquanto que as células para o centro eram mais arredondados na estrutura. À medida que as células se moveu para fora do núcleo central, o contacto célula-célula foi reduzida, o que resulta na desagregação dos esferóides (Figura 1C). Alternativamente, as células DA ligado ao plástico como células fusiformes alongadas e exibida uma morfologia do tipo fibroblastos (Figura 1D).

Crescimento de AD e esferoidal-células derivadas da NAD como culturas monocamada

o padrão de crescimento de ambas as células dA e NAD foi determinado em culturas em monocamada aderentes por ensaio de absorção de

3 [H] -timidina. esferóides NAD foram dispersas por pipetagem e o padrão de crescimento foi comparado com as células DA. células AD tinha quase 2 vezes maior resposta de crescimento em comparação com células dispersas da população NAD (Figura 1E).

A cisplatina sensibilidade do NAD e AD Cells

As células de esferóides NAD foram dispersas por pipetagem e o valor GI50 em resposta cisplatina foi comparada para as células dA isoladas a partir de ascites de doentes com cancro do ovário (n = 3) (Figura 1F). As células dentro dos esferóides NAD eram quase quatro vezes mais resistentes à cisplatina (n = 3, GI50 = 8,8 ± 0,72 ug /ml) em comparação com as células DA (n = 3, GI50 = 2,4 ± 0,28 ug /mL) (Figura 1 M ).

avaliação de marcadores da superfície celular por citometria de fluxo

expressão na superfície celular do FSP, EpCAM, CA125, CD44 e cyt 7 foi determinada em células dA e NAD (disperso por tripsinização) por fluxo citometria. Um elevado nível de expressão de EpCAM, CA125 e citocromo 7 foi observada nas células dispersas a partir da população de NAD, enquanto foi detectada baixa /sem expressão do FSP, e um nível relativamente baixo de expressão de CD44 foi evidente em esferóides NAD (Figura 2 ). Por outro lado, as células DA foram positivas para CD44 e FSP, sem expressão baixo /detectável de CA125 e citoqueratina 7 (Figura 2). Baixos níveis de expressão de EpCAM foram detectados nas células DA. Este padrão de expressão do marcador de superfície celular foi consistente em todas as amostras de ascites (n = 25). Não foi observada nenhuma expressão de CD34, CD31 e CD45 em qualquer populações NAD ou AD por citometria de fluxo.

Análise de CA125, EpCAM, CD44 e CTM a marcadores de células por imunofluorescência

A seguir, analisou o marcadores de células tronco expressão e localização de CA125, EpCAM, CD44 e mesenquimais em amostras de ascite por imunofluorescência. Consistente com a citometria de fluxo resultados, CA125 foi não detectado na população de AD, ao passo que as células dentro dos esferóides NAD demonstrou expressão difusa forte tridimensional de CA125 que era proeminente nas membranas periféricas de algumas células (Figura 3). Muito poucas células EpCAM-positivos estavam presentes na população de AD (Figura 3). Em contraste, a coloração da membrana periférica densa para EpCAM foi observada em quase todos os esferóides NAD. Difuso coloração citoplasmática estava presente em algumas esferóides, mas a coloração era muito mais forte em células que revestem a periferia dos esferóides (Figura 3). Por outro lado, a expressão de CD44 foi confinada à periferia dos esferóides de NAD e foi detectado em células que foram em movimento de esferóides. Um forte coloração de CD44 foi evidente sobre a membrana de quase todas as células DA (Figura 3).

Como fibroblastos do estroma e as células estaminais mesenquimais (MSC) foram mostrados para partilhar propriedades comuns [23], avaliou-se o expressão de marcadores vulgarmente conhecidos MSC (CD90, CD73 e CD105) em ambos NAD e populações de amostras de ascites AD (Figura 4). coloração difusa espalhada de FSP foi evidente nas células DA (Figura 4). Algumas células FSP-positivas foram observadas em esferóides NAD, e estes eram as células que se deslocam para fora dos esferóides. forte expressão de CD105 e CD90 estava presente nas células DA. A expressão destas proteínas foi detectada por todo o citoplasma e na membrana plasmática das células. fraca expressão de CD73 estava presente nas células DA. Por outro lado, foi observada baixa /nenhuma expressão de CD90 e CD73 em esferóides NAD. No entanto, CD105 coloração era evidente em muito poucas células dispersas que se deslocam para fora dos esferóides (Figura 4).

Avaliação Quantitativa de seletivas Marcadores representante no mRNA Nível

Para avaliar ainda mais as diferenças quantitativas na a expressão de marcadores epiteliais e mesenquimais por o NAD e populações AD, compararam-se os níveis de alguns dos marcadores de expressão de ARNm por Q-PCR. As células dentro dos esferóides NAD demonstrado um nível de expressão significativamente mais elevada de E-caderina e EpCAM em comparação com as células DA (p 0,01) (Figura 5). Por outro lado, as células DA demonstraram um significativamente elevado nível de expressão de ARNm de vimentina e MMP9 em comparação com as células dentro dos esferóides NAD (P 0,01, P 0,05) (Figura 5). A expressão média de N-caderina, CD44 e MMP2 aparentemente mais elevada de 2,5, 7 e 15 vezes, respectivamente na população AD, mas não foi observada significância (p 0,2, p 0,06, p 0,17). A expressão de STAT3 e Oct4 foi significativamente maior em comparação com NAD população AD (p 0,05). (Figura 5)

Avaliação do potencial tumorigénico de NAD e AD Populações por in vivo Modelo rato

tumor de xenoenxerto de experiências foram realizadas para determinar o potencial tumorigénico de NAD e populações AD isolado a partir das ascites de três pacientes por CR IP inoculação de 5 × 10

6 NAD ou AD células por mouse. Cinco dos seis ratinhos injectados com células de NAD (como uma suspensão de células) (Figura 6A) desenvolvido ascite com tumores sólidos ( 0,5 cm

3) (n = 3) (Figura 6C) ou lesões pequenas (n = 2) no peritoneu. Observou-se um período de latência do tumor de doze a catorze semanas após o transplante. Tumores pesando 0,8 ± 0,2 g e ascite (~ 0,5 ml) foram observadas em todos os cinco ratinhos que desenvolveram tumores (Figura 6c). Em contraste, não se observaram tumores nos ratos (n = 4) injectado com o mesmo número de células AD até vinte semanas após a administração i.p.