Abstract

diagnósticos moleculares de cancros humanos podem aumentar a precisão no prognóstico, facilitar a selecção do regime terapêutico ideal , melhorar o resultado paciente, reduzir os custos de tratamento e desenvolvimento favor de abordagens personalizadas para o atendimento ao paciente. Além disso sensibilidade e especificidade são características fundamentais de qualquer método de diagnóstico. Nós desenvolvemos uma micromatriz altamente sensível para a detecção de KRAS comuns e mutações oncogénicas BRAF. No cancro colorectal, KRAS e BRAF mutações têm sido mostrados para identificar um grupo de pacientes que não respondem a terapias anti-EGFR; a identificação destas mutações é, portanto, extremamente importante clinicamente. Para verificar as características técnicas do sistema de microarray para a correta identificação do estado mutacional do KRAS nos dois códons hotspot 12 e 13 e do BRAF

mutação V600E no tumor colorretal, foram selecionadas 75 amostras previamente caracterizadas pelo convencional e CO- amplificação em mais baixas temperatura de desnaturação-PCR (FRIO-PCR) seguida de alta resolução de fusão e análise de sequenciação directa. Entre estas amostras, 60 foram coletadas durante a cirurgia e imediatamente mergulhado em RNAlater enquanto os 15 restantes foram tecidos embebidos em parafina (FFPE) fixado em formol e. O limite de detecção do método proposto foi diferente para as 7 mutações KRAS e testados para a mutação BRAF V600E. Em particular, o sistema de micro-arranjo tem sido capaz de detectar um mínimo de cerca de 0,01% de alelos mutados num fundo de ADN de tipo selvagem. A validação cego exibido concordância completa dos resultados. O excelente concordância dos resultados mostrou que o novo substrato microarray é altamente específico em atribuir o genótipo correto, sem qualquer estratégia de enriquecimento

Citation:. Galbiati S, Damin F, Pinzani P, Mancini I, Vinci S, Chiari M , et ai. (2013) A New Microarray Substrato para genotipagem ultra-sensível de KRAS e BRAF variantes genéticas no cancro colorectal. PLoS ONE 8 (3): e59939. doi: 10.1371 /journal.pone.0059939

editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de julho de 2012; Aceito: 21 de fevereiro de 2013; Publicação: 25 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Galbiati et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Definindo a assinatura molecular dos cancros humanos poderia ser central para o desenvolvimento de uma abordagem personalizado para atendimento ao paciente. Na verdade, a identificação de biomarcadores adequado pode aumentar a precisão no prognóstico, facilitar a selecção do regime terapêutico ideal, melhorar o resultado paciente e reduzir os custos de tratamento [1]. Assim, a estratificação dos pacientes individuais com base nas características moleculares e genéticos é a evolução esperada da oncologia clínica moderna.

agentes Recentemente terapêuticas visando variantes genéticas específicas e vias moleculares bem caracterizados foram desenvolvidos. Este é o caso do oncogene KRAS, que é parte da via de sinalização de várias moléculas diferentes. Ganho de função mutações missense são muitas vezes somaticamente adquirida em câncer colorretal, predominantemente em três pontos quentes representados por códons 12, 13 e 61. Infelizmente, a estes níveis o número de substituições é elevado, tornando a sua detecção mais complexo, com alelo específico técnicas. Constitutivamente, a activação de mutações nestes sítios de ponto de acesso pode determinar a resistência a terapias alvo EGFR que de outra forma deve melhorar significativamente a taxa de sobrevivência e a qualidade de vida dos pacientes [2], [3], [4], [5]. O potencial do KRAS códon 12/13 mutações marcadores moleculares como eficazes para a seleção da droga tem recebido atenção considerável levando a sua utilização no tratamento de rotina de pacientes com cancro colo-rectal [6]. A Autoridade Europeia para a saúde (https://www.emea.europa.eu/pdfs/human/press/pr/27923508en.pdf.), Bem como a Sociedade Americana de Oncologia Clínica [7] e do National Comprehensive Cancer Network (NCCN , https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/PDF/colon.pdf.) exigem KRAS análise mutacional sobre o cancro colorectal antes da terapia anti-EGFR.

Outra biomarcador promissor da resistência anti-EGFR é representado por BRAF

mutação V600E, que ocorre em cerca de 10% dos cancros colorrectais. BRAF é o efector a jusante de imediato KRAS na via de sinalização de Ras /Raf /MAPK e BRAF

V600E mutação activadora é mutuamente exclusivo para mutações KRAS [6]. Apesar dos dados actualmente limitada, e a falta de consenso completas, é provável que as mutações BRAF tem um papel na determinação da resposta ao tratamento de EGFR mAb anti-e está associada a um pior prognóstico, independentemente do tratamento [8], [9]. Além disso, pacientes com tumores que transportam BRAF mutante também pode se beneficiar de inibidores de BRAF selectivos, tais como PLX-4032 [10].

No cenário atual de estratégias de triagem, os métodos atuais de análise (convencional sequenciamento, pyrosequencing, etc .) são, caro demorado e falta de robustez. Outro problema emergente é ligado à sensibilidade real desses métodos que parecem detectar minoritários alelos mutados apenas quando presente em concentrações superiores a 10-20%. Em trabalhos anteriores [11], [12], que sublinhou a importância da sensibilidade na detecção de alelos mutados minoritários em amostras biológicas e confirmou a utilidade de COLD-PCR para o seu enriquecimento, particularmente em amostras com baixas percentagens de células tumorais. Em média, 15% dos pacientes inicialmente classificados como negativo para KRAS ou BRAF

variantes V600E foram encontrados positivo após FRIO-PCR [11], [12].

Microarrays representam uma ferramenta barata e precisa para paralelo genotipagem de marcadores múltiplos, adequados para análise de rotina no diagnóstico médico [13]. Aqui, nós relatório sobre o desenvolvimento de um microarray altamente sensível para a detecção de mutações KRAS e BRAF. O micro-arranjo é desenvolvida usando uma lâmina de silício cristalino revestido por um dióxido de silício termicamente cultivadas (SiO

2) camada e funcionalizado por adsorção de um copolímero de dimetilacrilamida (DMA), N-acryloyloxysucinimide (NAS) e meta-acryloy propil trimetoxi silano (MAPS), copoly (DMA-NAS-MAPS), originalmente desenvolvido para microarranjos de DNA de vidro [14]. A espinha dorsal do polímero consiste em DMA, um monómero que adsorve à superfície pela ligação de hidrogénio; NAS é o monômero reativo que reage covalentemente com bio-sondas, enquanto MAPS contribuir para filmar a estabilidade por condensação com silanóis superficiais. O procedimento de revestimento é simples e reprodutível, quando comparado com organo-silanização, um processo que requer condições altamente controlada e sofrem de uma fraca reprodutibilidade. Este polímero funcional tem sido amplamente aplicado no campo biosensor para a bio-funcionalização de nanobeads poliestireno [15], microcantilevers silício [16], polidimetilsiloxano [17], e de nitrocelulose [18] substratos.

A escolha do substrato de silício revestido por uma camada de SiO

2 de 100 nm de espessura leva a um forte intensificação da fluorescência na superfície resultante da interferência construtiva entre a óptica incidente e as luzes da radiação fluorescente reflectida. A condição de interferência construtiva na superfície do substrato é cumprida em vários tipos de lâminas de vidro revestidas com camadas de filmes dieléctricos ou metálicos [19]. No entanto, a estratégia envolvida na produção de tais complexos estruturas multicamadas, muitas vezes sofre baixa reprodutibilidade e controle de processo difícil. A configuração mais simples para atingir um aumento de fluorescência estreita que a fornecida por lâminas multi-camada consiste do reflector planares de silício revestida com uma fina película de SiO

2 [20], [21] proposto pelo presente trabalho.

para avaliar desempenhos técnicos da plataforma recém-desenvolvida e verificar sua capacidade de corrigir genotipagem de KRAS e BRAF

mutações V600E em amostras de tumores colorretais, foram selecionadas 60 amostras de tecido já classificadas para estas variantes genéticas por protocolos completos de convencional e COLD -PCR, alta resolução derretimento análise e sequenciação directa. O excelente resultado dos resultados será discutido a fim de mostrar as vantagens e as desvantagens de ambas as tecnologias.

Materiais e Métodos

Ética

As amostras de tecidos foram coletadas em Azienda Ospedaliera Universitaria Careggi, em Florença (Itália), de 75 pacientes submetidos à cirurgia para CRC no período de 1/6 /2009-2 /5/2011. Todos os indivíduos incluídos neste estudo forneceu consentimento informado por escrito. O estudo foi aprovado pelo conselho de revisão da Universidade de Florença. Além disso, foram utilizadas duas linhas de células fornecidos por ATCC-LGC Parceria Padrões: a linha celular CCRF-CEM, como referência para KRAS p.G12D mutação (heterozigótico) e a linha de células A375 de melanoma humano como a fonte de BRAF

ADN homozigótico V600E . A linhagem humana de células de carcinoma colorectal SW620 (usado como referência para KRAS mutação pG12V, homozygousand a linha de células de câncer de mama humano MCF-7 (tipo selvagem para ambos os genes KRAS e BRAF) foram fornecidos pela Banca Biologica fábrica e celular (IRCCS Azienda Ospedaliera Universitaria San Martino -. IST Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro)

a preparação da amostra

Sessenta amostras de tecidos foram coletadas durante a cirurgia e imediatamente mergulhado em RNAlater (Qiagen Gmbh, Hilden, Alemanha) em 4 ° C durante 24 horas e posteriormente armazenados a -80 ° C até à análise. os tecidos foram interrompidas por tecido Lyser com inoxidável esferas de aço de 5 mm (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. purificação do DNA foi realizada com QIAcube ™ e QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen )

A concentração de DNA foi determinada com Nanodrop ND-1000 Espectrofotômetro (Thermo Scientific, dE, EUA)

Além disso, 15 FFPE tecidos também foram analisados;.. o DNA de tecidos FFPE foi extraída usando o kit de tecido FFPE (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante.

amostras de DNA foram inicialmente investigados por meio de PCR convencional e amplificação FRIO-PCR seguido de HRM e sequenciação directa. Posteriormente, eles foram cegamente submetidos à análise pelo dispositivo de microarray recentemente desenvolvida para avaliar a sua capacidade em KRAS e BRAF mutações genotipagem.

amostras de controlo positivas foram representados por DNA de linhas de células com mutações nos genes-alvo (Veja anterior seção de Ética). Em particular do tipo selvagem e mutantes amostras foram ensaiadas em separado como amostras individuais e como misturas, a fim de obter percentagem conhecida de alelo mutante (a partir de 6% a 0,01%) a ser utilizado para a determinação da sensibilidade do ensaio para KRAS e p.G12D BRAF V600E variantes.

Além disso, o ADN plasmídico contendo as sequências de tipo selvagem e, alternativamente, todas as variantes consideradas foi utilizado para obter amostras reconstituídas para provar a sensibilidade do ensaio e especificidade para todas as outras mutações KRAS.

a mutagénese

mutante de rolamento plasmídeos foram gerados através da clonagem dos produtos de PCR específicos mutagenizadas que albergam as sete mutações testados no ensaio e o correspondente fragmento de tipo selvagem. fragmentos mutagenizados foram preparadas utilizando uma modificação do método relatado anteriormente [22]. Resumidamente, a mutagénese foi conseguida pela divisão de cada fragmento amplificado em dois fragmentos. O fragmento 5 ‘foi então amplificado com o iniciador directo original e um iniciador inverso mutagénese de introdução de um transversão conservadora. Em paralelo, o fragmento a 3 ‘foi amplificada com o iniciador inverso original e um iniciador directo mutado introduzindo a mesma variação de nucleótidos como acima (ver Tabela S1). Isto levou à produção de dois fragmentos que se sobrepõem parcialmente, que foram, cada um de sílica eluída num volume final de 50-100 mL de água destilada para eliminar os iniciadores não incorporados. Nós misturados 2 uL de cada solução eluída em conjunto; cada mistura foi depois alongada para 15 ciclos, na presença da mistura reaccional de PCR contendo todos os reagentes, mas iniciadores. O produto de reacção de alongamento, o que resulta num fragmento de comprimento completo centralmente mutagenizado, foi adicionalmente amplificado por PCR de 20-30 ciclos por adição da mistura completa de PCR e clonados no vector de plasmídeo (TOPO TA Cloning, Invitrogen, Life Technologies, Milão, Itália ) de acordo com o protocolo do fabricante. A sequenciação directa confirmou que a mudança de nucleótidos desejada foi introduzida no controle mutado

condições de PCR

Exon 2 do gene KRAS foi amplificado com o seguinte conjunto de primers:. 5′-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AA -3 ‘(directo) e 5′-AGA ATG GTC CTG CAC CAG TAA-3′ (5-amino-modificada, inverter) a geração de um fragmento de 167 pb. Os iniciadores utilizados para a amplificação de exon 15 BRAF (tamanho do fragmento amplificado de 173 pb) foram 5’-TGC TTG TGA CTC TAG GAA AAT G-3 ‘(directo) e 5′-CCA CAA AAT GGA TCC AAG CA-3’ (5-amino -Modified, inverter).

PCR para ambos os genes foi realizada em 25 uL de reacção contendo 15 ng de ADN, 200 uM de cada desoxinucleótido, Tris-HCl a 10 (pH 8,3), 50 mM de KCl, 1,5 mM MgCl

2, 1,5 U de ADN-polimerase (AmpliTaq Gold; Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) e 10 pmol de cada iniciador. As condições de amplificação implicou a desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 min seguido de 35 ciclos a 95 ° C durante 30 s, 58 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 30 s, e um alongamento final a 72 ° C durante 10 min .

PCR purificação

Depois de o processo de amplificação, cada fragmento amplificado foi purificado e dessalinizada com o uso de uma placa de 96 poços (placas-PCR Multiscreen MANU 030) juntamente com o Sistema de Separação Multiscreen (Millipore corporation, Billerica, MA, EUA). Os produtos de PCR foram eluídos em 35 uL de 1 × tampão de impressão (fosfato de sódio 150 mM pH 8,5).

Reporter e estabilizador projeto

Repórteres foram concebidos em um formato dot-blot com a variação da base correspondente aos pontos quentes localizados internamente (Tabela 1). Foi utilizado um formato de marcação universal (Figura 1), com base em repórteres contendo uma cauda específica da sequência que hibrida com Cy3 universal ou Cy5 sondas marcadas (de tipo selvagem sonda: CTC AAT GTT CGG ACT CAG-Cy3; sonda mutante: TGT CAA GCG ATA TAC TGC-Cy5) [23]

passos de hibridação:. 1) estabilizador de oligonucleótido para abrir a estrutura secundária do fragmento de PCR; 2) O “mix repórter universal”. A mistura contém o tipo selvagem e repórteres mutantes. Cada repórter é prolongada por uma cauda complementar ao oligonucleótido marcado universal. Cyanine 3- (Cy3) e cyanine 5- (Cy5) marcado recozimento oligonucleotídeo universal ao tipo selvagem e os repórteres mutantes, respectivamente.

Stabilizer (oligonucleotídeo necessário abrir as estruturas secundárias presente em o amplicon) e design repórter foi realizada com a ajuda de programas de web-free (servidor DNAmfold: https://www.bioinfo.rpi.edu/Ezukerm/rna e OligoAnalyzer 3,0 por Integrated DNA Technologies: http: //www.idtdna .com) [24]. Todos os repórteres foram projetados usando a cadeia anti-sentido como amplicon alvo. Todas as 7 mutações KRAS foram analisadas com o mesmo oligonucleótido estabilizador relatado na Tabela 1. A mutação BRAF codão 600 necessária a utilização de dois estabilizadores (Stab 1: localizado em 5 ‘para a mutação; Stab 2: localizado em 3’ relativamente à mutação , apresentados na Tabela 1).

preparação

revestimento da lâmina de silício e microarray

de silício não tratada desliza 1000A Oxide térmica (14 × 14 milímetros

2) foram fornecidos pela SVM, Silicon Valley Microelectronics Inc . (Santa Clara, CA EUA). lâminas de silício foram pré-tratados com hidróxido de sódio 0,1 M durante 30 min e lavou-se com água e secou-se. Após pré-tratamento, as lâminas de silício foram imersas durante 30 minutos numa solução de copoli (DMA-nas-MAPS) (1% w /v em 0,9 M de (NH4)

2SO solução de água

4). Copoli (DMA-nas-MAPS) foi sintetizado e caracterizado tal como descrito [14].

As lâminas foram finalmente lavadas com água e secou-se sob vácuo a 80 ° C.

Os produtos de PCR para cada do gene, amplificado a partir de iniciadores com grupo amino primário de 5 ‘, necessárias para se ligar covalentemente os fragmentos de amplificação para o substrato através de uma reacção entre os grupos amino e os ésteres activos do revestimento de polímero, foram vistos nas substratos microarray. Três ul da amplicons modificados com amino foram impressas em 6 repetições e um observador piezoelétrico, SciFLEXARRAYER S5 (Scienion Alemanha), em lâminas de silício revestido. Um oligonucleótido modificado com amino marcada com Cy3 foi visto como uma referência de posicionamento em quatro colunas em cada matriz. condições mancha foi realizado como descrito em [25]. Os produtos de amplificação foram acoplados para as matrizes por incubação numa caixa de armazenamento descoberto, colocado numa câmara fechada, saturada com cloreto de sódio (40 g /100 mL de H

2O) e incubou-se à temperatura ambiente durante a noite.

após a incubação, todos os grupos reactivos residuais do polímero de revestimento foram bloqueados por imersão a lâmina em solução pré-aquecido bloqueando conforme relatado [25].

hibridização

imediatamente antes da hibridação, slides impressos foram mergulhados em NaOH 0,1 M durante 5 minutos para desnaturar os amplicões imobilizados de cadeia dupla, subsequentemente, enxaguados com água e secos. Sequências de repórteres e estabilizadores, juntamente com as temperaturas de hibridação são detalhados na Tabela 1. No primeiro passo, 0,5 mL de o estabilizador oligonucleótido foram misturadas com 49,5 mL de tampão de hibridação (SSC 2 ×, SDS a 0,1%, 0,2 mg /mL de BSA) -se a concentração final de 1 uM e espalhada sobre a área manchada do diapositivo. As lâminas foram incubadas a 20 ° C durante 30 minutos na câmara de hibridação Thermomixer Comfort (Eppendorf), e, em seguida, lavou-se à temperatura ambiente num tampão SSC 4 × para remover a lâmina de cobertura. Este primeiro passo de lavagem foi seguido de uma lavagem breve (30 segundos) num tampão de baixo teor de sal (0,2 x SSC). Em seguida, para a detecção de G12S, G12D, G12C, G12R, G13D KRAS mutações e para os BRAF

mutações V600E, o repórter para o tipo selvagem e as sequências mutadas e seus oligonucleótidos universais correspondentes marcadas com Cy3 e Cy5, respectivamente, foram misturados em conjunto em quantidades equimolares (concentração final de 1 uM) e adicionou-se o tampão de hibridação (SSC 2 ×, SDS a 0,1%, 0,2 mg /mL de BSA) (ver Figura 1 para o esquema de ensaio). No caso de mutações G12a e G12V KRAS foi necessário incubar os produtos de amplificação em dois passos consecutivos. No primeiro passo, os fragmentos amplificados foram hibridadas com o repórter para complementar a sequência mutada em conjunto com o oligonucleótido correspondente universal marcado com Cy5; em seguida, após uma breve lavagem em SSC 4 × para remover a lâmina de cobertura, no segundo um dos amplicões foram hibridadas com o repórter para complementar o tipo selvagem e o seu oligonucleótido correspondente universal marcado com Cy3. Ambas as incubações duraram durante 1 hora.

Finalmente, as lâminas de silício foram removidos da câmara de hibridação e embebidos brevemente em SSC 4 × tampão para remover a lâmina de cobertura, lavados duas vezes durante 5 min em 2 x SSC /0,1% SDS , pré-aquecido à temperatura de hibridação específica, e depois mergulhada, em sequência, numa solução de 0,2 x SSC e 0,1 × SSC durante 1 min à temperatura ambiente, secou-se por centrifugação a 780 rpm durante 3 min e digitalizada.

digitalização de imagem e análise de dados

ProScanArray (Perkin Elmer, MA, EUA) foi utilizado para digitalizar os slides hibridizadas. Em particular, um laser verde (λ

ex 543 nm /λ

em 570 nm) para o corante Cy3 e um laser vermelho (λ

ex 633 nm /λ

em 670 nm) para o Cy5 corante foram aplicadas. O fotomultiplicador (PMT) ganho de tubo e a potência do laser mudou entre fluorocromos e diferentes experiências. imagens TIFF de 16 bits foram analisados ​​a 5 mm resolução. intensidades de dados foram extraídos com o software do scanner e a análise dos dados foi realizada para cada experiência como descrito anteriormente [25].

convencional e amplificação FRIO-PCR seguido de alta resolução Melting (HRM) e sequenciação directa

convencional PCR, COLD-PCR, gestão de recursos humanos e de sequenciamento protocolos foram já descritos [11], [26].

resultados

1) HRM amplificação convencional e COLD-PCR e seqüenciamento resultados

Inicialmente, todas as 75 amostras foram selecionados para a pesquisa de mutações KRAS e BRAF

V600E por HRM e sequenciamento. Numa segunda fase, todas as amostras (mutantes e do tipo selvagem) foram devolvidos a um exame completo usando a amplificação-PCR frio seguido de HRM e seqüenciamento como já relatado [11].

Globalmente, 59 de 75 amostras contida em alternativa uma mutação quer por hotspots KRAS ou o BRAF

variante V600E, enquanto 16 foram classificados como amostras de tipo selvagem e incluídos como controlos negativos. É importante notar que em 9/59 amostras de mutantes, a identificação de substituições de bases só foi possível através da utilização de protocolos de PCR rápidos COLD ou completos, provavelmente devido às menores percentagens de alelos mutados nas amostras de partida. Estas amostras foram apropriadamente introduzido no estudo de validação para testar a sensibilidade da plataforma proposta. Para uma descrição detalhada da distribuição de KRAS e BRAF variantes em nossas amostras consulte a Tabela 2.

2) Optimização de análise de slides de silício

amostras de controlo de tipo selvagem e reconstituída controle heterozigotos amostras (gerada pela mistura adequada de ADN plasmídico contendo o tipo selvagem e as sequências mutadas de todas as 7 mutações KRAS e do BRAF

variante V600E) foram utilizadas para testar a especificidade do ensaio. Seguindo otimização de temperatura e tempo de hibridação, foi alcançada uma identificação correta de todos os genótipos. Um exemplo é ilustrado nas Figuras 2 e 3 em que uma experiência de hibridação para o G12R KRAS e BRAF o

mutação V600E é mostrado, respectivamente. No sistema optimizado, para todas as mutações analisados ​​pudemos comprovar que: i) sinais fluorescentes foram alta, ii) nenhuma hibridação cruzada foi obtida, até mesmo para as variantes que afectam os mesmos ou adjacentes posições de nucleótidos (Figura 2D) e iii) um boa reprodutibilidade de local para local (mostrado pelas barras de erro) foi encontrado.

varrimento (a) micromatriz do sinal de fluorescência com Cy3 correspondente ao alelo de tipo selvagem. Manchas na coluna 1,2,3,4 representam oligonucleotídeo modificado com amino marcado com Cy3 usado como pontos de referência. (B) digitalização do sinal de fluorescência Cy5 correspondente ao alelo mutado. esquema de manchas (C) microarray. em peso: amostras de controlo de tipo selvagem; Het1, Het2 e Het3: amostras de controlo heterozigotos para G12a, G12C, G12R, G12S, G12V, G13D; mutações KRAS G12D; luz quadrados cinza representam oligonucleotídeo modificado com amino marcado com Cy3 usado como pontos de referência. (D) a intensidade de fluorescência relativa normalizada após hibridação de amostras de controlo conhecidas, com os repórteres complementares à variação G12R. Barras representam a média da intensidade das 6 réplicas de cada amostra. As barras de erro são os desvios padrão da intensidade de fluorescência de cada amostra. Sinal

(A) Cy3 fluorescência correspondente ao alelo de tipo selvagem. Manchas na coluna 1,2,3,4 representam oligonucleotídeo modificado com amino marcado com Cy3 usado como pontos de referência. sinal (B) Cy5 de fluorescência correspondente ao alelo mutado. esquema de manchas (C) microarray. em peso: amostras de controlo de tipo selvagem; Het1, Het2 e Het3: amostras de controlo heterozigotos; mut: amostra de controlo mutante homozigoto; luz quadrados cinza representam oligonucleotídeo modificado com amino marcado com Cy3 usado como pontos de referência. (D) a intensidade de fluorescência relativa normalizada após a hibridização das amostras de controlo conhecidas, com os repórteres complementares à variação V600E BRAF. Barras representam a média da intensidade das 6 réplicas de cada amostra. As barras de erro são os desvios padrão da intensidade de fluorescência de cada amostra.

3) A sensibilidade do ensaio

sensibilidade do ensaio em diferentes proporções discriminantes de alelos mutantes foi avaliado sobre diluições em série (6%, 3%, 1,6%, 0,8%, 0,4%, 0,2%, 0,1%, 0,05%, 0,02%, 0,01% mutante /tipo selvagem) de ADN mutado oportunamente misturados com wild- DNA tipo. Em particular, utilizou-se linha celular CCRF-CEM, como referência para KRAS p.G12D mutação (heterozigotos), a linha celular humana de carcinoma colorectal SW620 (utilizado como referência para a mutação KRAS pG12V, homozigoto), e o melanoma humano linhas de células A375 (utilizado como a fonte de BRAF

DNA V600E homozigoto). A linha celular de cancro da mama humano MCF-7 foram utilizados como de tipo selvagem para ambos os genes KRAS e BRAF. Para todas as outras mutações KRAS foram utilizados os plasmídeos portadores de mutantes gerados.

O limite de detecção do método proposto foi diferente para as 7 mutações KRAS e testados para a mutação BRAF V600E. Em particular, o sistema de micro-arranjo tem sido capaz de detectar um mínimo de cerca de 0,01% de alelos mutados num fundo de ADN de tipo selvagem para a mutação G13D, cerca de 0,025% de alelo mutado para a mutação G12R, 0,05% para a mutação G12C , 0,1% para a mutação G12D, 0,2% para a mutação BRAF V600E, 0,4% para o G12a e as mutações G12S e 0,8% para o G12V respectivamente. Na Figura 4 são mostrados dois exemplos dos resultados obtidos para a mutação G13D KRAS e para a mutação de BRAF

V600E.

O limite de detecção da mutação G13D (A) e da mutação V600E BRAF (B) . em peso: amostras de controlo de tipo selvagem; Het1, Het2 e Het3: amostras de controlo heterozigotos; números de 1 a 10: diluições em série, 1 = 6%, 2 = 3% 3, = 1,6%, 4 = 0,8%, 5 = 0,4,% 6 = 0,2%, 7 = 0,1%, 8 = 0,05%, 9 = 0,02%, 10 = 0,01%, respectivamente. Barras representam a média da intensidade das 6 réplicas de cada amostra. As barras de erro são os desvios padrão da intensidade de fluorescência de cada amostra.

4) Cego validação

validação ensaio foi realizado de forma cega através da análise de 75 amostras de indivíduos ou positivo ou de tipo selvagem para mutações KRAS e BRAF, caracterizada anteriormente pela HRM e sequenciação directa. Como um exemplo, os resultados de microarray para a mutação KRAS e para BRAF G12C

mutação V600E para os tecidos congelados são mostrados nas Figuras 5 e 6, respectivamente. Além disso na Figura 7 e 8 os resultados de microarray para a mutação G12R KRAS e para BRAF

mutação V600E em amostras FFPE são mostrados, respectivamente. O sistema era altamente específico para atribuir o genótipo correcto para todas as amostras. validação cego apresentado completa concordância de resultados (Tabela 2), com excepção de amostras esperado N.31 e n.40, transportando o p.G13C e as variantes p.V14I KRAS, que foram explicitamente apresentados para testar a especificidade do recentemente desenvolvido sondas (ver Tabela 2).

(a) do sinal de fluorescência Cy5 correspondente ao alelo mutado. (B) esquema de manchas. em peso: amostras de controlo de tipo selvagem; Het1, Het2 e Het3: amostras de controlo heterozigotos para G12a, G12C, G12D, G12R, G12S, G13D, mutações KRAS G12V; números de 1 a 60: sessenta amostras de DNA de tumores sólidos diferentes. marcadores de cinza representam as amostras positivas para a mutação G12C; luz quadrados cinza representam um oligonucleotídeo modificado com amino marcado com Cy3 usado como pontos de referência. (C) Análise de RH do número de amostra de 30 (número 2), em comparação com os perfis de fusão das amostras de controlo (de tipo selvagem de referência = número 1; mutado referência = número 3) após a amplificação por FRIO-PCR: o comportamento de fusão é sugestiva quanto à presença de ADN mutada na amostra. (D) análise de sequenciação directa de número da amostra 30 submetidos ao protocolo de amplificação FRIO-PCR: eletroferograma confirma a presença de ADN mutado (G12C) na amostra

(A) sinal de fluorescência Cy3 correspondente a. o alelo de tipo selvagem. Manchas na coluna 1,2,3,4 representam oligonucleotídeo modificado com amino marcado com Cy3 usado como pontos de referência. sinal (B) Cy5 de fluorescência correspondente ao alelo mutado. (C) esquema de manchas. em peso: amostras de controlo de tipo selvagem; BRAF Het1, Het2 e Het3: amostras de controlo heterozigotos; mut: amostra de controlo mutante homozigoto; números de 1 a 60: sessenta amostras de tumores sólidos diferentes. marcadores de cinza representam as amostras positivas para a mutação BRAF; quadrados cinzentos claros representam um oligonucleótido modificado com amino marcado com Cy3 utilizados como pontos de referência. sinal

(A) Cy3 fluorescência correspondente ao alelo de tipo selvagem. Manchas na coluna 1,2,3,4 representam oligonucleotídeo modificado com amino marcado com Cy3 usado como pontos de referência. sinal (B) Cy5 de fluorescência correspondente ao alelo mutado. (C) esquema de manchas. em peso: amostras de controlo de tipo selvagem; het: amostras de controlo heterozigotos para G12a, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13D, as mutações KRAS; números de 1 a 15: quinze amostras diferentes de DNA FFPE tumor sólido. marcadores de cinza representam as amostras positivas para a mutação G12R; luz quadrados cinza representam um oligonucleotídeo modificado com amino marcado com Cy3 usado como pontos de referência. (D) a intensidade de fluorescência relativa para detectar a sensibilidade do sistema avaliado para a mutação G12R. em peso: amostras de controlo de tipo selvagem; Het: amostras de controlo heterozigotos; números de 1 a 15: amostras FFPE. Barras representam a média da intensidade das 6 réplicas de cada amostra. As barras de erro são os desvios padrão da intensidade de fluorescência de cada amostra. Sinal

(A) Cy3 fluorescência correspondente ao alelo de tipo selvagem. Manchas na coluna 1,2,3,4 representam oligonucleotídeo modificado com amino marcado com Cy3 usado como pontos de referência. sinal (B) Cy5 de fluorescência correspondente ao alelo mutado. (C) esquema de manchas. em peso: amostras de controlo de tipo selvagem; Het1 BRAF, Het2: heterozigótico amostras de controlo; Mut1 BRAF, Mut2: amostra de controlo mutante homozigoto; números de 1 a 15: quinze amostras diferentes de DNA FFPE tumor sólido. marcadores de cinza representam as amostras positivas para a mutação BRAF; luz quadrados cinza representam um oligonucleotídeo modificado com amino marcado com Cy3 usado como pontos de referência. (D) a intensidade de fluorescência relativa para detectar a sensibilidade do sistema avaliado para a mutação BRAF V600E. em peso: amostras de controlo de tipo selvagem; Het: amostras de controlo heterozigotos; números de 1 a 15: amostras FFPE. Barras representam a média da intensidade das 6 réplicas de cada amostra. As barras de erro são os desvios padrão da intensidade de fluorescência de cada amostra.

Discussão

A sensibilidade ea especificidade são características fundamentais de qualquer método de diagnóstico. Altamente ensaios sensíveis, capazes de detectar pequenas quantidades da substância sob investigação, pode abrir novas oportunidades em várias aplicações clínicas. Em particular, a identificação de alelos mutados minoritários dentro de um excesso de alelos de tipo selvagem, que representa um problema comum na análise de ADN de cancro, é tecnicamente muito difícil, e requer a utilização de técnicas altamente sensíveis.

Dentro desta