Abstract

Ezrin pertence à ERM (Ezrin-radixina-moesin) família de proteínas e tem sido demonstrado que regulam os passos precoces de sinalização do receptor de Fas em células linfóides, mas a sua contribuição para a regulação da morte celular induzida por TRAIL em células cancerosas aderentes permanece desconhecida. Neste estudo nós relatamos que a regulamentação de FasL e morte celular induzida por TRAIL por Ezrin é tipo de célula dependente. Ezrin é um regulador positivo da apoptose na linha celular de linfoma T de Jurkat, mas um regulador negativo de células cancerígenas do cólon. Usando fosforilação ezrina ou mutantes ligam à actina, que fornecem evidências de que a regulação negativa da apoptose induzida pelo receptor de morte por ezrina ocorre de uma forma independente e cytoskeleton- de disco, em células de cancro do cólon. Surpreendentemente, foi encontrada a inibição da apoptose induzida por estes ligandos para ser estreitamente associado com a regulação da fosforilação de serina na ezrina 66, o gene supressor de tumor WWOX e activação de PKA. A deficiência na expressão WWOX no cancro do fígado as linhas de células pancreáticas Mia PaCa-2 SK-HEP1 ou bem como WWOX silenciamento ou modulação da activação de PKA por reguladores farmacológicas, na linha celular de cancro do cólon SW480, revogada regulação da sinalização de TRAIL por ezrina. No total, os nossos resultados mostram que a regulação receptor de morte de sinalização pró-apoptótica por Ezrin pode ocorrer a jusante do DISC em células cancerígenas do cólon

Citation:. Iessi E, Zischler L, Etringer A, Bergeret M, Morle A, Jacquemin G , et ai. (2015) Morte Receptor-apoptose induzida Regulamento de Sinalização por Ezrin é celular Tipo Dependente e ocorre de forma DISC-Independent em células de cancro do cólon. PLoS ONE 10 (5): e0126526. doi: 10.1371 /journal.pone.0126526

Editor do Academic: Shi-Yong Sun, da Universidade Emory, Estados Unidos

Recebido: 07 de janeiro de 2015; Aceito: 03 de abril de 2015; Publicado em: 26 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Iessi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Comunidade Europeia (ApopTrain Marie Curie RTN), o programa “Investissements d’Avenir”, com referência ANR-11-LabX -0021-01-lipstic Labex, da Universidade de Bourgogne, o Conseil Régional de Bourgogne, o Inca (Instituto Nacional do Câncer du, polynom-174), o Cancéropôle Grand-Est, da Ligue Nationale contre le Cancer, ARC (Association pour la Recherche sur le Cancer), e do Ministério da Educação e Pesquisa. EI, SS, LZ e AM foram apoiados por bolsas de os Marie Curie RTN, Inca, CAPES (N ° BEX4938 /14-3) eo Cancer le Ligue Nationale Contre, respectivamente. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

TNF-relacionadas ligando Indutor de apoptose (TRAIL ou Apo2L) induz morte celular de uma ampla variedade de células cancerosas, mas não em células normais. Esta peculiaridade torna derivados TRAIL e pista de agentes terapêuticos inovadores e promissores contra doenças malignas. TRAIL desencadeia a morte celular por ligação a dois receptores transmembranares agonistas: TRAIL-R1 (DR4) [1-3] e TRAIL-R2 (DR5) [1, 2, 4, 5], que contém dentro de sua região intracelular de um domínio de morte (DD ), que é essencial para o desencadeamento de apoptose. Activação de TRAIL-R1 /TRAIL-R2 permite o recrutamento da proteína adaptadora FADD e proformas de caspase-8 e -10, para formar o complexo macromolecular chamado DISC (Morte Indutor Sinalização Complexo) [6]. Dentro deste complexo, caspase-8 e -10 são ativados por clivagem auto-proteolítica e liberado no citosol permitindo a activação das caspases efetoras [7].

Tal como receptores de TRAIL, Fas, também cunhou CD95 ou APO-1 , sinaliza a apoptose através da formação de um disco de [8]. A evidência experimental indica que Fas ligação ao citoesqueleto de actina através Ezrin primos linfócitos humanos CD4 + T para a apoptose mediada por Fas [9, 10]. a activação das células T CD4, quer através de VIH-1 gp120 ou IL-7, torna as células T CD4 + com tendência para a apoptose mediada por Fas-Fas ezrina através de ligação e, por conseguinte, a apoptose de células vizinhas não infectadas T em pacientes com SIDA [11, 12]. Em linfomas T, tais como células de Jurkat, a ezrina mostrou ligar-se de Fas, e a ser necessária para desencadear a morte das células [13]. No entanto, a ezrina, também foi sugerida, noutro estudo, para inibir a morte celular induzida pelo ligando de Fas e TRAIL- em linfomas de células T [14].

Ezrin é um membro da ezrina, radixina, moesina (MTC) família de proteínas, que ligam várias proteínas de membrana integral ao citoesqueleto de actina [15]. proteínas ERM estão normalmente presentes no citoplasma numa forma inactiva /fechado, em que o domínio de ligação de proteína da membrana do terminal amino (FERM ou N-ERMAD domínio) é mascarada, devido à sua associação com o carboxilo, o domínio de ligação a actina (C -ERMAD). activação ERM é proposto para ocorrer através de fosforilação e ligação de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP

2) [16].

A fosforilação de Ezrin em treonina 567 induz uma transição para a forma aberta /ativa, que se correlaciona com o seu recrutamento para a membrana de plasma, onde se liga moléculas da membrana. Outros locais de fosforilação na ezrina foram descritos. Fosforilação de resíduos de tirosina 145 e 353, por exemplo, em resposta ao factor de crescimento epidérmico, promove a sobrevivência [17] e a diferenciação epitelial [18]. Ezrin fosforilação mediada por Src na tirosina 145 aumenta a adesão de células epiteliais de matriz extracelular [19], enquanto a fosforilação de serina 66 pela proteína quinase A (PKA) está associada com a secreção de ácido gástrico em células [20]

.

Nós aqui explorar ainda mais a função de Ezrin na via TRAIL. Nós demonstramos que a fosforilação Ezrin na serina 66 contribui seletivamente à regulação da morte celular induzida por TRAIL jusante do DISC TRAIL em células de câncer de cólon.

Materiais e Métodos

produção e anticorpos Ligand

recombinante TRAIL humana solúvel marcada com Flag, TRAIL His-marcado e o ligando Fas foram produzidos e utilizados como descrito anteriormente [21]. Anti-Flag (M2), 8-bromo-AMP cíclico, e ortovanadato de Forskolin foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Lyon, França). inibidor de PKA, H89 era de Cayman (Interchim, Montluçon, França). Para a análise de Western Blot, os anticorpos anti-TRAIL-R1 e anti-TRAIL-R2 foram adquiridos a Chemicon (Millipore, Molsheim, França), anti-FADD, anti-fosfo-ezrina (Thr567) e anti-moesina foram obtidos da Transduction Laboratories (BD Biosciences, Le Pont de Claix, França), anti-caspase-8 e anti-caspase-10 eram de Medical Laboratórios Biológico (Clinisciences, Montrouge, França). Os anticorpos contra fosfo-ezrina (Thr567) /radixina (Thr564) /moesina (Thr 558), fosfo-PKA Substrato (RRXS * /T *) (100G7E), fosfo- (Ser) PKC substrato (P-S3-101), a fosfo-CREB (Ser133) (87G3) e o fragmento clivado activo da caspase-3 e caspase-9 foram a partir de Cell Signaling (Ozyme). Anti-radixina, caspase-2, GAPDH e HSC-70 foram de Santa Cruz Biotechnology (Tebu-bio, Le Perray en Yvelines, França). Anti-actina, anti-ezrina e glicoproteína anti-VSV foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Lyon, França). Para experiências de citometria de fluxo, anti-Bax foi obtido a partir de biociências BD. O anticorpo secundário foi um anticorpo anti-ratinho de cabra Alexa-488 acoplada a partir de Molecular Probes (Invitrogen, Cergy Pontoise, França). Para imunoprecipitação, o anti-ezrina (clone 3C12), anti-Flag (M2) e anticorpos de VSV anti-glicoproteína (P5D4) foram adquiridos da Sigma-Aldrich anti-TRAIL-R1 (WB-S26) e anti-TRAIL-R2 ( anticorpos B-D37) foram fornecidos pela Gen-Probe (Diaclone, Besançon, França).

cultura celular

O HCT116 (carcinoma do cólon humano), SW480 (cólon adenocarcinoma humano), SK- HEP-1 (carcinoma hepatocelular humano), e Mia PaCa-2 linhas de células foram cultivadas com alta concentração de glicose meio de Dulbecco modificado de Eagle (Lonza, Levallois-Perret, França) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Lonza) e penicilina /estreptomicina ( 100 ug /ml de cada). células PANC-1 (carcinoma pancreático humano) foram cultivadas em meio RPMI 1640, como acima. Todas as linhas celulares foram cultivadas em 5% de CO

2 a 37 ° C.

construção do plasmídeo

ezrina WT foi subclonado a partir do vector pEGFP-N1 (Invitrogen) para PCR- marcado com VSV 3 (Invitrogen). Mutações S66A, S66D, Y145F, Y145D, Y353F, Y353D, T567A, T567D, R579A foram criados por métodos de PCR padrão e um kit de mutagénese dirigida (Stratagene, La Jolla, CA) de acordo com o manual (consulte S1 Tabela do fabricante para a primeira demão Descrição). O S66D, Y145D, Y353D, T567D foram criados para imitar Ezrin fosforilada, enquanto S66A, Y145F, Y353F, T567A foram gerados como Ezrin nonphosphorylatable. Os mutantes Ezrin VSV-tag foram subclonados no vector de expressão pMSCV-puro como HindIII /Xhol fragmentos. Todas as construções foram confirmadas por sequenciação.

Produção de Retrovírus e transdução de células

O vector de expressão retroviral pMSCV-puro e a geração de vírus foram previamente descritos [22]. HCT116, SW480, células MIA PACA-2 e SK-Hep-1 foram infectadas durante 16 horas com sobrenadantes virais contendo 8 ug /ml de polibreno (Hexadimethrin brometo da Sigma Aldrich), lavadas em solução salina tamponada com fosfato a partir de Lonza (PBS), e cultivadas em meio completo contendo 2,5 ug /ml de puromicina de Invivogen.

Medição da viabilidade celular

em placas de 96 cavidades, a 50 000 células foram incubadas a 37 ° C durante 24 horas com o aumento da concentração de His-TRAIL (de 0 a 10 000 ng /ml) ou durante 48 horas com concentrações crescentes de CDDP (de 1 a 1000 pM). A viabilidade celular foi determinada por azul de metileno [22].

análise Hoechst

Células, tratada ou não tratada com His-TRAIL ou FasL, foram incubadas a 37 ° C durante 6 horas. Alternativamente, as células pré-tratadas ou não, durante 30 minutos com 100 pM H89, 1 ou 100 | iM forscolina ou durante 20 minutos com mM AMP 4 8-bromo-cíclico (8B), seguido por TRAIL (100 ou 500 ng /ml durante seis horas) ou ligando de Fas (100 ng /mL durante 6 horas), foram incubadas a 37 ° C durante 6 horas. A apoptose foi avaliada por coloração de Hoechst por determinação da percentagem de núcleos condensados ​​e fragmentados de pelo menos 300 células por condições. Os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes.

APO 2,7 coloração

As células, tratadas ou não com His-TRAIL ou FasL, pré-tratados ou não com 10 mM H89, foram permeabilizadas (PBS, FCS e 2,5% de digitonina 100 ug /ml) durante 10 min a 4 ° C e coradas com um anticorpo 2.7A6A3 conjugado com PE (Beckman Coulter), que reconhece a proteína da membrana mitocondrial APO2.7 exposta numa fase inicial em células que sofrem apoptose. Ao todo, 10 000 eventos foram analisados ​​usando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences).

imunoprecipitações

Para a análise TRAIL DISC, 10

8 células foram estimuladas com 5 ug de FLAG- TRAIL reticulado com 10 ug de anti-Flag M2 em 1 mL de meio durante os tempos indicados a 37 ° C. As células foram então lavadas com tampão fosfato salino frio (PBS) e lisadas em 1 ml de tampão de lise contendo 1% de NP40, 20 mM de Tris-HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl e 10% de glicerol e Cocktail inibidor de proteinase. Os lisados ​​foram pré-limpo com Sepharose 6B (Sigma-Aldrich), e imunoprecipitados durante a noite a 4 ° C com esferas de proteína G-Sepharose (Amersham Biosciences, Les Ullis, França). Para imunoprecipitações receptor de TRAIL ou GAPDH, as células foram estimuladas tal como acima descrito com 5 ug /mL de His-TRAIL. Em ambos os casos, as células foram lisadas em tampão de lise contendo NP40. Os extractos celulares foram pré-aclarados e imunoprecipitadas utilizando 5 ug de anticorpos correspondentes. As pérolas foram então lavadas quatro vezes com tampão de lise, e os imunoprecipitados foram eluidos em tampão de carga (Tris-HCl mM, SDS a 2%, vermelho de fenol a 0,03%, glicerol a 10% e DTT a 100 mM de pH 6,8 63), fervidas durante 5 min e processadas para imunotransferência.

Western blotting

imunoprecipitados ou lisados ​​celulares foram resolvidas por electroforese de sódio dodecil sulfato-poliacrilamida gel (SDS-PAGE) e transferidos para membranas de nitrocelulose. locais de ligação não específicos foram bloqueados por incubação em PBS contendo 0,05% Tween 20 e 5% de leite em pó. As membranas foram depois incubadas com um anticorpo específico primário, seguido pelo anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano, e foram desenvolvidos pelo método de quimioluminescência aumentada, de acordo com o protocolo do fabricante (Pierce, Rockford, IL, EUA).

Análise do Bax activação por citometria de fluxo

Cells, tratado ou não tratado com His-TRAIL, foram fixadas com PFA a 4%, permeabilizadas (PBS, BSA a 1% e saponina 0,1%) durante 10 min à temperatura ambiente e coradas com um anticorpo anti -Bax anticorpo que reconhece a forma N-terminal activo de Bax (clone 6A7, BD Biosciences). 10 000 eventos foram analisados ​​usando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences).

Análise Estatística

Para os estudos in vitro, as diferenças foram determinados quer com duas vias de análise de medidas repetidas de variância (ANOVA ) com o teste de Bonferroni comparação múltipla, ou pelo teste t de Student, utilizando o software Prism 5.0a (GraphPad software, San Diego, CA, EUA). Um nível de significância de * P 0,05, ** P 0,01 ou *** P 0,001 assumiu-se para todos os testes

Resultados

Ezrin é um regulador negativo da Fas e TRAIL-. morte celular induzida

Ezrin e moesina foram previamente demonstrado ser reguladores positivos da morte celular induzida por Fas através da sua capacidade para interagir com o receptor de Fas em células linfóides T [9, 13]. Por conseguinte, a ezrina e silenciamento moesina em células Jurkat inibiu significativamente a apoptose induzida por FasL, e similarmente inibida a apoptose induzida por TRAIL (Fig S1). O papel da ezrina Fas na regulação e a apoptose induzida por TRAIL foi então avaliada em células de carcinoma do cólon. Ezrin era ou sobre-expresso de forma estável (Figura 1A e 1B) ou silenciados utilizando siRNA (Fig 1C e 1D) em HCT116 e células SW480 e por TRAIL ou ligando Fas apoptose induzida por foi avaliada por coloração de Hoechst. A expressão ectópica de Ezrin atenuou significativamente Fas ligando- e morte celular induzida por TRAIL nas duas linhas celulares (Fig 1A e 1B). A sensibilidade à apoptose induzida por estaurosporina, um conhecido inibidor da PKC-para induzir activação mitocondrial, no entanto não foi alterada nestas células (FIG 1A e 1B). Consistente com estes resultados, o silenciamento ezrina aumentou tanto FasL- e a apoptose induzida por TRAIL (Fig 1C e 1D). As células SW480

(A) HCT116 ou (B), que expressam ou não VSV-ezrina foram tratados durante seis hora com ligando Fas (100 ng /ml) ou His-TRAIL (500 ng /ml) ou 16 horas com 1 uM estaurosporina (STS). A apoptose foi quantificada por coloração Hoechst. Os dados representam a média ± DP de pelo menos três experiências diferentes. (* P 0,05; ** P 0,01 correspondente às células de controlo). Ezrin níveis de expressão ectópica foram analisados ​​por imunotransferência utilizando um anticorpo anti-VSV de controlo ou ezrina WT-expressando células HCT116 e SW480. Hsc70 foi utilizado como um controlo de carga. células SW480 (C) HCT116 ou (D), foram transf Ezrin ou mexidos siRNAs (SCR). 72 h após a transfecção as células foram estimuladas durante 6 horas com ligando de Fas (100 ng /ml) ou His-TRAIL (500 ng /ml) e a apoptose foi quantificada, após coloração com anticorpo APO2.7 por citometria de fluxo. Os dados representam a média ± DP de pelo menos três experiências diferentes. (* P 0,05; ** P 0,01 correspondente às células de controlo). Ezrin níveis de expressão foram analisados ​​por imunotransferência. Actina foi utilizado como um controlo de carga. (E) Análise de formação de TRAIL DISC. células HCT116 e SW480 foram estimuladas ou não com 5 ug /ml Flag-TRAIL reticulado com 10 ug /ml de anticorpo anti-Flag (M2). As células foram lisadas, e o disco foi imunoprecipitada e analisados ​​por Western blot. Uma de três experiências independentes é mostrado. As células HCT-116 (F) foram estimuladas ou não com 5 ug /mL de His-TRAIL durante 20 e 60 minutos. Após a lise das células, foi adicionado anticorpo para GAPDH e os lisados ​​celulares imunoprecipitados foram analisados ​​por Western blot.

Ezrin não é recrutado no disco TRAIL

Uma vez que a ezrina tenha sido demonstrado ser um componente do DISC Fas em células linfóides [13, 14], nós próxima verificado se Ezrin foi recrutado na DISC TRAIL em células de câncer de cólon. células HCT116 ou SW480 foram deixadas sem estímulo (CTL e 0) ou foram estimuladas com 1 ug /ml rhFlag-TRAIL reticulado com 2 ug /ml de M2 ​​para 15, 20, 30 ou 60 minutos. Após a estimulação, as células foram lisadas e o disco foi imunoprecipitada, utilizando Sepharose-esferas de proteína G. imunoprecipitação de controlo também foi realizada utilizando um anticorpo irrelevante (CTL) em células não estimuladas. Como se mostra a Fig 1E, a estimulação induzida por TRAIL DISC formação como evidenciado pelo recrutamento da proteína adaptadora FADD, bem como o iniciador caspases-8 e -10 para os receptores de TRAIL. Recrutamento de ezrina foi, no entanto, não consistentemente observados dentro do disco de TRAIL, mesmo após imunoprecipitação selectiva de qualquer TRAIL-R1 (Fig S2) ou TRAIL-R2 (Fig S3). Para verificar a possibilidade de que Ezrin pull-down pode ser inespecífica, uma proteína não relacionada com o TRAIL ou Fas pathway foi imunoprecipitado em células estimuladas com outra versão do TRAIL, o rh-His-TRAIL, um ligando capaz de induzir apoptose na ausência de M2 ​​cross-linking. A imunoprecipitação das quantidades semelhantes GAPDH-puxado para baixo de ezrina, moesina e actina de células não estimuladas, mas menos de lisados ​​de células obtidos a partir de TRAIL (Fig 1F) estimulada. No total, estes resultados argumentar contra uma função fisiológica para Ezrin no nível DISC em células de câncer de cólon.

Ezrin fosforilação modula induzida por TRAIL morte celular

Regulamento da fosforilação Ezrin foi proposto para explicar a sua capacidade para interferir com a sinalização Fas [13, 23]. Como FasL, TRAIL induziu um aumento na fosforilação Ezrin em treonina 567 em SW480 células (Fig 2A). Além disso, como evidenciado após imunoprecipitação Ezrin, um aumento na ezrina tirosina 145 e resíduos de serina fosforilação foi também encontrada após estimulação TRAIL (Fig 2B). Por outro lado, no entanto, a fosforilação de tirosina ezrina 353 verificou-se ser ligeiramente reduzida em células estimuladas com TRAIL, mas a um grau menor, em comparação com as células estimuladas com FasL (Figura 2B).

(A) a análise de imunotransferência de fosfo-Ezrin (Thr567) níveis de expressão em células SW480 após estimulação com His-TRAIL, ligando Fas ou ortovanadato (NAV). Percentagem de fosfo-ezrina relativa intensidades (Thr567) foram determinados como se segue: A intensidade da banda específica em células estimuladas dividida pela intensidade normalizada de células não estimuladas, normalizadas para hsc70. (B) As células SW480 foram estimuladas com 500 ng /ml de TRAIL ou His-100 ng /ml de ligando de Fas durante 15 minutos, ou deixada sem tratamento. Após a lise das células em NP40 contendo tampão, ezrina foi imunoprecipitado com um anticorpo anti-ezrina (clone 3C12). O nível de fosforilação ezrina foi determinada por Western blot utilizando anti-fosfo-ezrina segmentação tirosinas 353 e 145, anti-fosfo-MTC reconhecendo-ezrina fosforilada na treonina 567, -moesin na treonina 558 e na treonina-radixina 564 e um anti- fosfoserina panela. (C) Representação esquemática dos domínios Ezrin e locais de fosforilação no interior da proteína. (D) As células SW480 foram infectados com um vector retroviral pMSCV vazio (Mock) ou com uma codificação ezrina pMSCV vector WT, ezrina S66A, ezrina S66D, ezrina Y145F, ezrina Y145D, ezrina Y353F, ezrina Y353D, ezrina T567A, ezrina T567D e ezrina R579A. Os níveis de expressão de construções Ezrin foram determinados por imunotransferência de extractos celulares NP40 utilizando um anticorpo anti-VSV. Actina foi utilizada aqui como um controlo de carga. Os dados mostrados são representativos de três experiências independentes. (E) Os extractos celulares seleccionadas obtidos após lise em SDS foram analisados ​​por imunotransf erência como anteriormente. (F) Efeito de ezrina WT e ezrina phosphomutants expressão ectópica em morte celular induzida por TRAIL em células SW480. As células foram estimuladas com TRAIL 500 ng /ml durante 6 horas. A apoptose foi medida por coloração por citometria de fluxo APO2.7. (G) A viabilidade celular nas células SW480 que expressam ezrina S66A, ezrina S66D ou ezrina R579A, em comparação com Mock células infectadas foi avaliada por ensaio de azul de metileno de 24 horas após o tratamento com concentrações crescentes de His-TRAIL. (H) por cento de inibição curvas de concentração de TRAIL, em ng /ml, a partir de células SW480 que expressam ectopicamente os mutantes Ezrin indicados foram obtidos por coloração com azul de metileno 16 h após o aumento das concentrações His-TRAIL. Correspondente IC25, IC50 e IC90, induzir a morte celular 25, 50 e 90%, foram obtidos utilizando CompuSyn. Os dados representam a média ± SD de pelo menos 3 experiências independentes. * P 0,05; ** P 0,01; *** P . 0.001 respectiva para as células de controlo Mock

A fim de determinar se a fosforilação Ezrin [19, 20, 24] afeta sinalização de TRAIL, o próximo gerado vários mutantes de fosforilação que codificam variantes nonphosphorylatable ou pseudophosphorylated variantes da ezrina, a serina 66, treonina 567 e tirosinas 145 e 353 locais por mutagénese dirigida ao local (Figura 2C). Em adição a estes mutantes de fosforilação, um mutante defeituoso na ezrina F-actina de ligação, ezrina R579A foi gerado para determinar o papel do citoesqueleto de actina na inibição mediada por TRAIL-ezrina [25]. A infecção de células SW480 com um vector retroviral que codifica essas construções levou a níveis variáveis ​​de expressão de mutantes sensíveis mas Ezrin (Figura 2D), com a excepção da variante Y145F nonphosphorylatable, que foi principalmente expressos na fracção insolúvel (Fig 2E). Curiosamente mutantes mais Ezrin TRAIL- auditivos (Figura 2F) e Fas apoptose induzida por ligando (Fig S4). Notavelmente, a variante nonphosphorylatable S66A significativamente melhorada e selectivamente a apoptose induzida por TRAIL enquanto a variante pseudophosphorylated S66D efeito protector demonstrado superiores em comparação com WT ezrina e zombar células (Figura 2F e 2G). A alteração da fosforilação de S66, no entanto, não para regular a inibição da apoptose induzida por FasL ezrina-mediada (S4 figura). Como WT ezrina, a liga à actina deficiente mutante R579A inibiu a apoptose induzida por FasL, TRAIL (figura 2F e S4 figura), sugerindo que a inibição da apoptose induzida por ezrina de receptor de morte em células de cancro do cólon podem ocorrer independentemente das propriedades de ligação ao citoesqueleto de Ezrin. Alteração da fosforilação Ezrin na serina 66 parece ser, de longe, o evento mais importante controlar a capacidade do Ezrin para inibir a sinalização TRAIL.

Em comparação com células parentais em que cerca de 200 TRAIL ng /ml são necessários para induzir a morte celular em 50% das células, ezrina WT ou R579A células mutantes expressando exibido um IC50 de 260 e 380 ng /ml, enquanto o IC50 em S66A células que expressam era inferior a 40 ng /ml e a de S66D atingiu 850 ng /ml (Figura 2G ). Em outras palavras, a regulação da fosforilação ezrina em S66 modula a sensibilidade a morte celular induzida por TRAIL por uma ordem de magnitude que varia de 0,2 a mais do que quatro vezes em comparação com as células parentais (Fig 2H e S2 Tabela, para valores de CI%).

Ezrin inibe a morte celular induzida por TRAIL DISC jusante da trilha

Análise da caspase-8 e a activação de caspase-10 em lisados ​​de células obtidos a partir de células SW480 que expressam quer ezrina WT, R579A, S66A ou S66D, estimuladas com concentrações crescentes de TRAIL, revelou que TRAIL DISC caspases iniciadoras associados foram activadas de um modo semelhante, independentemente da ezrina mutante (Figura 3A). Por outro lado, a activação de caspase-9 e caspase-3 foram ligeiramente melhorada em ezrina S66A que expressa SW480 células e consistentemente reduzida em células SW480 que expressam ezrina WT, ezrina S66D e ezrina R579A, como jugged dos produtos clivados correspondentes (Fig 3A) . Além disso, a formação de TRAIL DISC nem foi alterado pela expressão ectópica de Ezrin S66A, nem mutantes S66D (Fig 3B), e nenhum do mutante Ezrin, que nós testamos até agora foram capazes de alterar os níveis de expressão de TRAIL-R1 ou TRAIL-R2 (S5 Fig), indicando que a actividade reguladora da ezrina ocorre TRAIL DISC jusante, muito provavelmente ao nível das mitocôndrias. Em apoio a esta conclusão foi a descoberta de que a activação do Bax, em resposta a 200 estimulação TRAIL ng /ml caiu de 45% para 30% em células que expressam ezrina WT ou ezrina S66D, em comparação com células falsamente transfectadas (Fig 3C), enquanto que, a activação do Bax na ezrina S66A que expressa as células atingiram cerca de 57% das células após estimulação (figura 3C).

(a) análise de imunotransferência da activação de caspase, em células SW480 que expressam quer ezrina S66A, S66D, R579A ou WT, 16 ou 6 horas após a His-TRAIL (20 ou 200 ng /ml) a estimulação, respectivamente. (B) Análise de formação de TRAIL DISC em células SW480 que expressam quer S66A, S66D, ou WT Ezrin. As células foram estimuladas com 5 ug /ml Flag-TRAIL reticulado com 10 ug /ml de anticorpo anti-Flag (M2). Após a lise celular, o disco foi imunoprecipitada e analisados ​​por Western blot. (C) Análise da activação Bax. Ezrin S66A, S66D, WT e células SW480 falsamente infectadas foram deixadas sem tratamento ou estimuladas com His-TRAIL (20 ou 200 ng /ml) durante 16 h, em seguida, permeabilizadas e coradas com um anticorpo que reconhece Bax activo antes da análise por citometria de fluxo. O efeito de duas concentrações diferentes de TRAIL (20 ou 200 ng /ml, linhas cinzentas e pretas, respectivamente) foram comparadas com células não estimuladas (Gray curva a cheio). A percentagem de células contendo o Bax activo após estimulação TRAIL é mostrado (valor superior e inferior, respectivamente).

regulação Ezrin TRAIL mediada está associada com WWOX

A proteína quinase A tem sido mostrado mediar a fosforilação de serina na ezrina 66 [20]. Tal como forscolina, um activador da PKA, TRAIL induziu activação de PKA, PKC, mas também, conforme evidenciado utilizando anticorpos que reconhecem a PKA e PKC substratos (Fig 4A e 4B). Consistente com a activação de PKA, a fosforilação de CREB em serina 133 aumento da dose e forma dependente do tempo nestas células (FIG 4B), e a modulação farmacológica de PKA em células SW480 phenocopied a regulação da apoptose induzida por TRAIL pelos mutantes S66 Ezrin (Fig 4C e 4D). Da mesma forma, a inibição da PKA, por utilização do inibidor de H89, imitado os efeitos da expressão ezrina S66A, embora numa medida menor, e aumento da apoptose induzida por TRAIL, enquanto que a activação de PKA usando forscolina ou 8-Bromoadenosine 3 ‘, 5’- monofosfato cíclico (8B), reduziu a apoptose induzida por TRAIL em células SW480 (Fig 4C e 4D). Deve-se notar aqui que, de acordo com os resultados obtidos com a ezrina serina 66 mutantes de fosforilação e a sua forte capacidade para desencadear a activação de PKA (Figura 4B), a morte celular induzida por ligando Fas, ao contrário do TRAIL, não foi significativamente alterada pela reguladores farmacológicas PKA (Fig 4C e S6 figura). a fosforilação induzida por PKA de ezrina em S66 foi mostrado para regular a sua interacção com WWOX (WW-oxidorredutase que contém o domínio) [26], uma proteína supressora de tumor [27] que regula a apoptose induzida ao nível mitocondrial [28]. Curiosamente, enquanto que ambas as linhas de células de carcinoma do cólon SW480 e HCT116 expressar WWOX, duas linhas de células pancreáticas, MIA PaCa-2 e PANC-1, bem como a linha celular de cancro de fígado SK-HEP-1 (Figura 5A) não, e a expressão ectópica de peso Ezrin no MIA PaCa-2 ou SK-HEP-1 falhou para regular a apoptose induzida por FasL ou TRAIL (Fig 5B). Além disso, nem S66A nem S66D Ezrin mutantes, que por SW480 células exibem o fenótipo regulatório mais marcante, a apoptose induzida por TRAIL modulada (Fig 5C). Por outro lado, WWOX silenciamento inibiu a apoptose induzida por TRAIL em ambos Mock e S66A SW480 células que expressam, mas não em células que expressam S66D (Figura 5D). Estes resultados sugerem que o impacto da ezrina na apoptose induzida pelo receptor de morte é provavelmente indirecta, e que a regulação da ezrina fosforilação em serina 66 pela PKA é susceptível de atingir WWOX potencial pro-apoptótica, explicando pelo menos na capacidade parte da ezrina para controlar a apoptose induzida por receptores de morte.

células SW480 parental (a) foram estimuladas durante 30 minutos com forscolina e extractos celulares foram analisados ​​por imunotransf erência utilizando anticorpos selectivos PKA ou PKC substrato, bem como um anticorpo anti-fosfo CREB-S133. (B) As células SW480 parentais foram analisados ​​como acima, após a estimulação com TRAIL ou FasL, como indicado, durante 15 a 120 minutos. (C) As células SW480 parentais foram pré-tratados ou não durante 30 minutos com concentrações indicadas de forscolina, seguido por 6 horas de estimulação com 100 ou 500 de FasL ng /ml de TRAIL ou. A apoptose foi quantificada por coloração Hoechst. (D) As células SW480 parentais foram pré-tratados ou não durante 30 minutos com 100 pM H89 ou 20 minutos com 8B 4 mM, seguido por 6 horas de estimulação com 100 ou 500 de TRAIL ng /ml. (C e D) Os dados representam a média ± DP de pelo menos três experiências diferentes. (** P 0,01; *** P 0,001 respectiva para controlar ou H89 células estimuladas; ns representa não estatisticamente relevante)

(A) os níveis de expressão WWOX em linhas celulares indicadas foram analisados. por immunoblot. Hsc70 foi utilizado aqui como um controlo de carga. (B) de VSV-ezrina WT foi expresso ectopicamente em células deficientes em WWOX SK-HEP-1 e MIA PaCa-2. Os níveis de expressão foram analisados ​​por imunotransferência e a apoptose nas linhas celulares correspondentes após FasL (100 ng /ml) ou TRAIL (500 ng /ml) a estimulação foi analisado por coloração Hoechst. mutantes (C) S66A e S66D Ezrin foram expressos em MIA PaCa-2. Os níveis de expressão foram analisados ​​por imunotransf erência como anteriormente e a sensibilidade das células à morte celular induzida por TRAIL foi quantificada por azul de metileno. células (D) SW480 que expressam quer ezrina em peso ou ezrina S66A ou S66D foram transfectadas com precipitação (SCR) ou WWOX (WOXX) SI-ARN durante 4 horas e sensibilidade à apoptose induzida por TRAIL foi quantificado por coloração Hoechst. Os dados representam a média ± DP de pelo menos três experiências diferentes. (** P 0,01; * P 0,05 respectiva às células transfectadas Scr siRNA; ns representa não estatisticamente relevante).

Discussão

Embora a contribuição da Ezrin na sinalização Fas tem sido extensivamente estudada, pouco se sabe sobre TRAIL, com a excepção de um estudo recente em que a ezrina foi proposto para prejudicar tanto a morte celular induzida pelo ligando do e-TRAIL Fas na linha celular de linfoma de células T tumor H9 [14]. Nesse estudo, a ezrina foi sugerido para inibir a morte celular mediada por receptores de morte em células tipo I, que são independentes da via mitocondrial, mas não em células tipo II [14] que contar com as mitocôndrias [29]. Em nossas mãos, função reguladora negativa de Ezrin não era estritamente restrito ao tipo I de células, uma vez que a morte celular ligando- e induzida por TRAIL Fas foram inibidos por superexpressão Ezrin tanto em SW480 e em células HCT116, considerados como tipo I e tipo II, respectivamente.

Ezrin-regulação mediada por morte celular induzida por TRAIL foi nem ligadas às mudanças no recrutamento componente TRAIL DISC nem para diferencial activação de caspases iniciadoras dentro do disco, incluindo caspase-8.