Abstract

Fundo

O cancro do pulmão é a causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. O objetivo deste estudo foi investigar a associação de cinco polimorfismos extensivamente estudadas em

PTGS2

(rs689466, rs5275, rs20417) e

CYP2E1

(rs2031920, rs6413432) genes com o risco de câncer de pulmão em uma grande população chinesa nordeste.

Metodologia /Principais achados

Este é um estudo de caso-controle de base hospitalar envolvendo 684 pacientes com câncer de pulmão e 604 controles sem câncer. A genotipagem foi realizada utilizando o método de PCR-LDR. Os dados foram analisados ​​usando programas Haplo.stats e MDR. Houve diferenças significativas entre pacientes e controles em distribuições de alelos /genótipos de rs5275 (

P

= 0,002 /0,003) e rs6413432 (

P

= 0,037 /0,044), bem como nas distribuições de genótipos de rs689466 (

P

= 0,02). O risco de câncer de pulmão associado com o alelo mutante rs5275-C foi reduzido em 60% (IC 95% [intervalo de confiança]: ,21-,74;

P

= 0,004), sob o modelo recessivo. Portadores de rs689466-G alelo mutante tinha um 28% (IC 95%: 0,57-,92;

P

= 0,008) redução do risco de desenvolver câncer de pulmão em relação aos portadores do genótipo AA. Na análise de haplótipos, GCCT haplótipo (em ordem de rs689466, rs5275, rs2031920 e rs6413432) diminuiu as chances de câncer de pulmão em 28% (IC 95%: 0,51-0,93;

P

= 0,019) após o ajuste para fatores de confusão fatores, enquanto ATTT haplótipo teve 1,49 vezes (IC 95%: 1,21-1,79;

P

= 0,012) aumento do risco de cancro do pulmão. Usando o método MDR, foi identificado o melhor modelo global, incluindo rs5275, rs689466 e rs6413432 polimorfismos com uma precisão de teste máximo de 66,1% e uma consistência de validação cruzada máxima de 10 dos 10 (

P

= 0,003).

conclusões /Significado

Nossos resultados demonstraram uma associação potencialmente sinérgica de

PTGS2

e

CYP2E1

polimorfismos com a causa subjacente de câncer de pulmão, no nordeste chinês.

Citation: Guo S, Li X, Gao M, Kong H, Li Y, Gu M, et al. (2012) Synergistic Associação de PTGS2 e CYP2E1 polimorfismos genéticos com Lung Cancer Risk em chinês Northeastern. PLoS ONE 7 (6): e39814. doi: 10.1371 /journal.pone.0039814

editor: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 14 Março, 2012; Aceito: 27 de maio de 2012; Publicação: 25 de junho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Guo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Shanghai Levante Star Program (11QA1405500) e da National Science Foundation Natural da China (30.900.808). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. A redução do consumo de tabaco é atualmente a principal estratégia para reduzir a incidência do cancro do pulmão. No entanto, a identificação de genes envolvidos na causa da doença pode contribuir para descobrir os mecanismos subjacentes e levar a uma estratégia de prevenção abrangente, bem como terapia-alvo [1]. Alguns indivíduos são mais suscetíveis ao câncer de pulmão do que outros e conhecimento para a explicação para esta divergência inter-individual na susceptibilidade é importante para fins de desenvolvimento de métodos que podem predizer o risco [2]. Embora variantes genéticas comuns envolvidas no câncer de pulmão foram identificadas por estudos de associação do genoma, informação detalhada sobre os fatores genéticos continua a ser elucidado. Parece que raros variantes genéticas são provavelmente responsáveis ​​pela maior parte da susceptibilidade individual [1]. A abordagem do gene candidato, que lida com genes previamente identificados que são pensados ​​para participar da fisiopatologia da doença, ainda é empregado como um instrumento útil.

Neste estudo COX-2 (PTGS2) e citocromo P450, família 2, E subfamília, um polipéptido (CYP2E1) foram seleccionados como genes candidatos sensíveis ao cancro do pulmão com base no seu envolvimento crítica no mecanismo da carcinogénese do pulmão [3], [4].

PTGS2

é um gene altamente indutível, activado por citocinas, factores de crescimento, oncogenes e carcinogénios químicos [5]. Os estudos funcionais sugerem que PTGS2 desempenha um papel na carcinogénese e é sobre-expressa em muitos tumores malignos humanos [6], [7], especialmente no adenocarcinoma do pulmão e carcinoma de células escamosas [8], [9]. CYP2E1 é uma enzima etanol- e drogas metabolismo que pode ativar pró-carcinogéneos e hepatotóxicas, e gerar espécies reativas de oxigênio [10], [11]. Além disso, CYP2E1 pode ativar carcinogênicos para humanos, incluindo benzeno e N-nitrosaminas encontrado na fumaça do cigarro [12], [13]. Devido a estas funções importantes, genes PTGS2 e CYP2E1 foram investigados como candidatos lógicos para suscetibilidade ao câncer de pulmão

Muitos estudos avaliaram a associação de polimorfismos em genes PTGS2 e CYP2E1 com cancro do pulmão.; no entanto, os resultados têm sido inconsistentes, e os efeitos biológicos com base em raciocínio estatístico ainda são tímidas. Dada a importância das divergências étnicas nos efeitos genéticos em doenças complexas e ao facto de marcadores genéticos para associações gene da doença propostos variam de frequência entre as populações, foram avaliadas cinco polimorfismos estudados extensivamente em

PTGS2

(rs689466, rs5275 , rs20417) e

CYP2E1

(rs2031920, rs6413432) genes em uma grande população chinesa nordeste de examinar as suas associações, tanto individualmente como em combinação, com o risco de câncer de pulmão.

Métodos

população do estudo

Este foi um estudo de caso-controle de base hospitalar envolvendo um total de 1286 indivíduos do nordeste da China (cidade de Harbin, província de Heilongjiang). Todos os pacientes eram residentes locais de Han descida. Havia população do estudo incluiu 684 pacientes clinicamente diagnosticados como câncer de pulmão e 602 controles sem câncer da mesma idade. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Médica Harbin o, e conduzida de acordo com a Declaração de Princípios de Helsínquia. Todos os indivíduos assinaram o consentimento informado por escrito.

Os critérios de diagnóstico e características demográficas

O câncer de pulmão foi diagnosticado pela radiografia do tórax e, ou tomografia computadorizada de alta resolução (TC) ou reforçada TC ou PET-CT e foi patologicamente confirmado pela biópsia. subtipos clínicos de cancro do pulmão consistiu de câncer de células escamosas, o adenocarcinoma, o câncer de pequenas células e câncer de pulmão não especificado. Idade e sexo foram registrados quando os indivíduos foram recrutados. peso corporal em quilogramas ea altura em metros foram medidos para calcular o índice de massa corporal (IMC, kg /m

2). O status de tabagismo e consumo de álcool foi definido no momento da pesquisa. O tabagismo foi classificado como nunca, jamais, ou tabagismo atual (pelo menos um cigarro por dia). Beber foi categorizado como nunca, nunca ou beber atual. Aqui, potável corrente referida, pelo menos, o consumo de uma bebida alcoólica, durante os últimos 30 dias.

A genotipagem

As amostras de sangue (2 ml) foram recolhidas e o ADN genómico foi extraído de células brancas do sangue usando o TIANamp sangue DNA Kit (Tiangen Biotect [Pequim] Co., LTD). A genotipagem foi realizada utilizando o método de PCR-LDR (reacções de detecção de ligase) por sistema ABI 9600 (Applied Biosystems, USA) [14]. Os parâmetros de ciclagem foram como a seguir: 94 ° C durante 2 min; 35 ciclos de 94 ° C durante 15 s; 60 ° C durante 15 s; 72 ° C durante 30 s; e um passo de extensão final a 72 ° C durante 5 min. Para cada polimorfismo, duas sondas específicas para discriminar as bases específicas e uma sonda comum foram sintetizados. A sonda comum foi marcado na extremidade 3 ‘com 6-carboxi-fluoresceína e fosforilado na extremidade 5’. As condições de reacção de LDR foram: 94 ° C durante 2 min, 20 ciclos de 94 ° C durante 30 s e 60 ° C durante 3 min. Após a reacção, produtos de reacção de 1 mL LDR foram misturados com uma referência passiva e um tampão de carga uL uL ROX, e depois desnaturadas a 95 ° C durante 3 minutos, e arrefeceu-se rapidamente em água com gelo. Os produtos fluorescentes de LDR foram diferenciadas com ABI sequenciador 377 (Applied Biosystems, EUA).

A análise estatística

As comparações entre pacientes com câncer de pulmão e os controles foram realizados pelo teste t não pareado para variáveis ​​contínuas e por χ

2 de teste para as variáveis ​​categóricas. Para evitar erros de genotipagem bruta, todos os polimorfismos Foi examinada a coerência com Hardy-Weinberg em uma tabela de contingência de observados versus preditos freqüências genotípicas usando Pearson χ

2 ou teste exato de Fisher. Genótipos foram comparados por análise de regressão logística com base em hipóteses de aditivo, os modelos dominantes e recessivos de herança, respectivamente. A significância estatística foi definida como

P

. 0,05

frequências dos haplótipos foram estimadas usando o programa haplo.em, e odds ratio (RUP) e 95% de intervalo de confiança (IC) foram estimados por haplo.cc e programas haplo.glm de acordo com um modelo linear generalizado [15]. Além disso, o haplo.score foi usada para modelar o fenótipo de um indivíduo como uma função de cada haplótipo inferido, que foi ponderada pela sua probabilidade estimada em ambiguidade haplótipo. O haplo.em, haplo.glm e haplo.score foram implementados utilizando o software Haplo.stats (versão 1.4.0), desenvolvido pela linguagem R (https://www.r-project.org/). poder do estudo foi calculado usando PS (Power e cálculos do tamanho da amostra) software (versão 3.0).

Análise de Interação foi realizado no software MDR-fonte aberto (versão 2.0) (www.epistasis.org) [16] , [17]. Todas as possíveis combinações de um a quatro polimorfismos foram construídos usando a indução construtiva MDR. Em seguida, um classificador de Bayes no contexto de 10 vezes de validação cruzada foi utilizado para avaliar a precisão de teste de cada um melhor modelo. A única melhor modelo teve precisão testes máxima e consistência de validação cruzada, que mede o número de vezes de 10 divisões de dados que o melhor modelo foi encontrado. A significância estatística foi avaliada utilizando um teste de permutação de 1000 vezes para comparar precisões de avaliação observados com aqueles esperados sob a hipótese nula de associação nula. testes de permutação corrige para testes múltiplos repetindo toda a análise em 1000 conjuntos de dados que são consistentes com a hipótese nula.

Resultados

As características basais

Os dados demográficos e fatores de risco na população do estudo estão resumidos na Tabela 1. Casos e controles foram bem pareados por idade. sexo masculino, fumar, beber e maior nível de IMC foram associados com risco aumentado para câncer de pulmão. Entre todos os pacientes com câncer de pulmão, o subtipo de adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, câncer de pequenas células e câncer não especificado foi responsável por 37,54%, 32,26%, 20,83% e 9,38%, respectivamente.

Single- análise lócus

no que respeita ao rs20417, a frequência de homozigoto mutante foi zero nesta população de estudo, embora a sua freqüência do alelo menor foi estimada em 7% em Pequim chineses han, e 41% em nigerianos (banco de dados HapMap). As distribuições genotípicas dos outros quatro polimorfismos seguido Hardy-Weinberg em grupos de controlo (

P Art 0,05). Como mostrado na Tabela 2, foi observada diferença significativa entre os pacientes com câncer de pulmão e os controles nas distribuições alélicas e genotípicas de rs5275 (P

alelo = 0,002 e P

genótipo = 0,003) e rs6413432 (P

alelo = 0,037 e P

genótipo = 0,044) e nas distribuições de genótipos de rs689466 (P = 0,02). Com base no cálculo de potência, o presente estudo de 684 pacientes e 602 controles teve 83,8% de potência para detectar uma associação significativa para rs5275.

Notavelmente, por rs5275, o risco associado ao alelo mutante ou genótipo foi diminuída em 27% (IC 95%: 0,6-0,9;

P

= 0,002), sob o modelo aditivo, em 25% (IC 95%: 0,59-,95;

P

= 0,017), sob o modelo dominante, e em 60% (IC 95%: 0,21-0,74;

P

= 0,004), sob o modelo recessivo. No que respeita à rs689466, portadores do alelo G mutante tinha um 28% menor risco de desenvolver câncer de pulmão (95% CI: 0,57-0,92;

P

= 0,008) em comparação com os portadores de AA (Tabela 2). Uma diferença significativa foi identificada para rs6413432 em associação com o câncer de pulmão sob o aditivo (OR = 0,82; IC 95%: 0,68-0,99;

P

= 0,042) e dominante (OR = 0,75; IC 95%: 0,6 -0.95;

P

= 0,016) modelos. Nenhuma associação significativa foi detectada para rs2031920 no âmbito dos três modelos genéticos.

genótipo-fenótipo análise

Tendo em conta as diferenças nas características antropométricas entre pacientes e controles de câncer de pulmão, era de interesse para investigar sua correlação com os polimorfismos estudados. Observamos associação significativa entre rs5275 e sexo (χ

2 = 6,07;

P

= 0,048), bem como uma associação limítrofe de rs5275 com o tabagismo (χ

2 = 5,16;

P

= 0,066). Não houve associação significativa de outros polimorfismos com características antropométricas (dados não mostrados).

análise de haplótipos

frequências dos haplótipos dos quatro polimorfismos analisados ​​foram estimados e comparados entre casos e controles (Tabela 3) . A frequência de ATTT haplótipo (em ordem de rs689466, rs5275, rs2031920 e rs6413432) foi significativamente maior (

P

= 0,02) nos pacientes do que nos controles após a correção estatística, enquanto que a frequência de haplótipos GCCT foi significativamente menor (

P

= 0,034) nos pacientes. Depois de atribuir a mais comum ATCT haplótipo como referência, haplótipo GCCT diminuiu as chances de câncer de pulmão em 28% (IC 95%: 0,51-,93;

P

= 0,019, poder do estudo = 97,7%) após ajuste para idade , sexo, fumar e beber. Em contraste, haplótipo ATTT tinha um 1,49 vezes. (IC 95%: 1,21-1,79;

P

= 0,012, poder do estudo: 82,1%) aumento do risco

Interação análise

Uma análise exaustiva MDR que avaliou todas as combinações possíveis de quatro polimorfismos estudados estão resumidos na Tabela 4. Cada melhor modelo foi acompanhado com a sua precisão de testes, a consistência de validação cruzada e nível significativo, conforme determinado pelo teste de permutação. O global melhor modelo MDR incluídos rs5275, rs689466, e polimorfismos rs6413432. Este modelo tinha uma precisão de teste máximo de 66,1% e uma consistência de validação cruzada máxima de 10 de 10. Este modelo foi significativa no nível de 0,003, indicando que um modelo tão bom ou melhor foi observada apenas por três vezes em 1000 permutações e foi assim improvável sob a hipótese nula de associação nula.

Discussão

neste estudo, encontraram associações significativas de

PTGS2

e

CYP2E1

polimorfismos com a susceptibilidade ao câncer de pulmão em chinês do nordeste. Além disso, como implicado por haplótipo e interação análises, encontramos efeito potencialmente sinérgico entre estes dois genes, o que reforça os resultados de um único lócus e contribui para a suscetibilidade forte para câncer de pulmão. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo de caso-controle que investiga o efeito conjunto da

PTGS2

e

CYP2E1

genes no câncer de pulmão.

Embora a abordagem do gene candidato não pode substituir o estudo de associação do genoma em desvendar a genética de características complexas, continua a ser uma estratégia alternativa importante, particularmente no contexto de tamanhos adequados de amostras, populações homogêneas étnicos e evidências biológicas sólida dos genes em causa. Para gerar dados sólidos, tem sido proposto que um grande tamanho da amostra que envolve 1000 indivíduos em cada grupo é necessário [18]. Apesar de que apenas 684 pacientes e 602 controles foram incluídos neste estudo, tendo em vista grande divergência nas distribuições genéticos, um cálculo de potência priori indicou que este estudo teve 80% de poder para detectar o loci do tamanho do efeito realista. Além disso, nossos sujeitos do estudo foram etnicamente homogêneos residentes e locais da cidade de Harbin, um site onde a prevalência de câncer de pulmão é relativamente alto provavelmente por causa da poluição do ar interior dos sem ventilação fogões a carvão [19]. Além disso, genótipos de polimorfismos estudados estavam em Hardy-Weinberg nos controles, sugerindo que os resultados não são susceptíveis de ser tendencioso por erros de genotipagem ou estratificação populacional. Além disso, a selecção de genes e polimorfismos baseou-se indicações biológicos, genéticos e epidemiológicos fortes [20] – [23]. No entanto, considerando a complexidade do câncer de pulmão, os nossos resultados preliminares devem ser consideradas como hipóteses que precisam ser testados em maiores estudos bem desenhados.

Recentemente, vários meta-análises globais têm resumiu os resultados individuais em

PTGS2 Comprar e

CYP2E1

genes e confirmou o efeito significativamente protetora de rs5275, rs2031920 e rs6413432 alelos mutantes sobre o câncer de pulmão [4], [24], [25]. No presente estudo, identificamos que os portadores de alelos mutantes de rs689466, rs5275 e rs2031920 foram em notavelmente risco para o câncer pulmonar reduzida. Para expandir os achados, relatou um potencial sinergismo entre

PTGS2

e

CYP2E1

genes sobre o risco de cancro do pulmão, tal como reflectido pelo haplótipo e interação analisa. Apesar da associação marginal de rs6413432 em análise de loco único, em comparação com ATTA haplótipo (a fim de rs689466, rs5275, rs2031920 e rs6413432), a magnitude de risco associado com ATTT haplotipo foi notavelmente aumentada e foi independente dos factores de risco tradicionais, demonstrando uma contribuição de rs6413432-T alelo de suscetibilidade ao câncer de pulmão. No entanto, na presença de rs689466-G e C-rs5275 alelos, o papel que conferem risco de alelo rs6413432-T foi marcadamente atenuada mostrando um risco reduzido de 28% para o haplótipo em G-C-C-T. Utilizando o método de MDR, que é não-paramétrico e geneticamente no projeto [26] livre de modelo, construímos o melhor modelo global abrangendo polimorfismos rs5275, rs689466 e rs6413432 com fortes efeitos sinérgicos. Uma vez que o mecanismo fisiopatológico subjacente a tal interação é ainda desconhecido, especula-se que

PTGS2

e

CYP2E1

genes podem interagir uns com os outros a desempenhar um papel na carcinogênese de pulmão. Além disso, considerando os perfis genéticos divergentes, tais como os rs20417 não mutado na população estudada, é necessário estabelecer um banco de dados independente de marcadores genéticos para câncer de pulmão em cada grupo étnico. Além disso, os dados de genotipagem do

PTGS2

e

CYP2E1

genes, incorporando a estratégia analítica haplótipo e sinergismo facilitaria a identificação de indivíduos com alto risco de desenvolver câncer de pulmão no futuro triagem clínica.

Algumas limitações devem ser consideradas na interpretação dos resultados. Primeiro, o desenho transversal deste estudo podem impedir comentários sobre a causalidade, e um viés de sobrevivência não pode ser excluída. Em segundo lugar, temos apenas focada em cinco polimorfismos em

PTGS2

e

CYP2E1

genes e não cobrem toda a sequências genómicas dos genes e, assim, podemos sub-avaliar os efeitos genéticos de outra genética marcadores, Terceiro, os dados sobre os níveis circulantes de PTGS2 e CYP2E1 estão indisponíveis, o que nos torna incapazes de comparar os níveis entre os genótipos. A análise imunocitoquímica de expressão PTGS2 está em curso para detectar qualquer associação genótipo-fenótipo [27]. Em quarto lugar, o tamanho da amostra deste estudo foi relativamente pequeno de tal forma que nossos achados precisam ser validados em uma população maior.

Em suma, nossos resultados demonstraram um efeito potencialmente sinérgica entre

PTGS2 Comprar e

CYP2E1

genes sobre a causa subjacente de câncer de pulmão, no nordeste chinês. Além disso, este estudo deixa em aberto a questão de perfis genéticos divergentes entre diferentes grupos étnicos. Este estudo fornece evidências de apoio para uma investigação mais aprofundada sobre os mecanismos fisiopatológicos da

PTGS2

e

CYP2E1

genes no câncer de pulmão.