Abstract

Fundo

O câncer gástrico continua a ser um dos cancros mais mortais do mundo e, portanto, a identificação de novas drogas que alvejam este tipo de câncer é, portanto, uma importância significativa. O objetivo deste estudo foi identificar e validar um agente terapêutico que pode melhorar os resultados para pacientes com câncer gástrico no futuro.

Metodologia /Principais Achados

Usando a tecnologia de microarray, geramos um gene perfil de expressão de genes específicos de cancro gástrico humano a partir de amostras de tecido de cancro gástrico humano. Usamos este perfil na análise Conectividade Mapa do Instituto Broad para identificar compostos terapêuticos candidatos para o câncer gástrico. Nós encontramos o vorinostat inibidor da histona deacetilase como o composto de chumbo e, portanto, um potencial de drogas terapêuticas para o câncer gástrico. Vorinostat induzida tanto apoptose e autofagia em linhas celulares de cancro gástrico. A inibição farmacológica e genética de autofagia No entanto, o aumento da eficácia terapêutica de vorinostat, indicando que uma combinação de vorinostat com inibidores autophagy podem terapeuticamente ser mais benéfico. Além disso, a análise do cancro gástrico expressão do gene identificado um conjunto de genes (

ITGB5, Tyms, MYB, APOC1, CBX5, PLA2G2A,

e

KIF20A

) cuja expressão foi elevada em tecido de tumor gástrico e downregulated mais do que duas vezes por tratamento vorinostat em linhas celulares de cancro gástrico. Em contraste,

SCGB2A1, TCN1, CFD, APLP1,

e

NQO1

manifesta um padrão invertido.

Conclusões /Significado

Nós mostramos que a análise de gene assinatura de expressão pode representar uma abordagem emergente para descobrir agentes terapêuticos para o câncer gástrico, como vorinostat. A observação da expressão do gene alterado após o tratamento vorinostat pode fornecer a pista para identificar o mecanismo molecular de vorinostat e aqueles pacientes susceptíveis de beneficiar do tratamento vorinostat

Citation:. Claerhout S, Lim JY, Choi W, Parque YY, Kim K, SB Kim, et ai. (2011) Gene Expression Assinatura análise identifica Vorinostat como uma terapia Candidato para o cancro gástrico. PLoS ONE 6 (9): e24662. doi: 10.1371 /journal.pone.0024662

Autor: David L. McCormick, Instituto de Pesquisa IIT, Estados Unidos da América

Recebido: 29 de março de 2011; Aceito: 16 de agosto de 2011; Publicação: 09 de setembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Claerhout et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Financiamento para SC como um Odyssey Fellow foi apoiado pelo Programa Odyssey eo Theodore N. Lei Endowment for realização científica da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center. Este trabalho também foi apoiado por fundos do Internal Medicine Research Fund 2009 Acadêmico e Programa de Pesquisa em Ciência Básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia financiados pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (No. 2010-0.024.248). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é o quarto tipo de câncer mais comum ea segunda causa de morte por câncer no mundo [1], com uma sobrevida global de cerca de 10 meses [2] – [4]. O tratamento para o cancro gástrico podem incluir quimioterapia, cirurgia e terapia de radiação. Infelizmente, os tratamentos atuais baseados em quimioterapia para câncer gástrico avançado demonstram resultados decepcionantes [2] – [4]. Na verdade, remissão completa são raros ou só duram muito em breve.

Vários agentes direcionados que conferem vantagens de sobrevivência em outros tipos de câncer têm sido objecto de investigação no cancro gástrico. Embora alguns estudos clínicos iniciais utilizando receptor de factor de crescimento endotelial vascular (VEGFR) e receptor do factor de crescimento epitelial (EGFR) -1 inibidores, tais como o cetuximab e bevacizumab, têm mostrado actividade um pouco, raramente existe um real benefício de sobrevivência para os pacientes [5] , [6]. Uma das razões pode ser que esses estudos não selecionou pacientes de acordo com a presença de biomarcadores. Recentemente, o Trastuzumab para o cancro julgamento gástrica (ToGA) observou que a adição de trastuzumab à quimioterapia levou a uma melhoria estatisticamente significativa na sobrevida livre de progressão (PFS) e sobrevida global (OS) dos cerca de 20% dos pacientes com disseminada gástrica e gastroesofágico (GE) tumores que sobre-expressam HER2 junção [7]. Isso enfatiza a necessidade de terapia biológica alvo ea busca de biomarcadores para selecionar pacientes para ensaios clínicos que podem beneficiar a sobrevivência. Apesar de algumas evidências de alvos potenciais, incluindo a [8] HER2, [9], a eficácia destas terapias orientadas biologicamente não é conhecido e existe uma falta de uma terapia alvo padrão para o cancro gástrico. Devido à heterogeneidade biológica dos cancros gástricos, não é provável que haja uma única cura “bala mágica”. Os marcadores moleculares será, portanto, importante no futuro para prever os resultados dos pacientes e tratamentos de confecção de acordo com a biologia individual.

Na busca de biomarcadores, análise de expressão gênica assinatura tem sido utilizado em diversas aplicações, tais como para elucidar a mecanismos de caminhos biológicos [10], classificando subtipos de uma doença [11], a previsão de prognóstico do câncer [12] e de perfis de expressão gênica em resposta a drogas específicas [13], [14]. Gene análise de assinatura de expressão pode ser feito por meio da conectividade Mapa do Broad Institute (https://www.broadinstitute.org/cmap). O Mapa de Conectividade tem como objetivo gerar um mapa que liga os padrões de expressão de genes associados à doença para os padrões correspondentes produzidas pela droga candidatos e manipulações genéticas [15], [16]. Esta abordagem permite que sistemas compostos a serem protegidos contra as assinaturas de doenças de todo o genoma, ao invés de um conjunto pré-selecionado de genes alvo. Drogas estão emparelhados com doenças utilizando métodos sofisticados de correspondência de padrões com um alto nível de resolução e especificidade. Embora ele deixa muitas questões em aberto, o mapa de conectividade tem mostrado que a análise de assinatura genômica pode ser usado para reconhecer fármacos com mecanismos comuns de ações, descobrir mecanismos desconhecidos de ação e identificar potenciais novas terapias [15], [16].

o objetivo deste estudo foi identificar potenciais novas terapias para o tratamento do câncer gástrico. Para fazer isso, analisamos primeiro a assinatura genômica do câncer gástrico humano. A assinatura gene câncer gástrico resultante foi depois usado

in silico

empregando análise Conectividade Mapa para identificar agentes terapêuticos que poderiam ser potencialmente eficaz contra este tipo de câncer. Nós validado ainda mais a topo direccionamento de drogas para a sua eficácia em linhas celulares de cancro gástrico. Descobrimos que vorinostat, como uma nova droga potencial, tanto a apoptose induzida e autofagia em células cancerosas gástricas. Em conjunto, este estudo demonstra que a análise de conectividade mapa pode ser utilizado para a identificação de agentes terapêuticos que podem ser bem sucedido no tratamento de um subconjunto de cancros gástricos.

Métodos

Análise dos dados de microarray

Para a análise Conectividade Mapa, foram utilizados os dados de microarray de 65 pacientes com câncer gástrico, incluindo 65 tipos de câncer e 19 tecidos gástricos normais, que foram obtidos a partir de nosso trabalho anterior, os dados da Yonsei [17]. tumor espécimes foram coletados de pacientes com câncer gástrico submetidos a gastrectomia como tratamento primário. As amostras de tecidos foram examinados por patologistas no momento da recolha e armazenado em -80 ° C a um banco de tecidos, até o início da experiência. O ARN total foi extraído dos tecidos fresco congelado usando um kit de marcação de ARN isolamento miRvana (Ambion, Inc.). dados microarray primária está disponível na expressão de NCBI Gene Omnibus base de dados pública (plataforma de microarray, GPL6884; dados de microarray, GSE 13861). Outro perfil de expressão gênica foi obtida a partir de 69 amostras de tecido gástrico, incluindo 38 cancro e 31 de estroma não câncer, do Banco de Dados de Stanford Microarray (https://smd.stanford.edu, GSE13911), os dados de Stanford. genes específicos do câncer gástrico foram selecionados por BRB-ArrayTools versão 3.6.1 (Biometric Research Branch, National Cancer Institute, Bethesda, MD). comparação de classe usando duas amostras teste t (significância 0,001, 10,000 permutação aleatória) identificou genes específicos de câncer gástrico e genes cuja expressão significa intensidades foram alterados por pelo menos duas vezes em comparação a significar a expressão do gene tecido normal foram selecionados

.

Conectividade Mapa análise

Para identificar potenciais drogas que alvejam câncer gástrico, as listas de genes de top 500 até regulamentada e o topo 500 genes baixo regulados a partir dos genes específicos do câncer gástrico foram utilizados (Tabela S1). A análise Conectividade Mapa foi realizado por meio da interface Web (https://www.broadinstitute.org/cmap) usando versão, compilação 02, que contém mais de 7.000 perfis de expressão que representam efeitos de 1.309 compostos sobre várias células humanas cultivadas [15], [16]. O mapa de conectividade mostra as ligações funcionais entre drogas, genes e doenças. Drogas que produzem assinaturas de gene que mimetizam a doença pode ajudar a identificar caminhos que representam potenciais alvos terapêuticos para essa doença. Por outro lado, as drogas que induzem uma assinatura “inversa”, isto é, alterações na expressão do gene, numa direcção oposta à observada no estado de doença, podem representar novos agentes terapêuticos. Os agentes candidatos contra uma doença específica pode ser reconhecida através da aplicação doença perfil de expressão do gene específica para a análise de conectividade Mapa. Foram selecionados drogas candidatas para validação

in vitro

com base a pontuação conectividade, correlação e P-valor.

produtos químicos e de cultura de células

O vorinostat foi obtido de Merck e preparado como uma solução mãe em dimetilsulfóxido (DMSO). A cloroquina e bafilomicina A1 (Sigma) foram dissolvidos em DMSO e água, respectivamente. gástricas linhas celulares de cancro humano, AGS, NCI-N87, e KATO-III foram obtidas a partir da American Type Culture Collection e foram mantidos de acordo com as recomendações. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C em 5% de CO

2.

crescimento celular, viabilidade celular e ciclo ensaios

ensaio de tetrazólio -2,5-difenil (MTT)

Para o 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il), MTT foi dissolvido em PBS a 5 mg /ml. Cerca de 5 x 10

3 células foram semeadas em placas de 96 poços e deixadas fixar durante a noite. O meio de cultura foi então substituído por meio fresco contendo as concentrações indicadas de vorinostat ou DMSO. Após 72 h, adicionou-se 20 ul de solução de MTT, e as placas foram incubadas a 37 ° C durante 4 h. Após a incubação, 100 uL de DMSO foi adicionada para dissolver o formazano e a absorvância foi lida a 570 nm utilizando um leitor espectrofotométrico de microplacas (Vmax leitor de microplacas cinético, Molecular Devices). As experiências foram feitas em triplicado.

Para a coloração de violeta de cristal, as células foram tratadas durante 12 h, o meio foi removido, e as células foram lavadas com PBS e depois incubadas durante 30 min com 0,5% de violeta de cristal (em 20% de metanol e 80% de água bidestilada). As células foram então lavadas três vezes com PBS. O violeta de cristal remanescente foi extraído em ácido acético durante 5 min, e a absorvância foi medida a 595 nm utilizando um leitor de microplacas espectrofotométrico.

Para determinar a viabilidade das células, as células foram incubadas com vorinostat durante 72 h. As células aderentes foram depois destacadas das placas de cultura por tripsinização e combinadas com as células flutuantes, centrifugadas e suspensas em 500 ul de iodeto de propídio (PI) Solução -Exclusive (não penetradores de células de membrana) durante 15 min a 4 ° C. As células coradas foram monitorizadas por citometria de fluxo (Beckman Coulter Cytomics FC 500).

Para a análise do ciclo celular, as células foram incubadas com vorinostat durante 24 h, recolhido e suspenso em 500 ul de solução hipotónica (citrato de sódio 0,1%, 0,1% de Triton X-100, 100 ug /ml de RNase e 50 ug /ml de PI) durante 15 min a 4 ° C. as células marcadas com PI foram monitorados por citometria de fluxo. ciclo celular foi analisada por software multicycle AV.

isolamento de RNA e microarrays experimentos

isolamento do RNA e microarrays experimentos foram realizados de acordo com o protocolo como descrito anteriormente [17]. O ARN total foi extraído a partir de linhas celulares de cancro gástrico, com ou sem tratamento vorinostat utilizando um kit de isolamento de ARN miRvana (Ambion, TX, EUA). A integridade da fracção de ARN grande foi determinada com um Bioanalyzer Experion (Bio-Rad, CA, EUA) como um substituto para o ARNm de controlo de qualidade. O ARN total foi marcado e hibridado com HT12 humano BeadChips v.3 expressão de acordo com os protocolos do fabricante (Ilumina, CA, EUA). Após as BeadChips foram digitalizados com um BeadArray Leitor Illumina, os dados de microarranjos foram normalizados utilizando o método de normalização quantil nos modelos lineares para o pacote Microarray de dados no ambiente de língua R [18]. O nível de cada gene expressão foi transformado em um log

2 base antes de uma análise mais aprofundada. A análise de agrupamento foi feito com Cluster e Treeview [19].

análise de Western blot

As células foram raspadas em meio e girou para baixo, e as proteínas foram isoladas utilizando tampão de lise (HEPES 50 mM, 150 mM de NaCl, 1 mM de EGTA e 10 mM de pirofosfato de sódio (pH 7,4)) contendo NaF 100 mM, 10% glicerol, 1,5 mM MgCl

2, 1% de Triton X-100 e inibidores da protease (Roche). Os extractos foram incubados em gelo durante 20 min e centrifugadas a 20800 g durante 20 min. A concentração de proteína foi determinada usando o reagente de ensaio de proteínas BCA (Pierce). Quantidades iguais de proteína de cada amostra foram separados por electroforese através de SDS-PAGE e transferido para Hybond-C super membrana (Amersham Pharmacia Biotech). As membranas foram bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween-20 e 5% de leite em pó desnatado. As membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpo primário diluído em 5% de leite em pó desnatado ou 5% de BSA em 1 × solução salina mais 0,1% de Tween-20 tamponado com Tris. Foram utilizados anticorpos para LC3 (Novus Biologicals), ativa a caspase-3 (Epitomics) e p62 (BD Biosciences). Os anticorpos para ácido a-tubulina e beclin-1 foram de Cell Signaling Technology; anticorpo de beta-actina foi de Sigma. As membranas foram então lavadas e incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com anticorpo secundário conjugado com peroxidase (Cell Signaling Technology). bandas de proteína foram visualizadas utilizando quimioluminescência aumentada como descrito pelo fabricante (GE Healthcare).

siRNA transfecção

A sequência alvo siRNA para beclin-1, nontargeting siRNA (Risc Free) e Dharmafect 1 foram comprado de Dharmacon. As células foram semeadas em placas de 10 cm e transfectadas com ARNsi 24 h mais tarde de acordo com o protocolo do fabricante. No dia seguinte, as células foram tripsinizadas e semeadas em placas de 6 cm ou 96 cavidades para se obter a mesma eficácia de transfecção. os níveis de expressão da proteína foram determinadas por análise de Western blot.

Microscopia Electrónica de Transmissão

As amostras foram fixadas com uma solução contendo 3% de glutaraldeido mais 2% de paraformaldeído em tampão de cacodilato 0,1 M, pH 7,3, durante 1 hora. Após a fixação, as amostras foram lavadas e tratadas com 0,1% de cacodilato Millipore-filtrada tamponada ácido tânico, pós-fixadas com tetróxido de ósmio a 1% tamponado durante 30 min, e coradas en bloc com acetato de uranilo 1% Millipore-filtrada. As amostras foram desidratadas em concentrações crescentes de etanol, infiltraram, e incorporado em meio de LX-112. As amostras foram polimerizados num forno de 70 ° C durante 2 dias. Secções ultrafinas foram cortadas em micrótomo Leica Ultracut (Leica, Deerfield, IL), coradas com acetato de uranilo e citrato de chumbo em um stainer Leica EM, e examinadas em um microscópio eletrônico de transmissão JEM 1010 (JEOL, EUA, Inc., Peabody, MA ) a uma voltagem de aceleração de 80 kV. As imagens digitais foram obtidas utilizando AMT Imaging System (Avançada Microscopia Técnicas Corp, Danvers, MA).

Resultados

assinatura de expressão gênica do câncer gástrico

A Tabela 1 representa as características de os pacientes a partir dos dados da Yonsei [17]. cancros gástricos foram localizadas principalmente no estômago distal e fase III /IV. Usando os dados de microarranjos de expressão gênica desses pacientes, encontramos 3.360 genes específicos do tumor cuja média expressão intensidades foram alterados por, pelo menos, duas vezes comparado a dizer a expressão do gene de tecido normal (

P Art 0,001, Figura S1 ). Este conjunto de 3.360 genes (ou seja, de assinatura específico do cancro gástrico) foi usada para mais

in silico

rastreio de potenciais drogas terapêuticas para o câncer gástrico.

análise Conectividade mapa identifica drogas potenciais alvo cancer

gástrica

Para identificar potenciais drogas segmentação câncer gástrico, a assinatura específica câncer gástrico foi usado como consulta de entrada em Conectividade Mapa conforme descrito na seção “Método ‘. Nós especificamente olhou para compostos que tinham uma assinatura inversamente correlacionada com o assinatura específico do cancro gástrico e identificadas várias drogas que são resumidos na Tabela 2. A classificação dos agentes candidatos foi estabelecido com base no valor de correlação inversa e p-valor. Tabela 2 (colunas 2-4) mostra os compostos mais alto classificados a partir de dados da Yonsei. análise de conectividade Mapa revelou que histona deacetilase (HDAC), incluindo vorinostat e tricostatina A representam potenciais candidatos à segmentação câncer gástrico. O LY294002 inibidor de fosfatidilinositol-3-quinase, o trifluoperazine fenotiazina eo tanespimycin inibidor da proteína de choque térmico também foram identificados como agentes alvo candidato para o câncer gástrico. Em seguida, nós validado nossos resultados usando um conjunto independente de dados de perfil de expressão gênica de Stanford Microarray banco de dados (Tabela 2; Dados Stanford; colunas 5-7). Conectividade análise Mapa de este conjunto de dados confirmada vorinostat como o topo do ranking candidato. Em conclusão, a análise Conectividade Mapa identificados vorinostat como um potencial agente terapêutico para o câncer gástrico.

Vorinostat mostra eficácia terapêutica

in vitro

em linhas celulares de cancro gástrico

Para avaliar a eficácia terapêutica de vorinostat, avaliou-se o crescimento das linhas estabelecidas gástricas celulares de cancro (AGS, KATO-III, e NCI-N87) após 72 h de tratamento vorinostat usando ensaio de MTT. Em comparação com células não tratadas, vorinostat inibiu significativamente a viabilidade celular de uma forma dependente da dose em todas as linhas celulares de cancro gástrico (Figura 1A). Confirmou-se a redução da viabilidade celular por meio de análise do ciclo celular de células cancerosas AGS e KATO-III. Nós mostramos que o tratamento com vorinostat (5 uM) durante 24 h induziu um aumento acentuado na proporção de sub-G1 da AGS células comparado com o controlo (2,3 ± 0,07% vs 39,2 ± 0,99%, respectivamente;

P 0,01), indicando a indução de morte celular (Figura 1B). Em contraste, a proporção de sub-G1 da vorinostat tratada células KATO-III não foi afectada (Figura 1B), enquanto que a proporção de G2 /M células aumentou significativamente (21,4 ± 1,91% versus 29,3 ± 0,35%;

P

= 0,044), indicativo para a paragem do ciclo celular. Foi testada ainda a viabilidade celular utilizando PI-exclusão. Foram tratados AGS e células KATO-III com 5 uM vorinostat durante 72 h e avaliados-los por citometria de fluxo (Figura 1C). A quantidade de células mortas, que têm baixa dispersão para a frente e dispersão lateral elevada, foi significativamente aumentado nas células AGS (12,4 ± 4,3% vs. 79,4 ± 5,7%), e também em células KATO-III, em comparação com células de controlo (8,7 ± 0,6% vs. 46,8 ± 2,1%). Finalmente analisada a indução de apoptose após o tratamento vorinostat em linhas celulares de cancro gástrico AGS e KATO-III usando imunotransf erência. Vorinostat aumento da apoptose, tal como avaliado por caspase-3, a clivagem, em células AGS e, em menor extensão em células KATO-III (Figura 1D).

(A) Os ensaios de MTT foi realizada após a incubação de AGS, KATO- III, e NCI-N87 com as concentrações indicadas de vorinostat durante 72 horas. (B) Modificação do ciclo celular por vorinostat foi avaliada através de células activadas por fluorescência (FACS) de células coradas com PI tratados 5 uM vorinostat durante 24 horas. (C) o teste de viabilidade utilizando a solução exclusiva PI. células AGS e KATO-III foram tratados com vorinostat 5 mM durante 72 horas e avaliada por FACS. No gráfico representativo, as células mortas foram manifestados como pontos com baixa dispersão para a frente e dispersão lateral alta. (D) Análise Western blot da caspase-3 ativa da AGS e KATO-III células cancerosas gástricas sem ou com 5 mM tratamento vorinostat. Os lisados ​​celulares foram analisados ​​nos pontos de tempo indicados. Actina foi utilizado como um controlo de carga. *,

P Art 0,05. No gráfico de barras, os dados representam a média + SD (desvio padrão).

Em resumo, estes dados indicam que o vorinostat tem efeito antiproliferativo sobre linhas de células de cancro gástrico por indução de apoptose em células AGS e G2 /M paragem do ciclo celular em células KATO-III.

análise de expressão gênica global de linhas AGS gástricas célula cancerosa e KATO-III após o tratamento vorinostat

Para analisar o efeito do vorinostat na expressão gênica global, AGS e KATO-III células de cancro gástrico foram tratados com vorinostat 5 uM durante 48 horas e análise de microarray foi realizada. análise de agrupamento de dados de microarray não supervisionada após o tratamento vorinostat mostrou que as células AGS e KATO-III agrupado com a mesma linha de células, independentemente do tratamento vorinostat (Figura 2A). Porque autofagia foi reportado ter um papel no efeito induzido por vorinostat em outros cancros [20], [21], foi realizada análise supervisionada do conjunto de genes relacionados com a autofagia (80 e 149 sondas de genes; Tabela S2). linhas celulares de cancro gástrico tratados com vorinostat foram agrupadas (Figura 2B), indicando que a indução de autofagia é uma propriedade importante de vorinostat em linhas de câncer gástrico.

(A) de agrupamento hierárquico não supervisionado de dados de expressão gênica de AGS e KATO III antes e após o tratamento vorinostat 5 uM durante 48 horas. foram seleccionados genes com um nível de expressão que tem, pelo menos, duas vezes maior diferença em relação ao valor médio entre linhas celulares em, pelo menos, 2 matrizes para a análise de agrupamento hierárquico (3,646 características de genes). (B) Supervisionado agrupamento hierárquico com genes relacionados autofagia (149 sondas) de AGS e Kato III após o tratamento vorinostat.

A inibição da autofagia aumenta a eficácia vorinostat em células cancerosas gástricas

Tendo em conta que autofagia pode ter um papel na morte celular, tanto a sobrevivência das células do cancro e cancro após tratamento com drogas [22], [23], avaliou-se também a contribuição do presente processo para o efeito de vorinostat em linhas celulares de cancro gástrico. Nós funcionalmente avaliou este processo por análise de imunotransferência da autofagia marcadora associada a microtúbulos de proteína 1 de cadeia leve 3 (LC3). Vorinostat-tratados células KATO-III, e, em menor grau células AGS, mostrou uma clara acumulação de mais rápido-migrando forma lipidada da LC3 (LC3-II) (Figura 3A). A acumulação de LC3-II podem resultar tanto supra-regulação de formação autophagosome ou bloqueio de degradação autophagic de LC3-II [24], [25]. Por isso, analisaram células tratadas com vorinostat para a degradação de p62, um marcador de fluxo autophagic [24], e observou-se uma redução nos níveis de proteína p62 em células vorinostat tratados em comparação com o tempo de células de cancro não tratados correspondentes (Figura 3A). Além disso, co-tratamento de vorinostat com bafilomicina A1 (BafA1), um inibidor de fusão autophagosome-lisossoma, aumentou ainda mais a acumulação de LC3-II (Figura 3B), compatível com a indução de fluxo vorinostat autophagic em vez de bloquear a capacidade degradativa das autophagolysomes. microscopia electrónica (ME) é um método sensível, quantitativa e definitiva para a detecção de autofagia [24]. Consistente com os dados de Western blot, a análise mostrou que o EM vorinostat marcadamente aumentada formação autophagosome em células de AGS (Figura 4B e B?), Em comparação com células de controlo (Figura 4A e A?).

AGS (A) e Kato -III foram tratadas com 5 uM vorinostat para os pontos de tempo indicados. Os níveis de proteína p62 de LC3 e foram analisados ​​por análise de imunotransferência. Actina foi utilizado como um controlo de carga. os níveis de p62 foram medidos por meio de análise densitométrica dos western blots e em comparação com os níveis de actina. os níveis de p62 de AGS não tratadas e as células foram consideradas como KATOIII 1. (B) células de AGS foram tratadas durante 12 h com 5 uM vorinostat com ou sem 50 nM de bafilomicina A1 (BafA1). Os lisados ​​celulares foram analisados ​​por análise de imunotransferência para LC3 e actina.

Depois de 12 h de tratamento DMSO (A, A ‘) ou com 5 uM vorinostat (B, B’) (painéis da esquerda, baixa ampliação, barra de escala: 2 mm), foi realizada análise de EM. As imagens de alta ampliação de áreas em caixa com Av retratando vacúolos autofágicos (painéis esquerdos, barra de escala: 500 nm; N: núcleo, M: mitocôndrias).

Para investigar se a acumulação de autofagossomas protege as células contra o stress celular induzida por vorinostat, que inibiu o processo autofagia utilizando o inibidor de cloroquina farmacológica e pequeno ARN interferente (siRNA) contra beclin-1. A adição de cloroquina a AGS tratados com vorinostat e células KATO-III resultou num decréscimo dependente da dose na viabilidade (Figura 5A). A redução na viabilidade foi confirmada em células KATO-III tratados com beclin-1 siRNA (Figura 5B). Em conjunto, os dados sugerem que a inibição da autofagia induzida por vorinostat pode melhorar a eficácia do tratamento de células cancerosas vorinostat gástricas.

AGS (A) e KATO-III as células foram tratadas com 5 uM vorinostat e diferentes concentrações de cloroquina (CQ). A viabilidade das células foi avaliada após 12 horas, utilizando coloração com violeta de cristal e de controlo (CTR) foi estabelecida como 100%. células (B) KATO-III foram transfectadas com siRNA contra beclin 1 (siBeclin1) ou com os não-alvo Risc gratuito siRNA ou tratados com Dharmafect sozinho I (simulação). eficiência siARN foi confirmada por análise de Western blot de beclin 1 e RISC livre como um controlo. α-tubulina foi utilizada para mostrar o carregamento igual de proteínas. A viabilidade foi medida após 12 horas de tratamento vorinostat utilizando coloração com violeta de cristal. A viabilidade das células de controlo não tratado (CTR) foi estabelecida como 100%. *,

P

. 0,05

Vorinostat muda assinatura gene nas células cancerosas gástricas humanas

Para entender os efeitos do vorinostat na expressão do gene em células de câncer gástrico linhas, foi realizada a análise de microsséries de vorinostat tratada AGS e Kato-III linhas celulares de cancro gástrico (Fig. 2). Nossa análise revelou diferenças genômicas significativas entre as células cancerosas gástricas não tratados e tratados com vorinostat (AGS e KATO-III). Após o tratamento vorinostat, a expressão de genes foi aumentada de 1014 e a expressão de genes foi diminuída de 760 na linha celular de AGS. Na linha de células KATO-III, 164 genes foram para cima e 191 genes foram regulados (diferença de duas vezes;

P Art 0,001). Vorinostat alterou significativamente a expressão de genes de 140 em ambas as linhas celulares AGS e KATO-III (vorinostat assinatura gene específico). Os genes que foram mais alterados após o tratamento vorinostat foram identificados como

SPANXA1, SPANXA2, VGF, DHRS2, ENTPD8, PNPLA7, STX1A, ARRDC4, KRT13, PRPH, Neu1, TXNIP, CCK

( 4-dobrar regulamentação) e

MUC1, IFITM1, ANKRD37

( . 4-dobra para baixo-regulação)

em seguida, destina-se a identificar os candidatos biomarcador que pode prever a sensibilidade vorinostat de pacientes com câncer gástrico humano . Por isso, nós combinamos o conjunto de genes alterados em vorinostat tratada linhas celulares de cancro gástrico (assinatura gene específico vorinostat) e as duas assinaturas de câncer gástrico humano gerados a partir dos dados Yosei e Stanford usando análise de diagrama de Venn. Nós descobrimos que os níveis de expressão relativa de 12 genes foram revertidas por tratamento vorinostat (Figura 6). Destes 12 genes, 7 genes altamente expressa em tecidos de câncer gástrico foram regulada para baixo (

ITGB5

,

Tyms

,

MYB

,

APOC1

,

CBX5

,

PLA2G2A

,

KIF20A

) e 5 genes de baixa expressa foram regulados positivamente após o tratamento vorinostat (

SCGB2A1

,

TCN1

,

CFD

,

APLP1

,

NQO1

(Tabela 3).

diagrama de Venn de genes selecionados pelo teste univariada (two-amostra t-teste) foram selecionados genes para p .. 0.001 entre os grupos comparados O círculo vermelho (gene lista A) representa câncer genes específicos gástricas a partir de dados da Yonsei O círculo azul (gene lista B) representa câncer genes específicos gástricas a partir de dados de Stanford.. o círculo amarelo (lista gene C) representa assinatura gene específico vorinostat de ambos os AGS e linhas de células KATO-III (

P Art 0,001, 2 vezes mudança).

Discussão

os nossos resultados indicam que uma assinatura gástrica humana global do cancro gene pode ser útil para encontrar agentes terapêuticos que têm como alvo em vez da assinatura genómico de cancro gástrico em vez de direccionar um ou dois genes específicos. Usando o mapa de conectividade, verificou-se que os inibidores de HDAC, tais como vorinostat e tricostatina A, tinha um gene assinatura inversamente correlacionada em comparação com o assinatura gene específico do cancro gástrico e, por conseguinte, podem ser candidatos terapêuticos de chumbo para o cancro gástrico.

In vitro

avaliação da eficácia terapêutica de vorinostat revelou que este fármaco terapêutico suprimiu o crescimento de diferentes linhas celulares de cancro gástrico. Ao lado de seus efeitos antiproliferativos, vorinostat também regulada genes específicos de autofagia. A inibição da autofagia induzida por vorinostat resultou numa maior redução da viabilidade. Além disso, a análise combinada de linhas celulares de cancro gástrico tratados com vorinostat e amostras de pacientes com câncer gástrico mostrou que vorinostat alterado os limites de um conjunto de genes específicos doze câncer gástrico expressão.

Nossos resultados mostraram que HDAC inibidores, vorinostat e tricostatina a, foram os principais candidatos terapêuticos para o cancro gástrico, o que está de acordo com o conceito de que HDAC é overexpressed em tecidos com câncer gástrico [26]. Os inibidores de HDAC foram mostrados para aumentar a acetilação de histonas, afectando, portanto, a expressão do gene. Estes inibidores efeitos anticancerígenos manifestos por induzir a via de apoptose intrínseca e extrínseca [27], [28], bloqueando a angiogênese do tumor [29], e que inibem as vias de resposta ao estresse intracelular [30]. Porque os inibidores de HDAC ter efeitos globais sobre a expressão gênica, que possam afectar os processos celulares ainda não reveladas [31], [32]. Em contextos clínicos, os inibidores de HDAC foram aplicados principalmente para doenças hematológicas malignas, mas os ensaios clínicos em tumores sólidos estão em andamento. Um estudo recente, apoiando nosso

in vitro

resultados mostraram eficácia terapêutica dos inibidores de HDAC em amostras de câncer gástrico humano utilizando o ensaio de resposta à droga histocultura [33]. No entanto, ele continua a ser unrevealed se subgrupos moleculares definidos específicos podem prever a resposta ou resistência a inibidores de HDAC.