Abstract

O câncer de ovário é o câncer ginecológico exibindo a maior morbidade e melhoria dos tratamentos ainda é necessária. Estudos anteriores demonstraram que os beta-receptor de estrogênio níveis (RpE) diminuiu juntamente com a carcinogênese ovariana. Aqui, apresentamos evidências de que a reintrodução de ERP em células de cancro do ovário BG-1 epiteliais, que expressam ERa, leads

in vitro

a uma diminuição de basal e proliferação celular promoveu-estradiol. RpE reduziu a frequência de células em fase S e um aumento da de células na fase G2 /M. Ao nível molecular, verificou-se que o RpE downregulated retinoblastoma total (Rb), Rb fosforilado e o conteúdo celular de fosfo-AKT, bem como ciclinas D1 e A2. Além disso, o RpE teve um efeito directo sobre a ERa, por inibição fortemente a sua expressão e actividade, o que pode explicar parte da acção anti-proliferativa do RpE. Através do desenvolvimento de um modelo pré-clínico romance de cancro do ovário com base em um xenoenxerto luminescente ortotópico em murganhos nus atímicos, que revelou ainda que a expressão RpE reduz o crescimento do tumor e a presença de células tumorais nos locais de metástases, daí resultando no aumento da sobrevivência dos ratinhos. No seu conjunto, estes resultados revelam um potencial papel supressor de tumor do RpE na carcinogénese do ovário, o que poderia ser de relevância clínica potencial para a selecção do tratamento mais adequado para pacientes

citação:. Bossard C, Busson H, Vindrieux D, F Gaudin, Machelon V, Brigitte M, et al. (2012) papel potencial do receptor de estrogênio Beta como um supressor de tumor de epitelial cancro do ovário. PLoS ONE 7 (9): e44787. doi: 10.1371 /journal.pone.0044787

editor: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de novembro de 2011; Aceito: 13 de agosto de 2012; Publicação: 06 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Bossard et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da ARC (Association pour la Recherche contre le Cancer, Grant No. 3582) (https://www.arc-cancer.net), The Ligue Nationale contre le Cancer (http: //www.ligue-cancer .líquido). Muriel Busson foi apoiada por FRM (Fondation pour la Recherche Médicale) (https://www.frm.org). DV era um receptor da Ligue Nationale contre le Cancer. CB foi apoiado por uma bolsa HFSP (https://www.hfsp.org/). O laboratório KB é apoiado pela Agence Nationale de la Recherche (ANR, conceda número 2010 JCJC 1104 01) (https://www.agence-nationale-recherche.fr/), a Université Paris-Sud, o Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) e da Ligue Nationale Contre le Cancer (Comité Val d’Oise), e é membro do Laboratório de Excelência LERMIT (Laboratório de Excelência em Pesquisa sobre Medicamentos e inovadora Therapeutics) apoiado por uma bolsa de ANR (investissements d’Avenir). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a única camada de células epiteliais que rodeia ovários se acredita actualmente a ser uma das fontes de lesões pré-neoplásicas origem epitelial que conduzem a tumores ovarianos, que representam a grande maioria dos cancros do ovário [1]. câncer epitelial de ovário (EOC) é o sétimo tipo de câncer mais comum. No entanto, continua a ser o quarto mais mortal, porque é difícil de diagnosticar em estágios iniciais e, por conseguinte, para o tratamento de [2]. Tanto classificadas em categorias morfológicas (isto é, serosa, mucinoso, endometrióides, e células claras), com base em critérios histológicos e semelhança com componentes epiteliais do tracto reprodutivo normal, ou, mais recentemente, classificados como tumores de baixa ou de alta qualidade [2], EOC é uma doença complexa para a qual a etiologia é pouco compreendida. marcadores novos e metas para terapias são, portanto, uma necessidade urgente.

Ovário é o órgão principal da produção de estrogénios, que principalmente impacto sobre o crescimento, diferenciação e função dos tecidos reprodutivos [3]. Através de sua ação mitogênica, os estrogênios desempenham papéis na carcinogênese ovariana. Vários estudos têm apontado para um aumento do risco de cancro do ovário em pacientes recebendo terapia de reposição hormonal a longo prazo [4], [5], [6], [7], enquanto os pacientes tratados com a contracepção combinando estrogénios e progesterona oral apresentaram um risco reduzido de o desenvolvimento de um câncer de ovário [8], [9]. a acção do estrogénio é mediado por dois receptores, RctE e RpE, Dois factores de transcrição de uma grande família de receptores nucleares [10], [11]. Cerca de 40 a 60% dos cancros do ovário expressar ERa [12], mas é intrigante notar que apenas uma pequena parte deles vai beneficiar de terapia anti-estrogénio [13]. O papel do RpE na biologia do ovário permanece pouco compreendido, mas parece ser diferente da de ERa [14].

ERP

knock-out animais (βERKO) são subfertile, produzindo menos ninhadas e filhotes após indução de superovulação [15], [16]. Os ovários de animais βERKO contêm menos grandes folículos antrais e corpo lúteo em comparação com ninhada de tipo selvagem, que é concomitante com níveis mais baixos de estradiol produzidos [17] e uma redução da expressão de genes-chave envolvidos na função do ovário, como aromatase (

Cyp19a1

), receptor LH (

LHCGR

) e prostaglandina sintase 2 (

Ptgs2

) [18].

Vários estudos têm desvendado um papel potencial para ERP em EOC. Em particular, os níveis foram menores do RpE nos tumores do ovário em comparação com tecidos normais [19], [20], [21], [22]. Além disso, a perda de expressão RpE pode correlacionar-se com uma menor sobrevivência global dos doentes com cancro do ovário [23]. níveis RpE também estão associados com o estado do linfonodo metastático [24]. Um polimorfismo (rs127572) do gene da

RpE

também foi identificada recentemente e mostrado para ser associada a um risco aumentado de desenvolver um cancro do ovário [25]. No entanto, ainda é desconhecido se este polimorfismo afecta a expressão do RpE. A localização intracelular do RpE em células de tumor parece ser importante. Na verdade, um estudo recente mostrou que o RpE foi localizada no citoplasma das células tumorais, ao mesmo tempo que era principalmente nuclear em células epiteliais normais [26]. Além disso, a expressão citoplasmática de ERP foi correlacionada com um mau resultado para pacientes com câncer de ovário seroso avançada [14]. Estes resultados, combinados com as correlações clínicas supracitadas entre ERP e sobrevida do paciente, levam-nos a hipótese de que o RpE é um fator crítico para a progressão do tumor de ovário e para delinear a contribuição precisa deste receptor nas vias moleculares subjacentes EOC carcinogênese.

Para isso, usamos células BG-1 como um modelo celular e aproveitou um modelo de camundongo ortotópico de xenotransplante temos desenvolvido. A linha de células BG-1 é uma linha celular humana derivada de um EOC tecido do tumor primário sólido a partir de um paciente com a fase III, adenocarcinoma fracamente diferenciado do ovário [27]. Estas células expressam ERa e são sensíveis a estrogénios, em termos de proliferação [21], [28]. Modelos experimentais de carcinogénese do ovário são essenciais para compreender os mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da doença, mas também para avaliar a eficácia de novos medicamentos terapêuticos [29]. Vários modelos têm sido desenvolvidos, incluindo os diferentes modelos de xenoenxerto e transgénicos, nenhum ser totalmente satisfatória. Os modelos de xenotransplante de que são utilizados actualmente são ou intraperitoneal, por via subcutânea ou ortotopicamente intrabursal no ovário. Apenas alguns relatórios descrevem xenotransplante ortotópico. No entanto, o implante de células ortotópico pode ser percebido como mais fisiológico, tal como as células cancerosas são inoculadas directamente no ambiente do ovário e pode levar a metástase. Portanto, para investigar o papel do ERP na EOC carcinogênese, optamos por tirar proveito de um modelo de camundongo ortotópico de xenotransplante baseada no uso de luciferase (Luc) -expressing células câncer epitelial de ovário BG-1 humanos.

Mostramos aqui que a reintrodução de RpE em células BG-1 utilizando um adenovírus ligações

in vitro

a uma inibição da secreção basal e a proliferação de células induzida pelo estradiol. RpE exerce a sua acção anti-prolif erativa através de uma redução da proporção de células na fase S, um aumento das células em fase G2, juntamente com uma expressão alterada de reguladores do ciclo celular. Ao nível molecular, o RpE foi capaz de reprimir a expressão, a actividade e a sinalização de ERa e, assim, bloquear a sua acção proliferativa. Além disso, o RpE foi capaz de reduzir fortemente o desenvolvimento de xenoenxertos de ovário ortotópico, bem como a presença de células tumorais nos locais de metástases, que conduz a um aumento da sobrevivência dos ratinhos. No seu conjunto, estas descobertas apoiam um papel para o RpE como supressor de tumor em EOC carcinogénese.

Resultados

relatórios anteriores demonstraram que o RpE é fracamente expressa nos tecidos do EOC e linhas celulares derivadas em comparação com o tecido normal [11]. O Hotel aproveitou a linha celular humana EOC BG-1, que expressa os níveis endógenos de ERa e é sensível a estrogénios [27]. Aqui, primeiro, confirmar que as células BG-1 exibir baixos níveis de estado estacionário de produtos RpE, ou seja mRNA e proteínas (Fig. 1A, B). O próximo passo para avaliar o papel do ERP na carcinogênese ovariana era restaurar sua expressão em células de cancro do ovário. Assim, BG-1 foram infectadas com uma espinha dorsal (Ad5) ou humano

RpE

(Adβ) que codifica adenovírus [30], [31].

RpE

sobreexpressão foi efectivamente obtida em células infectadas Adβ como validada por PCR em tempo real e análise de Western blot (Fig. 1A, B). Curiosamente, níveis RpE foram fortemente regulada negativamente pelo estradiol (E2), tanto em níveis de RNA e proteína. Além disso, na ausência de RpE, os níveis de ERa foram também regulada negativamente por E2, embora em menor grau. Quando RpE foi introduzido nas células, o nível de expressão basal do ERa na ausência de E2 foi reduzido e por metade. A presença de RpE diminuiu fortemente os níveis de ERa na presença de E2 (diminuição superior a 15 vezes em 3 horas), o que sugere que o RpE aumenta a degradação do ERa. Isto é provavelmente devido à degradação dependente de proteassoma de proteínas de ERa e RpE [32]. Os efeitos da sobre-expressão RpE na capacidade de resposta de estrogénio foram então investigados. Analisou-se a capacidade do ERP transativar um repórter luciferase sintética sensível aos estrogénios em células BG-1. Endógena ERa era capaz de activar o repórter na presença de E2 (Fig. 1C). RpE reprimido fortemente a actividade de ERa em resposta a E2, o que sugere que, na presença de ERa, RpE comporta-se bastante como um repressor de um activador de sinalização estrogénio. Para assegurar a funcionalidade do receptor produzido, também verificada a actividade do RpE na linha celular EOC PEO14 [33] que é relatado para expressar baixos níveis de ERa (Fig. 1E) e, portanto, não respondem a estrogénios [34] . Ambos RctE e RpE foram capazes de estimular um repórter sensível ao estrogénio após exposição E2, mesmo que o RpE foi um pouco menos activo do que ERa (Fig. 1D). Portanto, na ausência de ERa, RpE retém a capacidade de transactivar estrogénio vias de sinalização. Quando RctE e RpE foram co-expressos em células de PEO-14, a actividade do repórter na presença de E2 foi semelhante ao de ERa sozinho. Isto sugere que na linha celular de ER-negativo PEO-14, RpE pode não afectar a actividade ERa. experiências de transferência Western em células de PEO-14 mostram que quando RctE e RpE foram expressas separadamente, os seus níveis foram fortemente diminuída na presença de E2 (Fig. 1E). Quando RctE e RpE foram co-expressos, a degradação de ERa na presença de E2 foi ligeiramente aumentado, mas não na proporção visto em células BG-1. Para RpE, a co-expressão de ERa ligeiramente aumentada a degradação do RpE. No geral, estes dados sugerem que os níveis de ERa não são regulados da mesma maneira em BG-1 e células de PEO-14, o que poderia explicar por que a atividade ERa não é drasticamente reduzido pela presença de RpE em PEO-14 em comparação com BG-1 células.

BG-1 foram infectadas com Ad5 ou Adβ adenovírus e tratadas durante 24 horas com etanol veículo de controlo (controlo) ou E2 10

-8M (E2). A expressão do gene de referência e RpE RS9 foi medida por PCR em tempo real. Os resultados representam a média ± DP de expressão RpE normalizado pela RS9 de 3 experiências independentes. Medidas de grupos Adβ e Adβ + E2 foram comparadas pelo

t

teste de Student não pareado. ** P 0,001. B. As proteínas foram extraídas a partir de células infectadas nas mesmas condições como em A e tratou-se para 0, 3, 6 ou 24 horas com 10 E2

-8M (E2). Níveis de ERa e ERp foram analisados ​​por Western blot. Actina foi utilizado como um controlo de carga. A faixa superior de ERP blot marcado com uma estrela corresponde a aspecific coloração. C. actividade transcricional do RpE. células BG-1 foram infectadas com Ad5 ou Adβ adenovirus e transfectadas com repórter ERE2-TK-Luc juntamente com repórter β-galactosidase. As células foram tratadas com o etanol como veículo (controlo) ou E2 (10-8 M) durante 24 h. Os resultados mostram as actividades relativas (% de Luc valores de células infectadas com Ad5 sem E2) ± SD após normalização com actividade β-gal (3 expericias independentes). Medidas de grupos Ad5 + E2 e Adβ + E2 foram comparadas pelo

t

teste de Student não pareado. * P 0,05. D. células PEO14 foram infectadas com Ad5, Adα, Adβ ou a combinação de Adα e Adβ adenovirus e transfectadas com repórter ERE2-TK-LUC, juntamente com o repórter β-galactosidase. As células foram tratadas com veículo de controlo (Controlo) ou E2 (10-8 M) durante 24 h. Os resultados mostram actividades relativas de luciferase (% de valores de células infectadas sem Ad5 E2) ± SD após normalização com actividade β-gal (3 expericias independentes). Medidas de Adα, Adβ e Adα + grupos beta foram comparadas pelo

t

teste de Student não pareado. *** P 0,001. NS: não significativo. E. As proteínas das células infectadas PEO14 nas mesmas condições que no D e tratados com veículo etanol (controlo) ou E2 10

-8M (E2) durante 3, 6 ou 24 horas foram analisados ​​por Western blot com anticorpos contra o RctE e RpE . Actina foi utilizado como um controlo de carga. A faixa superior marcado com uma estrela no painel direito corresponde a aspecific coloração.

A seguir, estudaram os efeitos do

expressão ERP

sobre a proliferação de células cancerígenas. células BG-1 infectadas com Ad5 ou Adβ adenovírus foram cultivadas

in vitro

na ausência ou na presença de E2. Como esperado, E2, estimulou a proliferação de controlo BG-1, células (Fig. 2a). Curiosamente, RpE reprimido por 50%, tanto a proliferação basal e E2-dependente das células BG-1. Observou-se também acção anti-proliferativa do RpE na ERα- e células PEO14 RpE-negativas. No entanto, esta inibição não foi afectada por E2 (Figura S2). Enquanto o

in vitro

efeitos de ERP têm sido observadas até agora, muito pouco se sabe da sua

in vivo

ação em modelos de câncer de ovário. Como uma primeira abordagem para avaliar este ponto, foi utilizado um modelo de injecção subcutânea. Para habilitar um sensível, dinâmica e início de follow-up do crescimento do tumor, nós estavelmente transfectadas células BG-1 com um repórter Luc constitutiva. Ratinhos nus atímicos ovariectomizados foram implantados um sedimento de colesterol ou E2 e injectados com células BG-1 infectadas com Ad5 ou Adβ adenovírus. células BG-1 formado tumores apenas na presença de E2 (Fig. 2B).

RpE

expressão significativamente reduzida de 70% do crescimento E2-promovido de células BG-1, suportando, assim, um papel anti-proliferativa potencial para o RpE na EOC.

O crescimento de células BG-1 , expressando ou não ERP, foi monitorado

in vitro

utilizando um contador de células. células BG-1 foram plaqueadas em placas de 24 poços e cultivadas na presença de veículo ou E2 (10

-8M). A proliferação é expressa como% de células de controlo cultivadas no dia 0. Os dados representam a média ± DP a partir de triplicados. Medidas de grupos Ad5 + E2 e Adβ + E2 foram comparadas pelo

t

teste de Student não pareado. ** P 0,001. B. RpE inibe o crescimento do tumor em um modelo de rato subcutânea bioluminescente. células BG-1 expressando estavelmente Luc e infectadas com Ad5 ou Adβ adenovírus foram injectados por via subcutânea em ratos nu feminino ovariectomizadas. A actividade de luciferase foi monitorizada durante 25 dias. Os resultados são expressos em fotões /s (pH /s) e representam a média ± DP a partir de 8 animais. Medidas de grupos Ad5 + E2 e Adβ + E2 foram comparadas pelo

t

teste de Student não pareado. * P . 0,05

Em seguida, explorou os mecanismos responsáveis ​​pela ação anti-tumoral de ERP. a distribuição do ciclo celular foi comparada por citometria de fluxo no controle e RpE-expressando células BG-1 (Fig. 3a). Nós não detectar qualquer pico SubG0, sugerindo que há apoptose ocorreu.

ERP

expressão não alterou a proporção de células BG-1 na fase G0-G1, mas fortemente reduzida a de células em fase S. Descobrimos também que

ER

β expressão provocou um aumento do número de células em fase G2-M do ciclo celular. A expressão dos marcadores do ciclo celular foi próxima monitorizada por análises de transferência de Western (Fig. 3B). Vários reguladores do ciclo celular tais como ciclinas A e D 1, AKT e Rb são relatados para ser regulados por estrogénios [35]. Observou-se que a fosforilação de AKT foi aumentado por tratamento E2 de Ad5 em células infectadas com BG-1 (Fig. 3B).

RpE

expressão levou a uma diminuição do teor de fosfo-AKT em ambas as células com veículo e E2-teated e isto ocorreu em 3, 6 e 24 horas. ERP causou mudanças semelhantes em ciclina D1, Rb total e expressão Rb fosforilada. De facto, os níveis de ciclina D1, Rb Rb fosforilado total e foram sobre-reguladas após o tratamento E2 de Ad5 em células infectadas e esta indução foi reduzida em RpE. A ciclina A2 apresentada uma indução 24h após o tratamento final de E2 e esta foi reduzida pela presença do RpE.

células BG-1 foram colhidas 24 h após a infecção com Ad5 ou Adβ adenovírus e analisadas para a distribuição do ciclo celular. Os resultados representam a média ± SEM de 3 experiências. grupos de Ad5 e Adβ foram comparadas pelo

t

teste de Student não pareado. ** P 0,001. B. Células BG-1 foram infectadas com o vírus Ad5 ou Adβ. Após a infecção, as células foram tratadas durante 3, 6 ou 24 horas com veículo (etanol, C) ou 10

-8M E2. 30 ug de extractos de proteínas foram utilizadas para transferência de Western. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. A menos que especificado, a proporção de proteínas alvo ao longo β-actina é indicado abaixo dos géis. Representante de 2 experimentos.

Para explorar ainda mais o

in vivo

papel do ERP na carcinogênese do ovário, montamos um modelo mais fisiológico do implante ortotópico de células tumorais no ovário. Ad5 ou células BG-1-Luc Adβ-infectadas foram injectados no crescimento do tumor de ovário e esquerdo foi monitorizada por bioluminescência. Como mostrado na Fig. 4A,

ERP

expressão impediu significativamente o crescimento do tumor. Quando sacrificados no dia 28 pós-injecção, os ratinhos de controlo apresentaram um claro aumento do volume peritoneal e do volume do tumor no ovário esquerdo (Fig. 4B). Em nítido contraste, tanto o volume do peritoneu e ovário apareceu muito mais reduzida em ratinhos injectados com células que expressam o RpE BG-1. A seguir, determinar se o processo metastático foi afetada pela expressão

ERP

. Para alcançar este objectivo, o pulmão, fígado e ovário direito contralateral foram recolhidos. A extensão das células tumorais presentes nestes órgãos foi estimado através da medição da actividade Luc no nosso modelo ortotópico. A actividade de luciferase foi detectada no pulmão, fígado e ovários contralateral de ratinhos injectados com células infectadas Ad5-BG-1 (Fig. 5a). Curiosamente,

RpE

expressão reduzida fortemente a presença de células tumorais e metástases para potencialmente todos estes órgãos, sugerindo que o RpE exerce uma dupla função no crescimento e disseminação tumoral. Isto foi confirmado por

In vitro

cicatrização de feridas experiências que mostram que

RpE

expressão diminui a mobilidade das células BG-1 (dados não mostrados). Desde ERP impacto sobre o crescimento do tumor e disseminação de células, que se perguntou se isso poderia permitir melhorar a sobrevivência ratos. Os ratos foram acompanhados por 80 dias e diariamente verificada por qualquer sinal de morbidade.

RpE

expressão atrasou significativamente a morte de dois meses após a injecção com células BG-1-Adβ infectados, 50% dos ratinhos ainda estavam vivos (Fig. 5B). Isto está em forte contraste com a morte de 100% dos ratinhos de controlo, o que ocorre em menos de dois meses.

células BG-1-Luc infectadas com Ad5 ou Adβ adenovírus foram injectados no ovário esquerdo de ratinhos nus. actividade Luc foi monitorizada durante 35 dias tal como descrito na Fig. 1C. Os resultados são expressos em fotões /s (pH /s) e representam uma experiência representativa que corresponde à média ± SD de pelo menos 5 animais por grupo. teste de Mann-Whitney foi usado para comparação. * P 0,05 e ** P 0,01. Uma imagem representativa do dia 35 é mostrado. B. imagens representativos de animais inteiros e do tracto genital dos animais sacrificados no dia 35 são mostrados.

ratinhos nus injectados com células BG-1-Luc nas mesmas condições que na Fig. 4. foram sacrificados 28 dias após a injecção. Pulmão, fígado e ovários contralateral direito foram retirados e actividade Luc foi ensaiada como mencionado acima. Os resultados são expressos como fotões /s /mg de proteínas e representam a média de 5 animais ± SEM. teste de Mann-Whitney foi usado para comparação. * P 0,05 e ** P 0,01. B. curva de sobrevivência de Kaplan-Meier. 10 ratinhos foram ortotopicamente xenoenxertados com células BG-1 que expressam estavelmente Luc, infectadas com Ad5 ou Adβ adenovírus, seguido-se diariamente para o desenvolvimento de dificuldade respiratória, paralisia dos membros e perda de peso, e sacrificados imediatamente se observou. P valor é aquele obtido nos testes de log-rank.

Discussão

Nós relatamos aqui que a introdução de ERP em células de cancro do ovário exibindo níveis endógenos de ERa leva a uma inibição forte de

in vivo

crescimento e disseminação de células, mediada por meio do controle de expressão ERa e sinalização.

In vitro

proliferação experimentos mostram uma inibição clara da proliferação E2-dependentes pelo RpE na linha celular de cancro do ovário ERa-positiva BG-1. Esta é a primeira demonstração de uma acção anti-proliferativa dos RpE em uma linha de células de cancro do ovário ERa-positiva. Além disso, o RpE pode também inibir o crescimento da linha celular de cancro do ovário ERa-negativo PEO-14. Estes resultados estão de acordo com os nossos resultados anteriores obtidos com linhagens de células ERa-negativos da mama [31] e de próstata [30] células cancerosas e com outro estudo realizado na linha de células SKOV3 EOC-derivado ERa-negativas [36]. Em células desprovidas de receptores de estrogénio, é provável que a restauração da ERa não pode permitir uma estimulação da proliferação após tratamento E2, uma vez que provoca um programa diferente de regulação da transcrição, em comparação com células que expressam naturalmente ERa, como mostrado anteriormente em células de cancro da mama [37 ]. Com efeito, observou-se que os níveis endógenos ERa em células BG-1 foram fortemente reduzida pela presença de RpE, ao passo que o RpE menos afectado os níveis de ERa em células de PEO-14. Além disso, o RpE pode inibir a actividade completamente RctE nas células BG-1, mas não em células de PEO-14. Isto pode ser devido ao facto de que, em células BG-1, endógena ERa está sob o controle do seu próprio promotor, enquanto que em células de PEO-14, ERa exógeno é controlada por um promotor virai. Além disso, não se pode excluir que os co-factores necessários para a actividade RctE e RpE nos dois tipos de células são diferentes, o que explica a sua actividade diferencial em células BG-1 e POE-14.

A novidade do nosso estudo é ter-se estendido esses dados para dois

in vivo

modelos. Se evidências clínicas com base nos níveis RpE em tecido normal e câncer sugerem que esse receptor poderia agir como um potencial supressor de tumor, até agora, nenhuma prova pré-clínico foi trazido para confirmar esta hipótese. Em primeiro lugar, usou um modelo subcutânea clássica, para responder a esta pergunta e, mais precisamente para determinar se o estrógeno foram necessários ou não. BG-1

In vivo

crescimento foi claramente dependente da presença de estradiol e RpE pode contrariar o crescimento tumoral. Nós também utilizado o implante ortotópico de células bioluminescentes no ovário. De acordo com

in vitro

experimentos, observou-se uma forte redução do crescimento do tumor quando as células BG-1 expressam ERP.

análise do ciclo celular demonstrou que o RpE inibiu a proliferação celular, diminuindo a proporção de as células em fase S e aumentando a percentagem de células na fase G2-M. Esta situação é semelhante à relatada em células de cancro da mama [38]. Ao nível molecular, o RpE pode diminuir a fosforilação de Akt e Rb. Além disso, o RpE também reduziu a expressão de ciclina D1 e ciclina A. A ciclina D1 interage com Quinase Dependente de Ciclina-4 e -6, o que leva à fosforilação de Rb e a dissociação do RB /E2F complexo, o que faz com que a progressão através G1 [35]. Ciclina A interage com ciclina-dependente cinase-2 para promover a transição da fase G2 para S [39]. Além disso, a fosforilação de AKT favorece transição G1 /S, bloqueando a actividade de transcrição de factores FOXO, que regulam a expressão de ciclina D1 e p21 [40]. Com base nestas descobertas, propomos que o RpE leva a uma diminuição da fosforilação da AKT, que por sua vez resulta em uma diminuição da expressão de ciclina D1 e fosforilação de Rb.

Para explicar como o RpE pode afectar a proliferação de células, que têm investigaram se poderia modificar directamente a expressão ERa e de sinalização em células BG-1. Na verdade, é interessante notar que o RpE também tem efeitos profundos dos níveis de ERa como diminuída pela expressão cerca de 15 vezes ERa no 3h. Embora os mecanismos moleculares exatos que representam o efeito negativo do ERP em ERa em células BG-1 continua a ser elucidado, a extensão ea taxa de degradação da ERa é certamente essencial para a sua actividade e estes parâmetros mudar se ERP está presente ou não. De facto, em células BG-1 parentais, expressando apenas ERa, o receptor é também sujeito à degradação E2-dependente. Isto é provavelmente devido à degradação proteossómica do receptor como mostrado na um número de tipos de células por estudos anteriores [41], [42]. Paradoxalmente, também é necessária a degradação proteossómica dependente de E2 de ERa para sua atividade plena através da regulação das interações dos receptores com os seus coactivators [42] e o ciclo de ERa no promotor de seus genes-alvo [43]. A situação parece diferente quando ERP é co-expressa com ERa em células BG-1. Com efeito, que relatam que o RpE pode reduzir mais rapidamente e fortemente a expressão de ERa em células BG-1 na presença de E2, em comparação com as células em que apenas está presente ERa. Isto está de acordo com o que é observado na linha celular de cancro da mama positivo ERa-T47-D transfectadas com RpE [44]. Isto sugere que o RpE pode provocar uma degradação rápida proteossómica de ERa na presença de E2. Se supusermos que ERa e RpE formam heterodímeros, como descrito anteriormente [45], [46], RpE pode aumentar a degradação do ERa presente no complexo, alterando a sua conformação e impedindo-a de ser ativo. Consequentemente, ERa seria menos eficiente para ativar seus genes-alvo e não poderia desempenhar o seu papel proliferativa.

Com efeito, para além dos seus efeitos na expressão ERa, não podemos excluir que o RpE também reduz a atividade ERa, como mostra transfecção de um repórter de resposta ao estrogénio nas células BG-1. Isto está de acordo com um estudo anterior realizado em um linhas celulares de cancro da mama ERa-positivo, em que o RpE foi transfectadas, sugerindo que ERa e RpE têm papéis distintos [47]. Por sua vez, isto pode afectar a sinalização dependente de E2-ERa, que não poderia regular os níveis da actividade de genes alvo-chave envolvidos na proliferação, tais como AKT, Rb, ciclina D1 ou ciclina A2. Além disso, outros estudos têm relatado uma ação negativa de ERP em ERa sinalização [44], [48]. Em particular, o RpE foi mostrado para alterar o recrutamento de complexos de AP-1 para ERa genes alvo [44], que é conhecido por agir em sinergia com ERa. Uma vez heterodimerizado com ERa, RpE poderia também modificar a capacidade de ERa para interagir com coactivadores. Um estudo anterior sugeriu também uma acção de Ying Yang RpE

In vivo

, que é um repressor de ERa sinalização na presença de ERa, mas também pode substituir ERa na ausência de ERa [48]. A infra-regulação da expressão de ERa pelo RpE pode não ser o único mecanismo de inibição do crescimento por ERp, como RpE pode também reduzir o crescimento celular de células de ERa-negativas PEO-14. É possível que o RpE afectar directamente factores envolvidos na proliferação celular, tais como coregulators transcricionais, reguladores do ciclo celular, mas também factores de crescimento.

relatam que o RpE pode não só reduzir o crescimento do tumor primário, mas também poderia diminuir a extensão da metástase, ou, pelo menos, a presença de células tumorais em órgãos diferentes. Temos demonstrado anteriormente que a ERP pode inibir

in vitro

célula cancerosa invasão [31], o que certamente contribui para a divulgação diminuição observada. No entanto, não se pode excluir totalmente a possibilidade de que a redução do crescimento do tumor primário conduz também a uma diminuição da metástase. Seja qual for o efeito exercido pelo RpE, esta redução de metástases certamente explica o aumento da sobrevivência dos ratinhos implantados com células do RpE.

Tomados em conjunto, os nossos resultados fornecem evidência para um cenário em que o RpE actua como um supressor de tumor potencial e representa um alvo potencial para futuras terapias de EOC. Para nosso conhecimento, esta é a primeira

in vivo

demonstração de acções anti-proliferativa e -metastatic de ERP em um modelo ortotópico pré-clínico da carcinogênese ovariana. Nossos resultados que ligam ERP eo processo mestastasis estão em completo acordo com estudos clínicos revelam que o RpE não se expressa em formas metastáticas do cancro do ovário [20] e a perda de sua expressão se correlaciona com a sobrevida global mais curto [23]. Aqui, nós desvendar ainda que ERP impacta diretamente sobre a expressão ERa, ciclo celular e propriedades invasivas das células cancerosas. As razões que representam a fraca expressão de ERP no câncer de ovário ainda imperceptíveis. Relatórios recentes sugerem possíveis modificações epigenéticas levando a

ERP

silenciamento, como o tratamento de células de cancro do ovário com metiltransferase de ADN ou inibidores da deacetilase de histona poderia restaurar sua expressão [49], [50], [51]. Outra hipótese seria uma degradação preferencial de proteína RpE pelo proteassoma, resultando em baixos níveis deste receptor em células de câncer [32]. Estes poderiam ser os trilhos para explorar no futuro para controlar a expressão ERP e desenvolvimento de novas terapias no cancro do ovário.

Materiais e Métodos

linha de células de tumor

A célula de ovário humano