Abstract

O câncer de próstata (PCA) é a segunda principal causa de morte que afligem os homens Estados Unidos relacionadas com o cancro. A maioria dos tratamentos to-date para CaP metastático incluem a terapia de privação de andrógeno e de segunda geração anti-andrógenos, tais como acetato de abiraterona e enzalutamida. No entanto, a maioria dos pacientes, eventualmente, desenvolver resistência a estas terapias e recaída em forma letal, resistente à castração de CaP a que nenhuma opção de tratamento adequado permanece. Deste modo, existe uma necessidade imediata de desenvolver agentes terapêuticos eficazes para esta população de pacientes. Imidazopiridinas foram recentemente demonstrado que possuem actividade inibidora da quinase Akt; Assim, no presente estudo, nós investigamos o efeito inibidor de derivados de imidazopiridina novos HIMP, H-mei, OMP, e ETOP em células CaP resistente à castração humanos diferentes. Entre estes compostos, HIMP e M-mei foram encontrados para possuir dose seletiva e inibição do crescimento dependente do tempo: eles reduziram a proliferação das células CaP resistente à castração e poupou células epiteliais benignas da próstata. Usando células LNCaP C-81 como o sistema modelo, estes compostos também reduziu a formação de colónias, bem como a adesão celular e migração, e M-mei foi o mais potente em todos os estudos. Outras investigações revelaram que enquanto HIMP inibe o crescimento de células essencialmente PCA através de supressão da via PI3K /Akt sinalização, H-mei pode inibir ambas as Akt e receptor de androgénio /vias de PI3K e parar o crescimento celular na fase G2. Assim, os nossos resultados indicam o novo composto H-MEI para ser um candidato promissor para a terapia de CaP resistente à castração, e futuros estudos investigando o mecanismo de inibição imidazopiridina pode ajudar ao desenvolvimento de agentes anti-PCA eficazes.

citação: Ingersoll MA, Lyons AS, Muniyan S, D’Cunha N, Robinson T, Hoelting K, et al. (2015) Derivados imidazopiridina Novel Possuir efeito anti-tumoral do Homem resistente à castração células cancerosas da próstata. PLoS ONE 10 (6): e0131811. doi: 10.1371 /journal.pone.0131811

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ÁUSTRIA

Recebido: 10 de fevereiro de 2015; Aceito: 07 de junho de 2015; Publicação: 29 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Ingersoll et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Cancer Institute, National Institutes of Health [CA88184 (MFL), CA138791 (SKB)], Departamento de Defesa CaP Bolsas de formação [PC094594 (MFL), PC121645 (MFL)], e da Universidade de Nebraska Medical Fundo Ponte Center (MFL). A análise do ciclo celular foi realizada no Centro de UNMC Citometria de Fluxo do núcleo em parte apoiada por concessão UNMC Eppley Cancer Center [CA036727] (Ken Cowan). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) continua a ser o tumor sólido mais comumente diagnosticado ea segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em homens Estados Unidos, mantendo uma necessidade de novas opções de tratamento eficazes [1]. Atualmente, a terapia de privação de androgênio (ADT) é o curso padrão de tratamento para CaP metastático, no entanto, a maioria dos pacientes CaP recaída dentro de 1-3 anos e desenvolver resistente à castração (CR) APC, que não responde a ADT [2,3,4 ]. Em 2004, foi mostrada uma combinação de docetaxel e prednisona para aumentar a sobrevida média do paciente por 2-3 meses, tornando-se o tratamento padrão de atendimento para o CR CaP [5]. Recentemente, a FDA aprovou compostos adicionais, tais como romance cabazitaxel taxano quimioterapêutico [6], inibidor da síntese de androgénio acetato de abiraterona [7], AR enzalutamida inibidor da sinalização [8], sipuleucel-T imunoterapêuticos [9], e osso micro-ambiente segmentados Alpharadin radiofármaco (rádio-223) para o tratamento de CR CaP [10]. No entanto, essas opções de tratamento só são capazes de prolongar a sobrevivência de alguns meses e o tempo médio de sobrevida do paciente CR CaP permanece menos de dois anos [11]. Apesar dos avanços nas estratégias de tratamento pós-ADT, CR CaP continua a ser uma doença incurável; portanto, há uma grande necessidade de opções terapêuticas alternativas

Enquanto insensibilidade androgênica pode se manifestar de várias maneiras.; um mecanismo alternativo proposto é o aumento da ativação da Akt sinalização em condições de andrógenos privados. Akt é conhecida para regular o ciclo celular, metabolismo, angiogénese, e a sobrevivência das células em APC e a sua activação pode contribuir para a resistência do tumor à ADT e anti-androgénios [12,13]. Um mecanismo através do qual Akt pode contribuir para a capacidade de sobrevivência CaP é através da modulação da sinalização do receptor de androgénio (AR). Além de induzir o crescimento de células, AR também tem um papel na regulação da apoptose. Após a fosforilação de AR a Ser-210 e Ser-790 por Akt, a apoptose mediada por AR é suprimida. Através deste mecanismo, atividade Akt reforçada em CaP pode contribuir para CaP sobrevivência após ADT [13]. Na verdade, perda e /ou mutações genéticas no fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) /Akt que levam para sinalizar a desregulamentação pode se apresentar de up-to 42% dos tumores de próstata primário e mais de 90% dos tumores metastáticos, tornando-se uma prioridade próxima -line -em alvo terapêutico [14]. Recentemente, investigações sobre imidazopiridinas, uma nova classe de compostos que contêm aldeídos aromáticos e um grupo piridina, demonstraram estes compostos possuem uma potente actividade inibidora da quinase Akt [15-17]. Os dados mostram estes compostos têm um efeito anti-proliferativa contra as células RC APC com a capacidade para inibir simultaneamente AR e /Akt /mTOR vias de sinalização, o que os torna agentes terapêuticos promissores PI3K [18].

Para investigar a eficácia ‘imidazopiridinas para a terapia APC, o modelo de celular progressiva LNCaP, originalmente caracterizado por Lin et. ai.

JBC 1998, foi utilizado como o modelo de célula primária neste estudo. células LNCaP C-81 são andrógeno-independente (AI), expressam antígeno específico da próstata (PSA) na ausência de andrógenos, e ganhar a capacidade de sintetizar testosterona de colesterol sob condições reduzidas-esteróides (SR) [19-22]. células C-81 possuem também a proliferação, capacidade de formar colónias, e potencial migratório [21,23] reforçada. Mais importante ainda, as células LNCaP C-81 reter AR expressão e correspondem à expressão de AR, na maioria dos CaP, bem como avançado CR CaP [19]. Isso faz deles um modelo de célula superior para estudos terapêuticos quando comparados com muitas outras linhas de células APC. Outras linhas celulares seleccionadas para este estudo incluem MDA PCa2b-AI, PC-3, e RWPE1. Após a passagem, as células MDA PCa2b se comportam de forma semelhante a células LNCaP e mudar de andrógeno-sensível (AS) em baixa passagem para a AI em alta passagem. MDA PCa2b-AI (MDA-AI) células também reter expressão AR e possuem tumorigenicidade reforçada; isto faz com que C-81 modelos de células LNCaP preferíveis MDA-AI e para o estudo de adenocarcinoma da próstata. Além disso, devido à capacidade de derivados de imidazopiridina de segmentar as vias AR e Akt, é prudente para investigar os efeitos dos compostos sobre as células PC-3 AR-negativa para determinar a sua eficácia em células que não possuem mecanismos clássicos de androgénio sinalização. Além disso, PC-3 linhas de células são mais representativas do carcinoma neuroendócrino de células pequenas do que o adenocarcinoma predominante mais clinicamente [24]; Por isso, esta linha de células deve ser usado em conjunto com os modelos, tais como linhas celulares LNCaP e MDA PCa2b para expandir utilidade clínica. Finalmente, imortalizada do epitélio da próstata benigna células RWPE1 actuar como um controlo para medir a selectividade dos compostos derivados de imidazopiridina. Assim, os modelos celulares representam claramente a maioria dos eventos moleculares observados em implementações clínicos das terapias modernas CaP.

Os nossos resultados demonstram estes derivados de imidazopiridina são capazes de suprimir a proliferação de células CaP humano de uma forma dose e dependente do tempo. Importante, composto M-Mel exibiu pressão seletiva contra a proliferação de células CR CaP em comparação com células epiteliais benignas da próstata. Além disso, este composto também inibe a migração celular, adesão, e

In vitro

tumorigenicidade. Nossos dados é o primeiro a demonstrar o efeito anti-tumoral de novos derivados de imidazopiridina HIMP, M-Mei, OMP e Etop em células CR APC e indica M-mei ser um agente terapêutico pista promissora para futuros estudos.

Materiais e Métodos

Materiais

meio RPMI 1640, o meio SFM de queratinócitos, gentamicina e L-glutamina foram compradas na Invitrogen (Carlsbad, CA). de soro bovino fetal (FBS) e tratada com carvão vegetal de FBS foram obtidos a partir de Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). agarose biologia de nível molecular foi obtido a partir de Fisher Biotech (Fair Lawn, NJ). marcadores proteicos de peso molecular convencionais, acrilamida, e de Bradford kit de ensaio de proteínas foram adquiridos de Bio-Rad (Hercules, CA). Os anticorpos policlonais (ABS) que reconhecem todos os três isoformas de proteínas Shc (# 29807, 1: 4000) foram adquiridos a partir de Upstate (Lake Placid, NY). Anti-AR (# C1411, 1: 400), anti-ciclina B

1 (# K1907, 1: 1000), anti-ciclina D

1 (# A2712, 1: 1000), anti-Bcl

XL (# F111, 1: 1000), anti-Bax (# G241, 1: 1000), anti-PCNA (# G261, 1: 3000), anti-p53 (K2607 #, 1: 1000), anti- PSA (# E1812, 1: 2000), anti Survivina-(# C271, 1: 2000), e peroxidase de rábano conjugado com anti-ratinho (# C2011, 1: 5000), anti-coelho (# D2910, 1: 5000) , anti-cabra (# J0608, 1: 5000) Abs IgG foram todos obtidos da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-fosfo-AKT (Ser473) (# GA160, 1: 1000), anti-Akt (# C1411, 1: 2000), anti-fosfo-Stat5 (Y694) (# 9351S, 1: 4000), e anti-Stat5 (# 9363, 1: 2000) Abs foram de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-β-actina (# 99H4842, 1: 10.000) e Abs 5α-di-hidrotestosterona (DHT) foram adquiridos a partir de Sigma (St. Louis, MO). derivados imidazopiridina HIMP (3-fenil-1- (piridino-2-il) imidazo [1,5-

um

] piridina), H-se MeI (1- (piridina-2-il) -3- (

m

-tolil) imidazo [1,5-

um

] piridina), OMP (1- (piridina-2-il) -3 – (

O

-tolil) imidazo [1,5-

um

] piridina), e ETOP (3- (4-etoxifenil) -1- (piridina-2-il) imidazo [1,5-

um

] piridina) foram sintetizados e fornecidos pelo Dr. Xiu Bu como previamente descrito [18,25] e as suas estruturas são mostrados na Figura 1. Para facilidade de leitura, as abreviaturas químicas são usadas ao longo do texto.

HIMP, 3-fenil-1- (piridino-2-il) imidazo [1,5-

um

] piridina; H-mei, 1- (piridina-2-il) -3 – (

m

-tolil) imidazo [1,5-

um

] piridina; OMP, 1- (piridina-2-il) -3 – (

O

-tolil) imidazo [1,5-

um

] piridina; ETOP, 3- (4-etoxifenil) -1- (piridina-2-il) imidazo [1,5-

um

] piridina.

Cultura celular

da próstata humano LNCaP linhas celulares de carcinoma, MDA PCa2b, PC-3, e imortalizadas de células epiteliais da próstata benigna RWPE1 foram originalmente obtidas a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA). células LNCaP e PC-3 foram mantidas rotineiramente em meio RPMI 1640 contendo 5% de FBS, glutamina 2 mM e 50 ug /ml de gentamicina [19,21]. células MDA PCa2b foram mantidas em meio BRFF-HPC1 contendo 20% de FBS, glutamina 2 mM e 50 ug /ml de gentamicina [26,27]. Como relatado anteriormente, o modelo de células LNCaP progressiva foi estabelecida, na qual as células LNCaP de ou abaixo de passagem 33 são designados como C-33 e as que estão em ou maior do que a passagem 81 como C-81. Enquanto as células C-33 são sensíveis ao crescimento induzido por androgénio, células C-81 são AI, expressam níveis mais elevados de PSA basais, e ganhar a capacidade de sintetizar testosterona a partir do colesterol [19-22]. Semelhante ao modelo de LNCaP, após passagem, as células tornam-se MDAPCa2b AI e possuem muitas propriedades bioquímicas da clínica CR APC, incluindo a expressão de AR funcional, a secreção de PSA, e proliferação celular rápida em condições de privação de andrógeno [19,21,22,27 , 28]. RWPE1 células foram cultivadas em queratinócitos-SFM suplementado com extracto de pituitária bovina (25 ug /mL) e factor de crescimento epidérmico recombinante (0,15 ng /ml) juntamente com 50 ug /ml de gentamicina.

Para imitar as condições de ADT clínica , as células foram mantidas em condições SR, isto é, fenol meio RPMI livre de vermelho de 1640 contendo 5% de carvão vegetal /FBS tratado com dextrano, glutamina 2 mM e 50 ug /ml de gentamicina, mais de 1 nM de DHT. derivados imidazopiridina HIMP, H-mei, OMP, e ETOP foram dissolvidos em sulfóxido de dimetilo (DMSO) em concentrações de 20 mM, armazenada a -20 ° C e diluiu-se conforme necessário para as condições experimentais no respectivo meio.

os ensaios de proliferação celular

para as experiências de proliferação de células em condições normais, as células LNCaP C-81 e MDA PCa2b-AI foram semeadas em meio de cultura regular e deixadas a crescer durante 3 dias, em seguida mudado para meio contendo o respectivo composto e cultivadas durante um adicional de 3 dias. Para determinar a proliferação de células em condições SR, LNCaP C-81, MDA PCa2b-AI, PC-3, e RWPE1 células foram semeadas em condições regulares e deixadas a crescer durante 3 dias. As células foram então esteróide fome durante 48 horas em meio de RS e SR mudado para meio fresco contendo o composto respectivo, em seguida cultivadas durante um período adicional de 3 dias. grupos de controlo recebeu DMSO veículo sozinho. No ponto de tempo especificado, as células foram tratadas com tripsina e o número de células vivas foram contadas por meio de ensaio de exclusão de azul de tripano utilizando um contador de células com base em imagem Cellometer Auto T4 (Nexcelom, MA, EUA).

Crescimento celular cinética e Dosagem Determinações

ensaios dependentes da dose foram realizadas em células LNCaP C-81 da mesma maneira como os ensaios de proliferação celular e utilizado meio contendo 0, 1, 5 ou 10 uM de composto especificado. Para determinar o efeito cinético do HIMP e M-mei sobre o crescimento de LNCaP células C-81, as células foram semeadas em placas de cultura de seis poços a uma densidade de 2 x 10

3 células /cm

2 e mantida em condições de cultura normais, durante 3 dias. As células foram, em seguida mudado para meio SR e mantida durante 2 dias. Uma placa de células ligadas foi recolhido e contado como dia 0, e as restantes células foram mudadas para seu respectivo meio de tratamento: controlo (DMSO), HIMP, e M-MeI (10 uM). Em cada ponto de tempo, as células foram colhidas para contagem do número de células e as células restantes foram alimentados com meio fresco contendo composto respectivo tratamento. Depois de número de células contagem, foram preparados lisados ​​celulares por análise de Western blot.

Análise de citometria de fluxo

Para determinar o efeito dos compostos no ciclo celular, LNCaP C-81 células foram semeadas em frascos T25 a uma densidade de 2 x 10

3 células /cm

2 em meio normal durante 3 dias, mudado para meio EL durante 48 horas, e depois alimentadas com meio fresco contendo SR 10 uM do composto especificado. Um conjunto de células foi colhida após 3, 5, e 7 dias de tratamento, respectivamente, através de tripsinização. Após a contagem do número de células, uma alíquota de células foi sedimentado por centrifugação, ressuspenso em etanol a 70%, e incubou-se a 4 ° C durante 30 minutos, depois foi lavada com PBS e centrifugada de novo por centrifugação. O DNA de células fixadas com etanol coradas utilizando Reagente Telford (PBS, pH 7,4, contendo 0,1% de Triton X-100, 0,1 mM de EDTA sal dissódico, 0,05 mg /ml de RNase A (50 U /mg), e 50 mg /ml iodeto de propídio) a 4 ° C durante 4 horas [29]. Determinação da distribuição do ciclo celular foi levada a cabo usando um classificador de células activadas por fluorescência Becton-Dickinson (FACSCalibur, Becton Dickinson, San José, CA, EUA) na facilidade de UNMC Citometria de Fluxo do núcleo.

Ensaio de Adesão Celular

para determinar o efeito de derivados de imidazopiridina de adesão celular CaP a superfícies de plástico-ware, células LNCaP C-81 foram suspensos em 5% de FBS 1640 RPMI contendo 10 uM de respectivos compostos e incubou-se durante 30 minutos. As células foram então plaqueadas em placas de 6 poços em triplicado a uma densidade de 3×10

3 células /cm

2 no respectivo meio de tratamento e incubadas durante uma hora adicional. células não ligadas foram cuidadosamente lavados e as restantes células aderentes foram coradas com uma solução de violeta de cristal a 0,2% contendo 50% de metanol. O número total de células em cinco campos na ampliação de 40x por poço foram contadas.

clonogénicos e agar mole Colony ensaios de formação de

O ensaio de crescimento de células clonogénicas, sobre a superfície de plástico de louças foi conduzida como descrito anteriormente [23,26]. Resumidamente, as células LNCaP C-81 foram plaqueadas em placas de 6 poços sob condições de cultura normais em três densidades: 20, 200 e 2.000 células por poço. As células foram incubadas durante a noite, após o que as células não ligadas foram removidas e as células ligadas foram alimentadas com meio normal fresco contendo 10 uM de composto de tratamento. As células foram crescidas durante 9 dias com uma mudança de meio fresco a cada três dias. No 10

° dia, o meio foi removido e as células foram lavadas com solução salina gelada tamponada com HEPES, em seguida, as células ligadas foram coradas com uma solução de violeta de cristal a 0,2% contendo 50% de metanol. O experimento foi realizado em duplicado.

O efeito de derivados de imidazopiridina no crescimento independente de ancoragem de células LNCaP C-81 foi avaliada por ensaio de agar mole. Resumidamente, 5×10

4 células foram semeadas numa camada de agarose de topo de 0,25% com uma camada de base contendo 0,3% de agarose em placas de 6 poços. No dia após a sementeira, grupos de células contendo mais do que uma célula foram excluídos do estudo. As células foram então alimentadas com 0,5 ml de meio fresco contendo normal do respectivo composto a cada 3 dias durante 4 semanas. Após o período experimental, as colónias foram coradas com uma solução de violeta de cristal a 0,2% contendo 50% de metanol e contadas.

A migração celular Ensaio

Para determinar o efeito de derivados de imidazopiridina sobre a mobilidade de células APC, LNCaP migração de células C-81 foi avaliada por meio de ensaio de câmara de Boyden. As células foram colocadas em placas a uma densidade de 5 x 10

4 células para dentro da câmara superior de 24 poços inserções Transwell placa. Meio contendo 10 uM de composto de tratamento (veículo sozinho para controle) foi colocado em ambas as câmaras superiores e inferiores das transwells. As células foram então incubadas durante 24 horas, após o que foram coradas com solução de violeta cristal 0,2% em metanol a 50%, e as restantes células na câmara superior foram removidas através cotonete. As células que tinham migrado através da câmara inferior foram contadas em ampliação de 40x num microscópio.

A análise de imunotransferência

Todas as células foram lavadas com solução salina tamponada com HEPES arrefecida em gelo, pH 7,0, colhidas através raspagem e lisadas em tampão de lise gelado contendo inibidores de protease e fosfatase. Total de lisados ​​celulares foram preparados tal como anteriormente descrito [19,30]. A concentração de proteína do sobrenadante foi determinada utilizando um ensaio de proteína de Bio-Rad Bradford. Para imunotransferência, uma alíquota do lisado celular total foi sujeito a electroforese em géis de SDS-poliacrilamida (7,5% -12%). Depois de ter sido transferido para uma membrana de nitrocelulose, as membranas foram bloqueadas com leite magro a 5% em solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 0,1% de Tween-20 durante 30 minutos à temperatura ambiente. As membranas foram incubadas com o correspondente Ab primário durante a noite a 4 ° C. As membranas foram então lavadas e incubadas com o Ab secundário apropriado durante 60 minutos à temperatura ambiente. As proteínas de interesse foram detectados por um quimioluminescência aumentada (ECL) e kit de reagente β-actina foi utilizado como um controlo de carga.

Análise estatística

Cada conjunto de experiências foi realizado em duplicado ou triplicado quanto especificado nas legendas das figuras, e as experiências foram repetidas, independentemente, pelo menos, duas ou três vezes. Os valores de média e erro padrão de todos os resultados foram calculados e bicaudal teste t de Student foi utilizado para determinar a significância dos resultados.

p Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

efeito dose-dependente dos derivados imidazopiridina sobre a proliferação celular CR CaP

LNCaP C-81. células exibem muitas propriedades bioquímicas como visto na clínica CR APC, incluindo a expressão funcional AR, a secreção de PSA IA, e com a regulação da proliferação intracrine crescimento [19,21-23] e, portanto, foram utilizados como o sistema modelo celular primário para os compostos de teste de imidazopiridina. Inicialmente, os efeitos dependentes da dose de HIMP, H-mei, OMP, e ETOP em células LNCaP C-81 foram testados sob condições de cultura normais. As células foram tratadas com 0-10 uM de cada composto durante 72 horas e o crescimento celular foi analisada através de ensaio de exclusão de azul de tripano. Sob condições de cultura normais, foi observada a inibição dependente da dose da proliferação de células de todos os compostos com IC estimado

50 valores de 6,1 uM (M-mei), 6,6? M (Etop), 7,3? M (OMP) e 9,3 uM ( HIMP) (Fig 2A).

(A) efeito Dose de derivados de imidazopiridina em LNCaP células C-81. As células foram plaqueadas em placas de seis poços a 2 x 10

3 células /cm

2 em forma regular e crescido durante 72 horas. Um conjunto de células foi, em seguida, alimentado com meio fresco contendo 0,1,5 regulares, ou 10 derivados de imidazopiridina uM com veículo sozinho para controle e crescidas durante 72 horas adicionais. Outro conjunto de células foi o primeiro esteróide fome em meio EL durante 48 horas, em seguida, tratados com os respectivos compostos em meios SR fresco contendo 1 nM de DHT durante 72 horas. Todas as células foram tratadas com tripsina e o número de células vivas foram contadas. O experimento foi realizado em poços em duplicado com 3 conjuntos de experiências independentes. Os resultados apresentados são a média ± SE; n = 2×3. *

p Art 0,05 **

p Art 0,005 ***

p Art 0,0005. (B) Efeito de derivados de imidazopiridina sobre o crescimento de várias células APC e imortalizadas de células epiteliais da próstata. Todas as células foram plaqueadas em placas de seis poços a uma densidade observado no seu respectivo meio de três dias,-esteróide fome durante dois dias, em seguida, alimentado com meio SR fresco com 1 nM de DHT contendo 10 derivados de imidazopiridina uM e cultivadas durante três dias adicionais. As células foram tratadas com tripsina e o número de células vivas foi contado. LNCaP C-81-2 x 10

3 células /cm

2, MDA PCab2b AI-3 x 10

3 células /cm

2, PC-3-2 x 10

3 células /cm

2, RWPEI- 7.5 x10

3 células /cm

2. Todas as experiências foram realizadas em poços em triplicado com 3 conjuntos de experiências independentes. Os resultados apresentados são a média ± SE; n = 3×3. *

p Art 0,05; **

p Art 0,001; ***

p

. 0,0001

Em seguida, examinaram o efeito dos compostos em condições SR, imitando as condições ADT. Os compostos inibiram o crescimento celular a seguir a resposta dose com IC estimado

50 valores de 10,2 | iM (H-Mel), 10,5 uM (OMP), 11,6 (iM HIMP), e 16,0 uM (Etop) (Fig 2A). Curiosamente, M-Mei teve a maior atividade inibitória em ambas as condições de crescimento. Embora Etop tinha inibição comparável ao M-mei em condições regulares, teve o menor efeito em condições SR. HIMP e OMP também foram mostrados para ser menos eficaz do que o M-mei em ambas as condições de tratamento.

Selective Anti-proliferativa efeito dos compostos na CaP vs. Immortalized normais da próstata células epiteliais

O efeito supressor de cada inibidor sobre a proliferação foi investigada utilizando um painel de linhas de células epiteliais da próstata cancerosas e benignos. células AI CaP incluindo AR-positiva LNCaP C-81 e MDA PCa2b-AI, bem como células AR-negativas PC-3 foram escolhidos como representantes de avançada CR CaP. células RWPE1, uma linha de células epiteliais da próstata benigna imortalizada, foram utilizados para determinar a selectividade dos compostos. Depois de três dias de tratamento 10 uM sob condições SR, HIMP, H-mei, tudo indicado e ETOP inibição selectiva da proliferação das células cancerosas com significativamente menos efeito sobre as células não cancerosas RWPE1 (Fig 2B). Embora OMP foi eficaz contra o C-81 e células PC-3, foi relativamente potente contra células RWPE1. No geral, os resultados mostram HIMP e M-mei eram os mais selectivos, inibindo o crescimento celular CaP significativamente mais do que as células RWPE1 com M-mei exibindo inibição superior em todas as linhas celulares analisadas.

Supressão de CaP de tumorigenicidade por derivados de imidazopiridina

a capacidade dos compostos ‘para suprimir a formação de colónias em LNCaP células C-81 foi inicialmente acessado por ensaios in vitro clonog�icas para o crescimento celular dependente de ancoragem. células LNCaP C-81 foram semeadas com 20, 200, e 2.000 células por poço em placas de 6 poços, e depois tratou-se com 10 uM de cada composto. Após 10 dias de tratamento, todos os compostos inibiram significativamente o crescimento clonogénico a 2.000 células por cavidade como mostrado na Fig 3A de 2.000 células por poço. Enquanto M-Mei e Etop inibiu fortemente o crescimento da colônia, HIMP e OMP foram comparativamente menos potente. a formação de colónias mínimo observado com densidades de 20 e 200 células por poço.

(A) ensaio clonogénico em mercadorias plásticos. células LNCaP C-81 foram semeadas em placas de seis poços a densidades de 20, 200 e 2000 células /poço. Após 24 horas, as células aderentes foram tratadas com os respectivos compostos a 10 uM concentrações de derivados de imidazopiridina ou solvente sozinho como controlo. As células foram alimentadas nos dias 3, 6, 9 e com meios de cultura frescos contendo os respectivos inibidores. No dia 10, as células foram coradas e o número de colónias contadas. As fotografias de placas de colónias representativos foram tomadas a partir de placas semeadas com 2,000cells /cavidade, e o número de colónias foi contado mostrado também a partir de placas semeadas com 2,000cells /poço. a formação de colónias mínimo observado com densidades de 20 e 200 células /poço. Os resultados apresentados são a média ± SE; n = 2×3. ***

p Art 0,0001. (B) ensaio de agar mole independente de Anchorage. células LNCaP C-81 foram colocadas em placas a uma densidade de prato 5 x 10

4 células /35 milímetros em 0,25% de placas de agar mole. No dia seguinte, as células em dupletos ou maiores foram marcadas e excluídos do estudo. Os meios foram adicionados a cada três dias, e no fim de 5 semanas, as colónias formadas foram coradas e contadas. Imagens representativas de colónias são mostradas (supra) e o número de colónias foi contado (abaixo). As experiências foram realizadas em duplicado com 3 conjuntos de experiências independentes. Os resultados apresentados são a média ± SE; n = 2×3. *** P 0,0001. (C). Ensaio de Adesão Celular em mercadorias plásticos. As células foram suspensas em meio de tratamento durante 30 minutos antes de serem plaqueadas em placas de 6 poços a 3 x 10

3 células /cm

2, utilizando o mesmo meio de tratamento. As células foram deixadas aderir durante uma hora, fixadas e coradas por solução a 0,2% de violeta de cristal (50:50, água: MeOH). O número total de células em cinco campos na ampliação de 40x para cada poço foi contado. As experiências foram realizadas em triplicado, com 3 conjuntos de experiências independentes. Os resultados apresentados são a média ± SE; n = 3×3. *

p Art 0,05; **

p Art 0,01. (D). A migração celular Transwell ensaio. A migração celular foi avaliada através de câmara de Boyden. Uma alíquota de 5 x 10

4 células C-81 foi semeada no inserto de placas de 24 poços em meios contendo 10 uM respectivos compostos apenas com solvente para o controlo em ambas as câmaras superior e inferior. Após 24 horas de incubação, as células migradas foram coradas e as células restantes na câmara superior foram removidas através cotonete. As células que tinham migrado através da câmara inferior foram contadas. Imagens representativas são mostrados na ampliação de 40x. As experiências foram realizadas em triplicado, com 3 conjuntos de experiências independentes e os resultados apresentados são a média ± SE; n = 3×3, *

p Art 0,05; **

p

. 0,005

O ensaio de formação de colónias em agar mole foi então realizada para determinar o efeito dos compostos sobre o crescimento independente de ancoragem em um ambiente 3-dimensional. Como mostrado na Fig 3B, as células são cultivadas a uma densidade de 5000 células por placa de 35 mm durante quatro semanas, produziram muito menos colónias com o tamanho da colónia menor quando tratado com os derivados de imidazopiridina. Em comparação com células de controlo tratadas com veículo sozinho, H-mei suprimiu o crescimento de colónias na maior extensão, reduzindo o número de colónias em 90 por cento com o tamanho da colónia mal visível (Fig 3B). Em comparação, Etop e OMP reduziu o crescimento da colônia, com 80 e 70 por cento de inibição, respectivamente, e HIMP teve o menor efeito em cerca de 50 por cento de inibição.

Para esclarecer se efeito destes compostos na formação de colónias é em parte devido para a inibição da adesão celular, a capacidade de HIMP, H-mei, OMP, e ETOP para influenciar a adesão celular CaP sobre a superfície de plástico de placas de 6 poços foi então investigada. Enquanto estes compostos tinham diversos graus de supressão da capacidade de LNCaP células C-81 para aderir a uma densidade de 50.000 células por poço, uma tendência inibidora semelhante foi observado para o de ensaios de agar clonogénicas e macios (Fig 3C comparada 3A 3B). M-Mel teve o maior efeito e foi capaz de reduzir a fixação das células em cerca de 40 por cento. Enquanto HIMP e ETOP também foram capazes de inibir significativamente a adesão celular, fizeram-no em menor grau; OMP foi encontrada para ter um efeito mínimo sobre a capacidade das células C-81 ‘para fixar à superfície de plástico. Assim, embora todos os compostos pertencem à mesma classe de moléculas, elas influenciam CaP formação de colónias de células e a adesão de forma diferente.

Para investigar a capacidade inibidora destes compostos sobre a metástase de tumor, a sua actividade sobre a migração celular foi analisada por Transwell ensaio de migração. Curiosamente, estes compostos foram encontrados a ter diferentes graus de supressão sobre a migração celular CaP. Figura 3D mostrou que ambos H-Mei e ETOP foram capazes de reduzir significativamente a migração celular LNCaP C-81 através de ensaio Boyden câmara ao longo de um período de 24 horas em cerca de 30 por cento. Comparativamente, HIMP e OMP não conseguiu reduzir significativamente a migração celular. No geral, M-Mel foi encontrado para expor a actividade inibidora mais potente na tumorigenicidade de células CR CaP.

Efeito da imidazopiridina compostos sobre proliferativa e apoptótica Sinalização na CR células CaP

É bem estabelecidas que a maioria das células CR CaP expressar AR funcional, que ainda é necessária para o seu crescimento e sobrevivência [22,31,32]. Para determinar a forma como os compostos de suprimir a proliferação de células APC, analisou-se os seus efeitos na sinalização apoptótica proliferativa e LNCaP em C-81 e MDA PCa2b-AI células AR-positiva sob condições SR. Figura 4A e 4B mostram que, após tratamento de 3 dias, 10 uM de cada composto significativamente suprimida LNCaP C-81 e de proliferação celular MDA PCa2b-AI.

LNCaP (A) C-81 foram semeadas em triplicado em frascos T25 a 4 x 10

3 células /cm

2 em meio normal, cultivadas durante 72 horas, em seguida, esteróide em jejum durante 48 horas. As células foram então tratadas com 10? M derivados de imidazopiridina ou DMSO como controlo para um período adicional de 72 horas, sob condições SR. As células foram tratadas com tripsina e o número de células vivas contadas por meio de ensaio de azul de tripano. As experiências foram realizadas em triplicado, com 3 conjuntos de experiências independentes. ***

p Art 0,0005. (B) As células MDA PCa2b-AI foram cultivadas, tratadas e contadas utilizando as condições descritas acima em (A) para as células LNCaP C-81. Os resultados apresentados são a média ± SE; n = 3×3. *

p Art 0,05; **

p Art 0,005; ***

p Art 0,0005. (C) LNCaP C-81 de lisado total de proteínas de células foram recolhidas a partir de (A) após a contagem do número de células. *

p Art 0,05;