Abstract

Fundo

Usando conjugados anticorpo /aptâmero-droga pode ser um método promissor para diminuir a toxicidade, enquanto aumenta a eficiência da quimioterapia.

Metodologia /Principais achados

neste estudo, o agente antitumoral doxorrubicina (Dox) foi incorporada no DNA aptâmero TLS11a-GC modificado, que visa especificamente LH86, um ser humano A linha celular de carcinoma hepatocelular. testes de viabilidade de células demonstraram que os conjugados TLS11a-GC-Dox exibiu tanto a potência e especificidade alvo. Importante, intercalando Dox para o aptâmero modificada inibiu a absorção não específica de Dox membrana permeável à linha de células não-alvo. Uma vez que os conjugados são seletivos para células que expressam maiores quantidades de proteínas-alvo, os dois critérios mencionados acima, são atendidas, tornando TLS11a-GC-Dox conjuga potenciais candidatos para entrega dirigida às células de câncer de fígado.

Conclusões /Significado

Considerando o grande número de aptâmeros disponíveis, que têm metas específicas para uma ampla variedade de células cancerosas, este novo método de intercalação aptâmero-droga terá implicações promissoras para quimioterápicos em geral

Citation:. Meng L, Yang G, X Zhao, Zhang L, Zhu H, C Liu, et ai. (2012) direcionados entrega de agentes quimioterápicos Usando um Aptamer cancro do fígado-específica. PLoS ONE 7 (4): e33434. doi: 10.1371 /journal.pone.0033434

editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 24 Outubro, 2011; Aceito: 08 de fevereiro de 2012; Publicação: 25 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Meng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) GM066137, GM079359 e CA133086. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

é bem conhecido que os agentes de quimioterapia do cancro tradicionais pode causar efeitos secundários graves, por sua toxicidade não específica. anticorpos para superar este problema e conseguir a entrega de drogas específicas, o nosso grupo e outros investigadores usaram [1], [2] ou aptâmeros [3], [4], [5], [6], [7], [8] , [9], [10] para criar conjugados de medicamentos ligados a ligandos para aplicações de entrega direccionada.

Os aptâmeros são oligonucleótidos de cadeia simples que se podem ligar especificamente a moléculas pequenas, [11] péptidos e proteínas. [12] Os aptâmeros não só proporcionar as vantagens de anticorpos, tais como elevada afinidade e especificidade, mas também têm baixa imunogenicidade e elevada estabilidade, com fácil síntese e modificação. Recentemente, um processo chamado de célula-SELEX (evolução sistemática de ligandos por enriquecimento exponencial) foi desenvolvido para gerar aptâmeros para o reconhecimento específico de células de cancro alvo, incluindo o de células T de leucemia linfoblástica aguda (células T ALL), cancros do pulmão de pequenas células , cancros do fígado e células infectadas por vírus. [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19] Estes aptâmeros são altamente específicos para diferentes tipos de células tumorais e tem excelentes afinidades de ligação. Porque aptâmeros proporcionar especificidade ao nível molecular, acredita-se que os conjugados aptâmero-droga pode aumentar a eficiência de entrega de drogas, enquanto que, ao mesmo tempo, reduz a toxicidade sistémica.

O carcinoma hepatocelular (CHC) é um dos mais a maioria dos cânceres comuns e mortais do mundo. Isso faz com que cerca de 600.000 mortes por ano. Atualmente, os tratamentos para câncer de fígado cedo têm contado com o transplante de fígado e ressecção cirúrgica. A quimioterapia convencional não tem sido eficiente com pacientes com cancro do fígado, e uma vez que os agentes quimioterapêuticos não são específicos para células de cancro do fígado, resultar efeitos colaterais tóxicos. Numa publicação anterior, que relataram o desenvolvimento de uma série de aptâmeros específicos, com base em um modelo de ratinho. [14] Um destes aptâmeros também é capaz de reconhecer especificamente células cancerígenas do fígado, e relatamos aqui um novo design para a entrega direccionada de Doxorubicina (Dox) para as células do cancro do fígado.

doxorubicina tem sido usada para o tratamento do cancro do fígado sob a forma de libertação localizada, mas a sua eficácia é impedida por efeitos secundários tóxicos. Para ultrapassar este problema, temos intercalados Dox em uma sonda aptâmero modificado. Dox é conhecida a intercalar-se a cadeia de ADN pela presença de anéis aromáticos planos na molécula Dox. Uma pesquisa recente revelou que já Doxorrubicina pode intercalar-se aptâmero A10 para proporcionar eficiência morte específica de células cancerosas da próstata. [6], [20].

Aptamer TLS11a foi previamente selecionados por células-SELEX contra a linha de células de hepatoma de rato BNL 1ME A.7R.1 (MEAR). [14] Ele foi escolhido para esta aplicação porque mostrou grande afinidade de ligação para LH86, uma linha de células de câncer de fígado. [21] A fim de conseguir uma maior eficiência de intercalação, uma cauda GC foi adicionado ao longo TLS11a para formar um aptâmero modificado, TLS11a-GC. Através da interacção, o rácio entre a doxorubicina e TLS11a-GC foi 25:1. Consequentemente, a eficiência de entrega de doxorrubicina foi muito mais elevado em comparação com o TLS11a originais. Além disso,

in vitro

e

In vivo

experimentos mostraram que conjugados TLS11a-GC-Dox têm muito melhor específica de eficiência de matar as células cancerosas alvo em relação aos livres Dox e controle conjugados aptâmero-Dox.

resultados

a afinidade de ligação Aptamer TLS11a

Aptamer TLS11a (Fig. 1a) foi gerado contra a linha BNL 1ME A.7R.1 de células de hepatoma de rato (MEAR) [ ,,,0],14] e mostrou forte afinidade de ligação (Kd = 4,51 ± 0,39 nM). [14] A linha celular LH86 foi estabelecida a partir de um paciente com cancro do fígado. [21] Ao TLS11a foi utilizado para testar células LH86, foi observada capacidade de ligação óbvia (Fig. 1b). Além disso, quando as células hepáticas normais humanos, Hu1082, foram testados usando TLS11a, não foi observada ligação significativa (Fig. 1C). Na Fig. 1B e C, o histograma verde mostra a ligação de fundo (controlo aptâmero, TD05) e as intensidades de fluorescência vermelha mostram a ligação de TLS11a com células alvo e controlo. Em comparação com o controlo aptâmero, há uma diferença significativa entre a força de ligação de células a TLS11a LH86 e Hu1082. Nenhuma sonda relatado anteriormente diferencia entre células cancerígenas do fígado e células hepáticas humanas normais. Além disso, o Kd de TLS11a para LH86 foi 7,16 ± 0,59 nM (Fig. 1d), em comparação com 4,51 ± 0,39 nM para BNL 1ME A.7R.1. [14].

(a) a estrutura secundária do aptâmero TLS11a e a sua capacidade de ligação para (b) LH86 e (c) células de fígado normais humanos, Hu1082. O histograma verde mostra a ligação de fundo (controlo aptâmero, TD05) e as intensidades de fluorescência vermelha mostram a ligação de TLS11a com células alvo e controlo. Todas as sondas foram marcadas com ficoeritrina-Cy5.5. (D) determinação de Kd

imagiologia imuno fluorescência e microscopia têm sido amplamente utilizados no estudo de tumores sólidos.; Por isso, também se avaliou TLS11a poderia ser utilizado para imagiologia de tumores com LH86, a linha de célula positiva. Figura S1 mostra as imagens confocais de LH86 detectado com TLS11a e uma sequência de controlo, TD05 (Texto S1). Houve intensidade do sinal significativo de TLS11a em comparação com o controlo negativo, e o padrão de sinal que mostra os aptâmeros de se ligar à superfície das células.

é geralmente assumido que os aptâmeros seleccionados contra linhas celulares de se ligar a proteínas da membrana celular . Isto tem sido demonstrado na maioria dos protocolos de SELEX envolvendo linhas de células de tumor. [22], [23] A fim de investigar a molécula alvo de TLS11a, foi realizado um ensaio de protease, em que as células LH86 foram tratados com tripsina durante 10 min a 37 ° C. Após o período de incubação, a actividade de protease foi parado com a adição de PBS arrefecido com gelo contendo 20% de FBS. As células foram rapidamente lavadas duas vezes por centrifugação e, em seguida, incubadas com os aptâmeros. Como mostrado na Figura S2, TLS11a perdido reconhecimento significativamente nas células tratadas com tripsina (S1 texto). Os sinais de fluorescência reduzida para o fundo, o que indica que o tratamento das células com as proteases causada digestão da proteína alvo, por sua vez, que mostra que a molécula alvo de TLS11a é uma proteína de membrana.

Um ensaio de internalização foi então realizada para determinar se TLS11a poderia ser internalizado após a ligação alvo. LH86 células foram primeiro incubadas com biotina ou TLS11a TD05 rotulados e depois ainda incubada com estreptavidina conjugada com PE-Cy5.5. Em seguida, o tampão foi removido, e meio de cultura com LysoSensor ™ verde NI-189 foi adicionado às células e incubado a 37 ° C durante duas horas. LysoSensor serviram como um indicador da localização nas células lisossoma. Como mostrado na Figura S3, houve internalização clara do aptâmero (S1 texto). O sinal TLS11a originado no interior das células, em vez de sobre as margens exteriores, e co-localizada com LysoSensor. A sequência de controlo não mostrou qualquer sinal em qualquer dos 4 ° C ou 37 ° C ensaios. Os resultados sugerem que TLS11a pode ter ligada a uma proteína que pode ser internalizado.

Conjugação e Estudo da Propriedade Aptâmero-Dox Complexo

Dox é conhecido para intercalar no interior da cadeia de ADN pela presença de anéis aromáticos planos, e que preferencialmente se liga a sequências de cadeia dupla 5′-CG-3 ‘ou 5′-CG-3’. [24], [25]. A estrutura secundária de TLS11a, como previsto por software NuPack (https://www.nupack.org/), é mostrada na Figura 1a. De acordo com a estrutura, existem dois-3 5′-GC ‘ou 5′-CG-3’ sequências na sequência TLS11a de tal modo que uma sequência pode TLS11a intercalam um máximo de duas moléculas de doxorrubicina. A fim de se intercalar mais moléculas de doxorubicina, uma cauda GC longo foi adicionado à extremidade 5 ‘de TLS11a para gerar um aptâmero modificado, TLS11a-GC (Fig. 2a). Por causa da cauda GC longa, TLS11a-GC forma uma estrutura em dímero. cálculo NuPack indicaram que um dímero TLS11a-GC pode intercalar até 56 moléculas de Doxorrubicina para produzir uma razão TLS11a-GC-a-doxorubicina de 01:28. Uma sequência de controlo aptâmero, TD05, também foi modificado com uma cauda longa GC para se obter a mesma relação de aptâmero de doxorrubicina (Fig. 2b). Mesmo que os dímeros TLS1a-GC e GC-TD05 pode intercalar-se a 28 Dox por aptâmero, a relação entre aptâmero e Doxorrubicina foi mantida a 01:25 nestas experiências.

A intercalação de Dox em GC-modificado aptâmeros formado conjugados físicas. (A) TLS11a-GC-Dox. (B) TD05-GC-Dox. (C) Têmpera de Dox fluorescência após intercalação. A afinidade de ligação de (d) TLS11a-GC ou (e) TD05-GC para células LH86 monitorizada utilizando citometria de fluxo. O sinal de fluorescência é de ficoeritrina-Cy5.5. Internalização de (f) Dox, (g) TLS11a-GC-Dox, e (h) TD05-GC-Dox observadas por microscopia confocal.

é bem conhecido que Dox tem propriedades de fluorescência, mas a intercalação de Dox em aptâmero ADN extingue a fluorescência do Dox, devido à formação de complexos de transferência de carga entre as bases do ADN e o anel de antraciclina. [26], [27], [28] Para analisar se esta interacção ocorre com TLS11a-GC modificado e TD05-GC aptâmeros, a fluorescência foi adquirida para Dox na ausência e na presença de um dos aptâmeros (Fig. 2c) . A solução de livre Dox tinha o sinal de fluorescência mais elevado em comparação com o grupo de preto (tampão de ligação). Quando aptâmero modificado (TLS11a-GC ou GC-TD05) foi adicionado à solução em Dox 01:28 proporção e bem misturados, a fluorescência diminuiu dramaticamente para quase o nível de fundo, o que indica que a intercalação de Dox em aptâmero ADN é viável e rápido . Mesmo depois da solução do complexo aptâmero-Dox foi mantida à temperatura ambiente durante 3 h, a fluorescência permaneceu a mesma, indicando que o complexo de aptâmero-Dox é muito estável.

A afinidade de ligação de TLS11a-CG foi determinado pela um método de competição. Após incubação com unlabeled TLS11a-GC, os locais de ligação nas células LH86 foram completamente ocupados. Em seguida, todas as células foram ainda incubadas com TLS11a marcado com corante. Uma vez que todos os locais de ligação na membrana celular foram ocupadas por não marcado TLS11a-CG,-corante marcado TLS11a não pode ligar-se a células LH86, e após a lavagem nenhum sinal de fluorescência foi detectada (Fig. 2d). Ao mesmo tempo, uma experiência de competição entre TD05-GC e dye- marcado TLS11a foi realizada. Porque TD05-CG não se ligou a LH86, os locais de ligação disponíveis para interacção com TLS11a marcado com corante, resultando em um sinal de fluorescência elevada (Fig. 2e). Após a modificação com a cauda GC longa, a citometria de fluxo de dados mostrou claramente que TLS11a-GC ainda podia ligar a células LH86, enquanto TD05-GC não podia.

liberação doxorrubicina foi investigado usando microscopia confocal. Após 1 h de incubação com doxorrubicina ou conjugados aptâmero-Dox, as células foram incubadas durante mais 3 h a 37 ° C antes de imagem. A Figura 2F mostra que as células tratadas com doxorrubicina livre teve a mais doxorubicina nos seus núcleos, enquanto que os núcleos de células tratadas com conjugados TLS11a-GC-Dox (fig. 2g) também continha doxorrubicina. No entanto, os núcleos de células tratadas com conjugados TD05-GC-Dox (Fig. 2H) continha quase nenhum doxorrubicina. Esta experiência confirmou que os conjugados TLS11a-GC-Dox tinha uma afinidade de ligação específica para células LH86 em comparação com TD05-GC-Dox conjugados. Além disso, Dox poderia ser liberado de conjugados TLS11a-GC-Dox após a internalização e poderia entrar no núcleo.

toxicidade celular de Aptamer-Dox conjugados

A viabilidade celular de LH86 tratado com TLS11a-GC -Dox, TD05-GC-Dox, doxorrubicina, TLS11a-GC ou GC-TD05 foi testada e comparada com a de células não tratadas (Fig. 3a). A concentração de doxorrubicina em TLS11a-GC-Dox, TD05-GC-Dox, e doxorrubicina livre foi mantido a 7,5 uM, e o rácio de Doxorubicina para aptâmero era 25:1. A concentração de aptâmero no TLS11a-CG, CG-TD05, TLS11a-GC-Dox, e grupos TD05-GC-Dox foi mantida a 300 nM. A partir dos dados mostrados na Figura 3a, TLS11a-GC e GC-TD05 não teve efeito significativo na viabilidade das células. É evidente que o tratamento com conjugados de TLS11a-GC-Dox diminuiu a viabilidade celular. A eficiência de toxicidade celular foi doxorubicina TLS11a-GC-Dox TD05-GC-Dox. Embora a toxicidade celular de TLS11a-GC-Dox era menor do que a da doxorrubicina livre, o efeito de toxicidade de TD05-GC-Dox era muito mais pobre. Outros experimentos usando Hu1229 células hepáticas humanas normais (Fig. 3b) mostrou que o livre Dox tinha uma toxicidade significativa, enquanto TLS11a-GC-Dox e TD05-GC-Dox tinha toxicidade semelhante e muito limitado. Estes dados demonstram que a especificidade de aptâmero TLS11a-GC para células LH86 toxicidade para as células alvo apenas alcançado

(a) a viabilidade celular relativa de LH86 (linha de células-alvo).; (B) a viabilidade celular relativa de Hu1229 (células de fígado normais humanos); (C) a Hoechst 33258 coloração para células apoptóticas LH86 e mortas tratados com uma série de concentrações de TLS11a-GC-Dox ou TD05-GC-Dox; (D) Os resultados de Western blot para a caspase 3 clivada em células LH86 tratados com uma série de concentrações de TLS11a-GC-Dox ou TD05-GC-Dox.

apoptose celular foi investigada utilizando coloração Hoechst 33258 ( A Fig. 3c). A partir das imagens de fluorescência, quando a concentração de DOX 60 uM, havia mais apoptóticas e células mortas no grupo TLS11a-GC-Dox (35,1%) do que no grupo TD05-GC-Dox (13,7%), indicando ainda mais a especificidade conjugados de aptâmero-Dox. Além disso, a activação de caspase 3 foi monitorizada utilizando Western blot (Fig. 3d). Caspase 3 desempenha um papel importante na apoptose celular, e caspase 3 clivada indica a sua activação. A partir dos dados apresentados, quando a concentração de DOX 60 uM, a densidade da banda de caspase 3 clivada em células tratadas com TLS11a-GC-Dox foi 3,3 vezes maior do que nas células tratadas com GC-TD05-Dox.

In Vivo

Estudos

Trinta NOD. ratinhos IL2 Cg-Prikdc (SCID) foram tratadas tal como descrito na secção experimental. O tamanho do tumor de cada rato foi medida a cada dois dias, e o volume médio do tumor foi calculado (Fig. 4a). Os dados mostram que tanto livre Dox e complexo TLS11a-GC-DOX tinha efeitos de inibição de tumor óbvias em comparação com o grupo não tratado. Além disso, o complexo TLS11a-GC-DOX teve um efeito mais eficiente em comparação com Dox livre, indicando que os conjugados TLS11a-GC-Dox alvo as células tumorais e alcançado maior concentração local Dox no local do tumor em comparação com livre Dox. Além disso, os tumores de cada ratinho foram recolhidos e fixados com formalina a 10% durante 24 h. Em seguida, todas as amostras foram enviadas ao laboratório central de patologia molecular para a H E coloração. A partir da H lâminas E manchadas, o tumor tratado com complexo TLS11a-GC-DOX (Fig. 4b, à direita) apresentaram necrose das células tumorais significativa em relação ao tumor sem tratamento (Fig 4b, à esquerda).

(. a) O volume médio do tumor de ratinhos tratados com nada (preto), doxorrubicina (vermelho), ou TLS11a-GC-Dox (azul); (B) As imagens microscópicas de H . E manchado lâminas de tecido tumoral

Discussão

Aptamer TLS11a foi gerado usando células de câncer de fígado de rato, mas também mostra alta afinidade de ligação para o fígado humano células cancerosas. Além disso, é a primeira TLS11a aptâmero a ser identificado como específico para as células do cancro do fígado humano. Os nossos resultados mostraram que a molécula alvo de TLS11a é muito provavelmente uma proteína de membrana que pode ser internalizado em células. Estes resultados indicam que pode ser um TLS11a aptâmero útil para a entrega de drogas específicas no tratamento do cancro do fígado.

Doxorrubicina desempenha um papel muito importante no tratamento do cancro do fígado, e que é considerado como o fármaco anti-cancro mais utilizado em todo o mundo. Dox é capaz de inibir a proliferação celular por meio de intercalação de ADN no núcleo da célula. Vários relatórios demonstraram que é livre Dox membrana permeável e pode ser captado pelas células através de um mecanismo de difusão passiva, rapidamente transportado para os núcleos, e ligado ao ADN cromossómico. [29] Por conseguinte, enquanto Dox é geralmente tóxicos para as células em proliferação, é também tóxico para as células normais, limitando assim a sua eficácia terapêutica no uso clínico. Aqui, fazendo uso de modificações de um aptâmero câncer de fígado específica ea propriedade intercalação de Dox, geramos um método fácil, rápido e eficiente para entregar Dox às células cancerosas alvo. Durante

in vitro

experimentos, provou a afinidade de ligação específico de modificação TLS11a-GC para alvejar as células LH86, mas não reconhecimento de células hepáticas humanas normais. Além disso, foi demonstrada a toxicidade específica do complexo TLS11a-GC-Dox às células alvo, em comparação com células normais do fígado, limitando assim a sua toxicidade para as células alvo apenas. Esta segmentação foi conseguida através da afinidade de ligação específica de aptâmero TLS11a. Embora TLS11a-GC-Dox conseguida boa toxicidade celular comparada para controlar TD05-GC-Dox durante ensaio MTS, menos toxicidade foi observada no grupo TLS11a-GC-Dox do que no grupo Dox livre. Além disso, menos de internalização e de libertação de Dox no grupo TLS11a-GC-Dox do que no grupo Dox livre foi observada usando microscopia confocal. -se DOX é uma molécula pequena, que pode ser rapidamente absorvido pelas células através de um mecanismo de difusão passiva. Dentro de 15 min, as células tratadas com livre Dox mostram uma fluorescência vermelha intensa na região nuclear, indicando que a velocidade de absorção é muito rápida. [29] No entanto, uma vez Dox foi intercalado na aptâmero de ADN para formar uma molécula muito maior, a absorção celular do complexo aptâmero-Dox foi principalmente dependente do aptâmero e o seu alvo membrana celular. Além disso, a internalização aptâmero necessário mais tempo (cerca de 2 h) do que livre Dox, retardando assim a internalização do complexo aptâmero-Dox e a libertação de Dox a partir do complexo. Portanto, menos toxicidade foi observada no grupo TLS11a-GC-Dox do que no grupo Dox livre durante

in vitro

experiências. Durante

in vivo

experimentos, TLS11a-GC-Dox tinha diminuído a velocidade internalização celular comparada livre Dox. No entanto, por causa do reconhecimento do alvo por TLS11a aptâmero, a concentração local de Dox foi aumentada, em comparação com livre Dox. Assim, uma eficácia mais elevada de inibição de tumor foi obtida no grupo de rato tratado com TLS11a-GC-Dox.

Em resumo, fazendo uso da capacidade de fármacos de antraciclina de intercalar entre as bases de nucleótidos, um novo design para modificar aptâmero TLS11a para TLS11a-GC e fazer Dox e conjugados TLS11a-GC foi investigada. A especificidade e eficácia deste conjugado para servir como uma plataforma de entrega de droga foi ainda demonstrada

in vitro

e

in vivo

. Os nossos dados mostraram que o aptâmero modificado retém a sua especificidade e pode carregar muito mais do que o aptâmero Dox não modificado. Além disso, os conjugados de aptâmero-Dox são estáveis ​​em meio de cultura celular e pode direccionar células diferencialmente LH86. A especificidade deste sistema foi ainda demonstrada através de tratamento das células hepáticas normais humanos, que não têm o objectivo de ligação aptâmero. O conjugado aptâmero-Dox evita a absorção não específica de Dox e diminui a toxicidade celular para as células não alvo. Além disso, o

in vivo

experimento mostrou melhor inibição de tumor pelo grupo TLS11a-GC-Dox em comparação com todos os outros grupos de controle, indicando a entrega bem-sucedida de Dox pelo aptâmero modificado. Esta especificidade de direccionamento assegurada uma maior concentração local de Dox no tumor. Além disso, os conjugados aptâmero-Dox são menores do que systemsand de administração de fármaco à base de anticorpo de qualquer outro sistema de fornecimento, [30] [31], permitindo a penetração mais rápida e menos reacções imunológicas. Prevemos que a plataforma de conjugação aptâmero-Dox recentemente concebido, que se baseia na intercalação de antraciclinas nas bases de aptâmeros, pode ser utilizado de maneiras diferentes para desenvolver novas modalidades terapêuticas alvo para a quimioterapia do cancro mais eficazes.

materiais e Métodos

Cultura de células e reagentes

células LH86 foram descritos anteriormente. [21] As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (inactivado pelo calor) e 100 UI /mL de penicilina-estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera húmida com 5% de CO

2. O cloridrato de doxorrubicina (Dox) foi comprado a Fisher Scientific (Houston, TX, EUA). Todos os reagentes para a síntese de ADN foram adquiridos a Glen Research. Salvo disposição em contrário, reagentes, tampões e solventes foram obtidos comercialmente a partir de Fisher Scientific.

Conjugação de Aptamer-Dox

Aptamer TLS11a (5′

ACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTG TTACGGTTTCCGCCTCATGGACGTGCTG

-3 ‘ ); TD05 uma sequência de controlo

(5′-CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTCTCCTCCCG GTG-3 ‘).; aptâmero modificado TLS11A-GC (5’

CGCGCGCGCGCGCGC GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTGTTACGGTTTCCGCCTCATGGACGTGCT L

-3 ‘); e sequência de controle modificado TD05-GC (5’-

CGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGAACACCGTGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTCTCCTCCCGGTG

-3 ‘) Foram sintetizados num sintetizador de DNA /RNA ABI3400 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As sequências completas foram então desprotegidos em AMA (hidróxido de amónio /40% de metilamina aquosa 01:01) a 65 ° C durante 30 min e depois purificado por HPLC de fase inversa (ProStar, Varian, Walnut Creek, CA, EUA) numa coluna C -18 em coluna, utilizando 100 mM de tampão de acetato de t rime ti lamina (TEAA, pH 7,5) e acetonitrilo como a fase móvel. Para fazer conjugados aptâmero-Dox, quer TLS11a-GC ou TD05-GC foi misturada com cloridrato de doxorrubicina em tampão (PBS contendo MgCl 5 mM de

2, 4,5 mg /mL de glucose, 0,1 mg /ml de ARNt de levedura, 1 mg /mL de ligação BSA) ou meio DMEM na proporção 01:25 de aptâmero para Dox.

foram preparados Acompanhamento da Formação de complexos por fluorescência

conjugados física entre aptâmero (TLS11a ou TD05) e doxorrubicina em um 1 :28 razão molar de aptâmero de doxorubicina (10 uM) em tampão de ligação, e a fluorescência foi monitorizado a 500-720 nm (fenda 1,5 milímetros) em um Espectrofluorímetro Fluorolog-Tau-3 (Jobin Yvon) com excitação a 480 nm.

Determinação da Afinidade Aptâmero

As células foram destacadas dos LH86 utilizando pratos de solução de dissociação de células não enzimática (Cellgro) e, em seguida, lavou-se com tampão de lavagem (PBS contendo MgCl 5 mM de

2 e 4,5 mg /mL glicose). A afinidade de ligação de TLS11a foi determinada por incubação de células LH86 (10

5) em gelo durante 30 min, com uma série de concentrações de TLS11a marcado com biotina em tampão (100 uL) de ligação. As células foram então lavadas duas vezes com tampão de lavagem (1,0 mL) e suspendeu-se em estreptavidina marcada com f luoresceína (0,1 mL) durante uma incubação adicional (15 min em gelo). Antes da análise por citometria de fluxo, as células foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem e suspensas em tampão de lavagem (0,2 mL). A intensidade de fluorescência média das células foi utilizada para calcular a constante de equilíbrio de dissociação (Kd) da interacção célula TLS11a e LH86 encaixando a dependência da intensidade de fluorescência (F) sobre a concentração da TLS11a marcado com biotina (L) para a equação F = Bmax [L] /(Kd + [L]). As experiências de ensaio de ligação foram repetidos pelo menos três vezes.

Para monitorar a afinidade de ligação de TLS11-CG, uma experiência de competição foi levado a cabo. Resumidamente, 200 nM TLS11a-GC foi incubado com células LH86 durante 20 min em gelo, e, em seguida, 1 uM de biotina marcado com TLS11a foi adicionado durante 15 minutos de incubação adicional. As células foram então lavadas duas vezes com tampão de lavagem (1,0 mL) e suspendeu-se em estreptavidina marcada com f luoresceína (0,1 mL) durante uma incubação adicional (15 min em gelo). Antes da análise por citometria de fluxo, as células foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem e suspensas em tampão de lavagem (0,2 mL).

Avaliação da captação celular de Dox por Microscopia Confocal

Para imagiologia confocal, doxorrubicina ou aptâmero -Dox conjugados foram incubadas com uma monocamada de células LH86 numa placa de cultura de fundo de 35 mm de vidro (Mat Tek Corp.) em meio DMEM a 37 ° C durante 1 h. Após lavagem uma vez que utilizam meios de comunicação, meios frescos foram adicionados a pratos durante mais 3 h de incubação a 37 ° C. Em seguida, os pratos com células foram colocadas acima de um objectivo de um microscópio confocal Olympus FV500-IX81 (Olympus America Inc., Melville, NY) 40 ×. A 5 mW, 488-nm laser de Ar + foi então usado para a excitação da doxorrubicina. O objetivo usado para imagens foi uma Olympus LC Plano F1 40X /0,60 ph 2 40 × objetiva.

MTS viabilidade celular Assay

Chemosensitivity de LH86 para Dox ou aptâmero-Dox conjugados foi determinada utilizando o CellTiter ensaio de proliferação celular de 96 (Promega, Madison, WI, EUA). Resumidamente, uma alíquota de 100 ul de células LH86 (5 × 10

4 células /mL) foi semeada em placas de 96 poços (

N

= 3) e deixou-se crescer durante a noite. Em seguida, as células foram tratadas com 100 mL de: 1) controlo aptâmero TD05-CG, 2) aptâmero TLS11a-GC, 3) Dox, 4) TD05-GC-Dox conjugado física (25:1 Doxorrubicina a razão molar TD05-CG) , ou 5) conjugado física TLS11a-GC-Dox (25:1 doxorubicina para TLS11a razão molar) durante 1 hora, lavadas e adicionalmente incubadas em meio fresco durante um total de 48 horas. Para a medição da citotoxicidade, os meios foram removidos de cada poço, e depois o reagente CellTiter (20 mL) e meios (100 mL) foram adicionados a cada poço e incubado durante 3 h. Usando um leitor de placas (leitor de microplacas Tecan Safire, AG, Suíça), a absorção foi registado a 490 nm. A percentagem de viabilidade celular foi determinada por comparação Dox e células tratadas com conjugados aptâmero-Dox com o controlo não tratado.

Hoechst 33258 coloração para células apoptóticas

apoptose celular foi determinada por alterações da morfologia núcleo. LH86 células em crescimento exponencial foram colocadas numa placa de 48 poços a uma concentração final de 1,5 x 10

4 células por poço. Após 12 h, as células foram tratadas com diferentes concentrações de TD05-GC-Dox conjugado física (25:1 Doxorubicina para TD05-GC razão molar) ou conjugado física TLS11a-GC-Dox (25:1 Doxorrubicina a razão molar TLS11a) para uma hora, lavadas e adicionalmente incubadas em meio fresco durante um total de 48 horas. Subsequentemente, as células foram lavadas duas vezes com PBS e coradas com Hoechst 33258 solução de coloração de acordo com as instruções do fabricante. Após incubação a 37 ° C durante 10 min, núcleo celular fragmentação /condensação foi detectada por microscopia de fluorescência. A morte celular apoptótica foi avaliada calculando o número de células apoptóticas, com núcleos condensados ​​em seis a oito áreas seleccionadas aleatoriamente. Os resultados mostrados representam três experiências independentes.

Western Blotting Análise

As células foram colhidas e lavadas duas vezes com tampão salino de fosfato. Os sedimentos de células foram ressuspensos em tampão de lise contendo Nonidet P-40 (10 mM de HEPES, pH 7,4, EGTA 2 mM, 0,5% de Nonidet P-40, NaF 1 mM, navo 1 mM de

4, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 1 ditiotreitol mM, 50 ug /mL de inibidor de tripsina, 10 ug /ml de aprotinina, leupeptina e) e incubou-se em gelo durante 30 min. Após centrifugação a 12000 x g a 4 ° C durante 15 min, o sobrenadante foi transferido para um tubo fresco, e a concentração de proteína foi determinada. amostras equivalentes (20 ug de proteína) foram submetidas a SDS-PAGE em 12% de gel. As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose e sondados com os anticorpos primários (anticorpo indicadas caspase-3 clivada, Cell Signaling Technology, Inc.), seguindo-se os anticorpos secundários apropriados conjugadas com peroxidase de rábano (HRP, Santa Cruz Biotechnology, Inc.). bandas imunorreactivas foram detectadas utilizando quimioluminescência aumentada (ECL, Pierce). Os tamanhos moleculares das proteínas foram detectadas determinada por comparação com marcadores de proteína prestained (Bio-Rad). Todas as densidades da banda foram calculadas usando software ImageJ.

In vivo

Experiment

O NOD. Cg-Prkdc (SCID) IL2 foram adquiridos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e alojado no biotério da Universidade da Flórida, com aprovação regulatória institucional (Institutional Animal Care e do Comitê Use). Este estudo foi aprovado pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use com a aprovação ID IC00001331. Trinta NOD. camundongos IL2 Cg-Prkdc (SCID) foram injectados por via subcutânea com 7 × 10

6

in vitro

células LH86 -propagated. Quando os tumores poderia ser facilmente visto e medido, os ratinhos foram divididos em três grupos: (1) o grupo 1, sem tratamento; (2) Grupo 2, tratado com livre Dox; e (3) o grupo 3, tratados com complexo TLS11a-GC-DOX. A dosagem Doxorrubicina foi mantido o mesmo nos grupos 2 e 3 a 2 mg /kg. Todos os tratamentos continuaram durante 11 dias. As drogas foram injetadas através da veia da cauda nos dias 1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, e todas as amostras foram recolhidas no dia 11. O tamanho do tumor para cada rato foi medido a cada dois dias. O coração, pulmão, fígado, rim e tumor de cada ratinho foram colhidos no dia 11 e fixado usando formalina a 10% durante 24 h à temperatura ambiente, e, em seguida, hematoxilina e eosina (H E de coloração) foi realizada

.

Informações de Apoio

Figura S1.

confocal imagens de coloração aptâmero com células cultivadas LH86. As células foram incubadas com aptâmero conjugado com biotina, e o evento de ligação foi observado com AlexaFluor estreptavidina-633 conjugado. TD05 sequência não vinculativo mostrou a ligação de fundo. Aptâmeros mostram uma ligação significativa ao longo do sinal de fundo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0033434.s001

(TIF)

Figura S2.