Abstract
cancros do cólon humano comumente abrigar mutações de perda de função no APC, um repressor da via WNT canônico, levando assim a sinalização de Wnt-TCF hiperativo. Restabelecimento da função Apc em ratos, projetada para reprimir condicionalmente Apc através de RNAi, resolver os tumores intestinais formados devido à sinalização Wnt-Tcf hyperactivated. Estes e outros resultados levaram a busca de antagonistas via Wnt específicos como terapias para cancros do cólon humano clinicamente problemáticas e metástases associados, que permanecem em grande parte incurável. Este ponto de vista amplamente aceito parece em desacordo com um número de descobertas utilizando material derivado do paciente: alvos TCF Canonical são reprimidas, em vez de ser hyperactivated, em cancros do cólon avançado e repressão da função TCF não costuma resultar em regressão do tumor em xenoenxertos. Os resultados de uma série de estudos genéticos do rato também sugeriram que a sinalização Wnt-TCF canônica impulsiona metástases, mas testes diretos in vivo são escassos, e, surpreendentemente, TCF repressão pode melhoram diretamente semeadas crescimento metastático. Aqui temos abordado as habilidades dos reforçada e bloqueou WNT-TCF sinalização de alterar o crescimento de tumores e metástases à distância, utilizando xenoenxertos de cancros avançados de cólon humano em camundongos. Nós achamos que a sinalização Wnt-TCF endógena é principalmente anti-metastático desde downregulation da função TCF com dnTCF geralmente aumenta a propagação metastática. Consistentemente, elevando o nível de sinalização Wnt, ao aumentar os níveis de ligandos de WNT, não é geralmente pró-metastática. Nossos dados actuais e anteriores revelam uma resposta heterogênea para modular a sinalização WNT-TCF nas células cancerosas humanas. No entanto, as conclusões de que uma fração dos cancros do cólon testados exigem sinalização WNT-TCF para o crescimento do tumor, mas todos respondem a sinalização reprimida pelo aumento metástases pedir uma reavaliação do objetivo de bloquear a sinalização de Wnt-TCF para tratar universalmente cancros do cólon. Os nossos dados sugerem que o bloqueio de WNT-TCF pode ser eficaz na inibição do crescimento do tumor em apenas um subconjunto dos casos, mas irá geralmente aumentar metástases
citação:. Seth C, Ruiz i Altaba A (2016) e metástases do cancro do cólon Tumor Mostrar crescimento respostas divergentes à modulação da Canonical sinalização Wnt. PLoS ONE 11 (3): e0150697. doi: 10.1371 /journal.pone.0150697
Autor: Michael Klymkowsky, Universidade do Colorado, Boulder, Estados Unidos
Recebido: 30 de outubro de 2015; Aceito: 18 de fevereiro de 2016; Publicação: 03 de março de 2016
Direitos de autor: © 2016 Seth, Ruiz i Altaba. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel
Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Nacional da Suíça, o consórcio CURA EU-FP7, The Cancer League suíça e pelo Departamento d’Instrução Pública de Genève à ARA. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Há um grande corpo de evidências que suportam a noção de que a sinalização de Wnt é essencial para cancros do cólon humanos, o que é talvez melhor exemplificada por dois principais conclusões i- a grande maioria dos cancros do cólon abrigar mutações no supressor de tumor APC, um antagonista via Wnt-TCF tecla [1], e a restauração da função II- Apc em
apc
comprometidos resultados ratos na perda de tumores intestinais [2]. Estes e outros resultados promoveram uma busca de terapêuticas bloqueadores WNT-TCF para tratar universalmente cancros do cólon humano com hiperativo sinalização Wnt canônico (por exemplo [3]). Dado que a APC é, até agora, não druggable, os esforços para desenvolver antagonistas WNT-TCF têm-se centrado sobre as medidas a montante (inibidores por exemplo, porco-espinho e Tankyrase [4-6] ou a jusante (bloqueadores do PFC [7], Ivermectina [8]) da APC função no complexo destruição ß-catenina. Independente da etapa alvo, muitas telas ou testes de validação ter usado um repórter TCF-luciferase para monitorar as respostas via Wnt canônico [9].
as linhas de evidência sugerem acima resumidos . uma ação robusta de WNT-TCF sinalização em cancros do cólon em fase terminal e pode fornecer um argumento convincente para o desenvolvimento e utilização de antagonistas WNT canônicos no entanto, uma das principais constatações está em desacordo com esta visão geralmente aceita: a expressão de Wnt-TCF metas reprimido, não é aumentada em cancros do cólon avançadas e metástases em comparação com tumores em estágio inicial [10], [11].
sinalização WNT-TCF também é amplamente pensado para conduzir metástases (por exemplo [12]) , promover o potencial de semeadura de células circulantes de tumor e aumentar a sinalização mediada pelo ligando no nicho metastático [13], [14]. É digno de nota, contudo, que não há testes directos para a capacidade aceites de sinalização Wnt-canónica TCF aumentada para promover metástases de células de cancro do cólon humano foram relatados. A melhor evidência para um papel de sinalização Wnt canônica nas metástases de câncer de cólon deriva de estudos com ratos [13], [14] ou a partir in vitro análises (por exemplo, [15], [16]), e outros estudos implicam um papel comprovado para aprimorada de sinalização WNT em metástases (por exemplo [17]). No entanto, assumindo que em função vivo a partir de dados in vitro, ou a biologia humana a partir de dados de ratinho, pode ser problemático, como ratinhos e seres humanos são bastante espécies distantes, e in vitro condições pode impor um Wnt-dependência de células cancerígenas do cólon humano [10].
Experimentalmente, a repressão da sinalização WNT canônica foi tentada, bloqueando a função TCF, que é a última etapa de sinalização Wnt canônico. A repressão de Wnt-TCF sinalização com pan TCF dominante-negativa (dnTCF4), mostraram ser eficazes in vitro sobre células de cancro do cólon humano (por exemplo, [18]), é, paradoxalmente, geralmente ineficazes na repressão do crescimento do tumor após a enxertia cancros avançados do cólon humanos ; Em contraste, pode impulsionar o crescimento metastático após a semeadura direta de células cancerosas nos pulmões [10], [11], [19-21]. Estes resultados levantaram a possibilidade de que o bloqueio da via de sinalização Wnt-TCF activo em células de cancro do cólon humano pode não ser geralmente terapeuticamente favorável, ao contrário do que tem sido reivindicado (por exemplo [2], [18]). No entanto, as abordagens e modelos utilizados são diferentes e pode haver diferenças metodológicas que fundamentam os resultados divergentes. Por exemplo, metástases diretamente semeadas por injecção na veia da cauda de células cancerosas humanas [10] não recapitular totalmente metástases à distância. Além disso, a ideia aceite que ligantes WNT promover o crescimento metastático derivado de ratos geneticamente modificados [13], [14], continua a ser testada diretamente usando células cancerígenas do cólon derivado do paciente.
Aqui temos comparação ganho e bloqueio dos função de abordagens para tratar diretamente os efeitos da modulação WNT-TCF sinalização no crescimento de xenoenxerto de cancro do cólon humano em camundongos e em metástases de órgãos distantes in vivo, utilizando ambas as células de câncer de cólon primário paciente-derivado e duas linhas celulares estabelecidas. Descobrimos que apenas uma minoria das células tumorais respondem a Tcf bloqueio diminuindo o crescimento do tumor testado, mas em contraste todas as células testadas responderam através do reforço metástases órgão distante. Além disso, a sinalização Wnt elevada através de níveis melhorados de ligando em células cancerosas não estimular o crescimento de tumores em qualquer caso. Em vez disso, resultou numa resposta metastático heterogénea: reforçada sinalização Wnt crescimento metastático reprimida em um caso, três casos foram estatisticamente afectada, e é reforçada metástases no outro caso. Uma análise mais aprofundada do reforço das metástases em células mCC11 revelou que este ocorreu em apenas uma das três estirpes imunocompetentes rato, argumentando que isto não é uma resposta intrínseca de células tumorais.
No geral, nossos dados actuais e anteriores [10] sugerem que o bloqueio da via de sinalização Wnt-TCF em pacientes com cancro do cólon, provavelmente, ser prejudicial em todos os casos como este irá levar a um aumento em metástases, independente de qualquer redução no tamanho do tumor primário em um subconjunto de casos. Em contraste, os resultados que se reportam aqui sugerem que a restauração da atividade da via WNT-TCF nas células cancerígenas do cólon humano pode sim ter valor terapêutico em um subgrupo de cancros metastáticos.
Materiais e Métodos
Humano amostras de câncer de cólon e de cultura de células
humana de câncer de cólon primário amostras (CC) CC36 (TNM3), CC14 (TNM4) e mCC11 (metástase hepática de paciente CC) utilizados para este estudo foram os nas referências [10], [21], [22], [23]. O HT29 humano CC e linhas de células T84, este último derivado de uma metástase do pulmão, foram obtidos a partir de serviços da linha celular. Todas as células primárias CC foram utilizados a um início de passagem in vitro em condições de cultura padrão (DMEM-F12 com 10% de FBS, 5% de CO
2).
ferramentas lentivirais e infecção de humanos CCs
introdução estável de Beta-galactosidase (ßGal) -expressing (
lacZ
+) construções repórter utilizadas partículas lentivirais a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 2. Todas as culturas infectadas foram verificados para ßGal expressão in vitro por coloração com X-Gal. lotes de cultura de células com 90% de expressão homogénea de ßGal foram selecionados para mais infecções (MOI = 2) com GFP
+ lentivectores com ou sem dnTCF4, Wnt1 ou Wnt3a. Lotes com 85% GFP
+ células foram escolhidos para todos os experimentos
Real-time PCR quantitativo
3-5D após a infecção, as células infectadas foram coletadas em Trizol e mRNA. extraídos (Life Technologies). As reações de PCR padrão foram realizadas em cDNA derivado com os seguintes iniciadores:
primers específicos de humanos:
TBP F: CCACAGCTCTTCCACTCACA
TBP R: GGATTATATTCGGCGTTTCG
HPRT F: GCCAGACTTTGTTGGATTTG
HPRT R: CTCTCATCTTAGGCTTTGTATTTTG
AXIN2 F: AGTGTGAGGTCCACGGAA AC
AXIN2 R: ACTGCCCACACGATAAGGAG
LGR5 F: GGAGCATTCACTGGCCTTTA
LGR5 R: CTGGACGGGGATTTCTGTTA
ASCL2 F: GCGTTCCGCCTACTCGT
ASCL2 R: GGCTTCCGGGGCTGAG
primers específicos do mouse:
Wnt1 F: GACGGATTCCAAGAGTCTGC
Wnt1 R: ATTGCGAAGATGAACGCTGT
Wnt3a F: GCACCACCGTGGACGACAG
Wnt3a R: CCTCGCTACAGCCACCCCAC
injeções veia da cauda em ratos NSG: Pure
lacZ
+ população de células
10
CC 6 humana células em HBSS foram injectados na veia da cauda de ratinhos de 6 semanas de idade, sexo feminino NSG imunocomprometidos (sem células T, B e NK maduros), sob procedimentos operacionais autorizados na instalação para animais no UNIGE. Os animais pesavam 20-25 g no início da experiência. Os animais foram rotineiramente verificada para os sintomas de desconforto e recolhidos 4 semanas após a inoculação seguindo protocolos aprovados. Os pulmões foram recolhidos em PBS após dissecção
xenoenxertos subcutâneos em NSG, nu e SHO ratos:. LacZ
+ células
5×10
5 células CC em HBSS foram injetados no subcutâneo camada de ratos 6 semanas de idade, fêmea nu (NMRI-Foxn1nu /Foxn1nu, faltando células T maduras) ou ratos SHO (SHO-PkrdcscidHrhr; falta de células T maduras e células B) ou imuno-comprometido NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SZJ). Cada ratinho realizada 3 xenoenxertos nos flancos. ratinhos nus e NSG foram comprados de Janvier Labs (França) e camundongos SHO de Charles River (França). Todos os animais foram 20-25g no início da experiência e foram subsequentemente rotineiramente verificados quanto a sintomas de desconforto na altura da medição do tumor. Os animais foram sacrificados ao final de 4 semanas após a enxertia e xenoenxertos e os órgãos foram recolhidos em PBS após a dissecação. Xenoenxertos foram cortadas e armazenadas em Trizol após solubilização e posteriormente processadas para a expressão do gene análises de tempo real PCR quantitativo.
Sub-cutâneo
lacZ
+/-
xenoenxertos em ratos NSG
mCC11
lacZ
+ células foram infectadas com um lentivector at 90% de eficiência. Em paralelo, mCC11 peso (
lacZ
-) células foram infectadas com GFP
+ lentivectores expressando Wnt1. mCC11-
lacZ
+ foram então misturadas 1: 1 com mCC11-
lacZ
– /Wnt1
+ células e um total de 5×10
5 células foram injectados em cada um dos três sítios por NSG ratinhos imunocomprometidos fêmeas de 6 semanas de idade, em condições aprovadas. Os animais foram rotineiramente verificados quanto a sintomas de desconforto diariamente no momento da medição do crescimento do tumor. Todos os animais foram sacrificados no final de 4 semanas após a enxertia e tumores e órgãos recolhidos em PBS no final das experiências.
A beta-galactosidase X-Gal coloração
Todos os órgãos foram lavados com PBS frio após recolha e fixadas com PFA a 4% a 4 ° C durante 2-12h. A coloração foi feita por 4-8h com X-Gal. amostras coradas foram depois lavadas com PBS estéril e inspeccionados quanto a metástases visíveis sob um microscópio de dissecação.
lacZ
+ metástases foram contadas e fotografadas.
exome sequenciação do APC
sequenciamento exome do DNA das células primárias de câncer de cólon utilizados foi realizado no Genomics facilidade da Universidade de Genebra Medical School. Apenas a APC foi analisado em pormenor para este estudo. mutações APC conhecidos apenas levando à perda de função são relatados aqui.
Animal Care
Todos os ratos foram usados no âmbito de protocolos aprovados do Gabinete Cantonal de Veterinária de Genève (OVC). Os animais foram monitorizados várias vezes por semana para o bem-estar sob orientação veterinário. Os ratos foram sacrificados no final dos experimentos e antes tumores atingiu o limite legal local através de injeção de ketazol /xilazina ou CO
2 inalação.
Resultados
Modulação da WNT canônica sinalização em xenoenxertos de cancro do cólon humano em camundongos geralmente não alteram tumor crescimento
células cancerígenas do cólon humano primários (CC14 e CC36), bem como células cancerígenas do cólon metastático (mCC11) e uma linha celular metastático (T84) foram estavelmente transduzidas com GFP
+ dominante negativo TCF4 (dnTCF), Wnt1 ou com lentivectores controle. enxertos subcutâneos em ratinhos NSG imunocomprometidos foram escolhidos por metástases de câncer de cólon cutânea ocorrer em pacientes e porque nenhum dos transplantes ortotópicos prefeito são possíveis em camundongos: até injeção na parede retal leva à fuga de embarcação, dada a sua magreza e os volumes e pressões envolvidos na injeção , levando à disseminação sistêmica. Além disso, os enxertos subcutânea são simples e altamente reprodutível.
Os níveis de expressão do bona fide câncer de cólon WNT-TCF biomarcador actividade
AXIN2
, bem como os marcadores de células tronco WNT-regulamentados
LGR5
e
ASCL2
(por exemplo [2]), foram determinados por RT-qPCR em células transduzidas in vitro e em xenoenxertos subcutâneos (Fig 1A). Todas as células in vitro e in vivo respondeu a sinalização de Wnt-TCF reprimida ou aumentada, como demonstrado pelos níveis endógenos de
AXIN2
ARNm; todas as células reprimidas
AXIN2
níveis de mRNA em resposta a pathway bloqueio por dnTCF, e todas as células aumentou
AXIN2
níveis de mRNA em resposta a via de ativação por Wnt1 (Fig 1A).
LGR5
e
ASCL2
foram regulamentados de igual modo, embora com diferenças tipo de células (Fig 1A).
(A) Quantificação dos níveis de
AXIN2
,
LGR5
e
ASCL2
por RT-qPCR in vitro e in vivo em xenoenxertos em quatro tipos de células utilizadas no presente estudo, com Wnt-TCF regulação negativa através de regulação positiva ou via dnTCF4 Wnt1 misexpression. Os números são os rácios de experimental sobre os valores Ct de controlo, após a normalização com os genes de limpeza
TBP
e
HPRT
. Note-se que em todos os casos o repórter canônica alvo e atividade WNT-TCF
AXIN2
é induzida por Wnt1 (caixas verdes) e reprimida por dnTCF4 (caixas vermelhas). (B) imagens fluorescentes de tumores dissecados de mCC11 (linha superior) e T84 células (linha inferior) GFP +. A modulação da sinalização Wnt-TCF in vivo faz com que pequenas alterações em tumores em crescimento. Barras de escala = 0,6 centímetros. (C) Histograma da quantificação do peso do tumor após a dissecação, para cada uma das quatro células de cancro do cólon utilizados. Veja o texto para mais detalhes. valores de p foram determinadas com testes t de Student bicaudal.
O crescimento do tumor foi monitorado a cada dois dias, medindo volume antes de tumores atingiram os limites legais. No final da experiência, todos GFP
+ tumores foram recolhidos ao mesmo tempo e fotografado. Em nenhum caso foram tumores experimentais maiores do que os controles (Fig 1B e 1C). Em vez disso, 4/8 xenoenxertos T84 expressando dnTCF (T84
dnTCF) não conseguiu crescer e aqueles que fez-se dentro da gama de controlo. Além disso, houve uma pequena diminuição no peso do tumor para mCC11
Wnt1 em comparação com os controles (Fig 1B e 1C). Estes resultados sugerem que cima ou para baixo de modulação de sinalização de Wnt canónico pode ter efeitos contexto-dependentes e divergentes in vivo. No entanto, a sinalização WNT em nenhum caso foi reforçada resultou em tumores maiores e bloqueio da sinalização de Wnt-TCF não têm efeitos anti-tumorais universais.
O bloqueio da atividade TCF leva a um aumento geral nas metástases de órgãos distantes
para acompanhar claramente colónias metastáticas em órgãos distantes, nós enxertado células cancerosas com células em>
-expressing lentivectores para permitir a identificação do ser humano ßGalactosidase
+ (ßGal
+) em rato tecidos após a reacção de XGal (Figura 2A; [10], [24]). Enxertia
lacZ
+ CC14
dnTCF, CC36
dnTCF ou mCC11
dnTCF (Fig 2B) resultou em um aumento líquido nas metástases nos pulmões de ratos do NSG, e na sua índice metastático (número de
lacZ
+ colónias metastáticas dividido pelo peso total do tumor em gramas uma vez que cada ratos realizada 2-3 xenotransplantes flanco subcutânea) (Fig 2C). Isto indica que para baixo a modulação da actividade de Wnt-TCF (em cerca de 50%, tal como sugerido pela
AXIN2
níveis (Fig 1A) aumenta a cheio fenótipo metastático experimental. Dado que a actividade dnTCF impediu o crescimento de um terço (4 /12) de T84
dnTCF tumores (Fig 1C), uma resposta geral metastático neste tipo celular não foi inteiramente significativa de quantificar. no entanto, o índice metastático de T84
dnTCF ratos que desenvolveram tumores foi semelhante ao de T84
controle (não mostrado).
(a) Diagrama do procedimento utilizado para analisar o efeito da regulação negativa da sinalização de WNT metástases à distância in vivo. células enxertadas são
lacZ
+, que permite a visualização de grandes colônias e até mesmo células metastáticas de solteiro em órgãos distantes, nomeadamente os pulmões (inserção de fundo). a inserção à direita mostra uma ampliação alta de
lacZ +
metástases de diferentes tamanhos depois in toto coloração XGAL para revelar
lacZ
+ células metastáticas (manchas azuis escuros). (B) imagens representativas de lobos do pulmão esquerdo de camundongos enxertados subcutaneamente com células de controlo ou aqueles com bloqueado WNT-TCF sinalização através a expressão de dnTCF4 como indicado. (C) Quantificação do número de metástases pulmonares por animal mostrada como o índice metastático (número de metástases sobre o peso do tumor) (linha de cima), e o peso do tumor (linha de baixo), como indicado em cada caso. (D) A quantificação do tamanho das colónias metastáticas do pulmão, tal como indicado por lado lobo pulmonar esquerda. Em todas as figuras as barras de erro são S.E.M. e valores de p derivam de testes t não pareado, de Student bilateral. Barra de escala = 7 milímetros para (A); 25 milímetros em (B).
A quantificação do tamanho do
lacZ
+ colônias metastáticos nos pulmões revelou que houve um aumento consistente no número de grandes ( 100 células por colónia) metástases após a repressão da sinalização de Wnt-TCF em ratinhos portadores de CC36
dnTCF, CC14
dnTCF e mCC11
dnTCF xenotransplantes, em comparação com os controles (Fig 2D). Além disso, tanto CC36
dnTCF e mCC11
dnTCF ratinhos portadores de tumor também apresentou um maior número de micrometástases ( 10 células por colónia) em relação aos controlos (Figura 2D). Estes resultados sugerem que a regulação negativa da sinalização de Wnt canónico pode levar tanto a um aumento no número de células metastáticas, atingindo um órgão distante, bem como um aumento no tamanho das colónias metastáticas.
Melhoria dos níveis de ligando faz WNT geralmente não aumentar o número de metástases de órgãos distantes
para testar a metástases à distância a partir de um local do tumor primário para um órgão distante, os pulmões, neste caso, o controlo ea Wnt1 expressando
lacZ
+ foram enxertadas em ratinhos imunocomprometidos NSG totalmente por via subcutânea (Fig 3A). Considerando CC14
Wnt1 ou CC36
tumores Wnt1 tinham níveis não significativamente alterada de metástases pulmonares, em comparação com os controles (Fig 3B e 3D), tumores T84
Wnt1 produzida em menor número e mCC11
tumores Wnt1 produzir mais metástases e teve uma metastático distribuição do índice e colônia de tamanho alterado (Fig 3C e 3D). Isto mostra que o resultado metastático de sinalização Wnt desencadeada por acção do ligando pode ser dependente do contexto, mas que a sinalização de Wnt reforçada não é universalmente pró-metastática.
(A) Diagrama do processo usado para analisar o efeito de regulação positiva de sinalização Wnt metástases à distância in vivo. (B) Os exemplos representativos de lobos pulmonares esquerdos de ratos portadores de tumores subcutâneos de diferentes células cancerígenas do cólon, tal como indicado, quer transportando controlo (linha de cima) ou expressando Wnt1-(linha inferior) lentivectores, após coloração com X-Gal. Barra de escala = 25 mm. (C) Quantificação do índice metastático em cada caso por ratinho. (D) A quantificação do tamanho das colónias metastáticas do pulmão, tal como indicado por lado lobo pulmonar esquerda. Note que os controles são os mesmos utilizados para a Fig 2 como os experimentos Wnt1 e dnTCF foram realizadas simultaneamente, mas são apresentados separadamente para maior clareza.
sinalização WNT avançado modula o número de metástases diretamente semeadas em um context dependente maneira
Para fornecer suporte adicional do fenótipo metastático observado com mCC11
Wnt1 e T84
células Wnt1 nos ensaios metastáticos completos descritos células tumorais acima, diretamente semeadas para os pulmões, por injetar
lacZ
+ mCC11
Wnt1 ou
lacZ
células + T84
Wnt1 para a circulação de camundongos NSG na veia da cauda (Fig 4A). células mCC11
Wnt1 formado muitos mais e T84
Células Wnt1 muito menos metástases em comparação com os controles (Fig 4B e 4C). Quantificação das colónias metastáticas por tamanho revelaram alterações em todas as categorias, a partir de micrometástases de células individuais a grandes colônias com 100 células (Fig 4D). Estes dados suportam os resultados de metástases distantes e afirmam que a sinalização de Wnt podem afectar o crescimento metastático e independente de quaisquer outros efeitos, incluindo no estroma do tumor primário. Estes resultados também confirmam que, paradoxalmente, os níveis de ligando WNT melhoradas são pró-metastático em um tipo de célula e anti-metastático na outra.
(A) Representação esquemática do protocolo utilizado para testar os efeitos de sinalização de Wnt reforçada sobre o crescimento metastático depois da injecção directa para a circulação frasco da veia da cauda. (B-D) Exemplos representativos (B), quantificação total (C) e quantificação do tamanho da colónia metastático (C) das regiões pulmonares X-Gal coradas após a injecção das células de controlo ou de células com a melhoria ou a sinalização de Wnt, como indicado. mCC11 crescimento metastático é aumentada enquanto que a T84 é suprimida (C, D). Note-se que o número total de colónias metastáticas representados em (C) para mCC11 é deixado por lobo pulmonar, que, dada a sua escassez, que para T84 é para toda a pulmões. Barra de escala = 7 milímetros para (B).
A falta de correlação do estado APC e WNT-TCF modulação fenótipo
Pode-se argumentar que temos células selecionado que não pode ter mutante APC, tornando assim os nossos resultados geralmente não aplicável à maioria dos cancros do cólon humanos. No entanto, notamos que portos T84
APC
mutações e que sequenciamento exome de
APC
em CC14 revela a presença de mutações de perda de função (CHR5 112.173.848 G- T, id Cosmic 18566, e
853- PARAR; CHR5 112.175.951 G- a, e
1554- . frameshift)
Para estender estas descobertas que repetimos os experimentos com dnTCF e Wnt1 usando o bem -conhecido
APC
linha de células de cancro do cólon mutante HT29 (Fig 5A). Nestas células Wnt1 e dnTCF4 regulada alvos TCF como esperado (Fig 5B). Tumores que expressam HT29
dnTCF foram ligeiramente, mas significativamente menor, mas este também foi o caso para HT29
tumores Wnt1 (Fig 5C), sugerindo a falta de uma resposta de crescimento do tumor claro para modulação da sinalização WNT. Além disso não houve diferença significativa no número de
lacZ
+ metástases de tumores HT29
Wnt1 em comparação com HT29
controles (Fig 5D e 5E). Em contraste, o aumento com HT29
dnTCF foi significativa (Figura 5D e 5E). Análises do tamanho da colônia metastático aumentos de micro e macrometástases de HT29 confirmada
dnTCF, mas não HT29
Wnt1, tumores, em comparação com o HT29
controles (Fig 5F).
(A) estratégia utilizada para administração subcutânea de metástases pulmonares. (B) Mapa de calor dos níveis de expressão de mRNA normalizados em relação aos controlos (e mais genes de manutenção) para os genes destacadas nas células HT29 cultivadas in vitro ou em xenoenxertos in vivo. Todos os números são proporções em relação aos controlos. (C, D) Efeitos da modulação da sinalização de Wnt com expressão dnTCF ou Wnt1 sobre o crescimento do tumor subcutâneo (C) e metastático índice (índice Met) (D). (E) Os exemplos representativos de imagens de pulmão esquerdo para cada caso, conforme indicado. Metástases são de cor azul escuro após a reação XGal devido à sua expressão de células-intrínseca de
lacZ
. (F) Quantificação de
lacZ
+ tamanho da colônia metastático em três categorias, conforme mostrado. Barra de escala = 20 milímetros de (E).
Em conjunto, estes dados suportam a noção geral de que a redução intrínseca de células de WNT canônica sinalização respostas em células cancerosas é pró-metastizado, e argumentam que o estado da APC não é simplesmente correlacionada com o resultado da modulação da sinalização WNT-TCF.
diferentes ligantes WNT canônicos aumenta o número de metástases distantes mCC11
para descartar a possibilidade de que os efeitos do aumento de metástases por reforçada Wnt1 foram devido a uma especificidade do ligando utilizado, repetiu-se o protocolo metastático cheia com células mCC11 expressam Wnt3a ou Wnt1, ambos os quais activam a sinalização de Wnt-TCF canónica e, como esperado, aumentar os níveis do alvo Wnt-TCF
AXIN2
eo marcador de células-tronco do cólon WNT-regulada
LGR5
sobre aqueles em células de controlo (Fig 6a). mCC11
Wnt3a
lacZ
+ células tumorais semelhantes a controles em tamanho, mas reproduzidos o reforço de metástases pulmonares distantes mCC11 produzidos
tumores Wnt1 com distribuição de tamanho semelhante colónia (Fig 6B e 6C e não mostrado).
(A) reforçada Wnt1 e Wnt3a produzir alterações semelhantes em medidas de expressão do gene alvo por RT-qPCR. (B) Os exemplos representativos de X-Gal manchado deixou lobos pulmonares com colónias metastáticas, tal como descrito. (C) Quantificação do índice metastático e do peso para mCC11 peso, mCC11
Wnt1 e mCC11
Wnt3a. Ambos Wnt1 e Wnt3a melhorar metástases mais controles, mas apenas tumores Wnt1 são ligeiramente menores. Barra de escala = 20 milímetros para (B).
mCC11
células Wnt1 promover metástases de irmãos não-Wnt1 células que expressam
Para verificar que os ligantes WNT de mCC11
células Wnt1 exercer a sinalização autónoma não-celular in vivo,
lacZ
-negative mCC11
células Wnt1 foram misturados com
lacZ
+ wt irmão células mCC11 e co-injectado para formar tumores subcutâneos ( A Fig 7A). Após o crescimento do tumor foi testada para a presença aumentada de ßGal
+ mCC11 peso células nos pulmões. mCC11 células
Wnt1 promoveu significativamente o comportamento metastático de células irmão mCC11 em peso (Figura 7B e 7C), o que indica que os ligandos Wnt1 também pode actuar não autonomamente neste contexto
.
(A) Diagrama do protocolo utilizado para testar os efeitos não autónomos de ligandos Wnt sobre-expressos em irmão, não sobre-expressam células enxertadas mCC11 ao mesmo tempo. Só
lacZ
+;
Wnt1
– células são controladas após a reação XGAL. (B) Imagens representativas de X-Gal manchado deixou lobos pulmonares nas condições descritas. (C) Quantificação do índice metastática e o peso do tumor por condição. Barra de escala = 25 milímetros para (B).
mCC11
células Wnt1 não mostram aumento metástases mais controles em ratinhos nus ou SHO
Os resultados apresentados acima mostram que WNT canônica sinalização é pró-metastático nas células mCC11, e que os ligandos de Wnt agir tanto autocrinely e não autonomamente in vivo, sugerindo que o estroma do tumor primário é pouco provável que seja o único alvo de sinalização Wnt-Pro metastático. No entanto, encontramos também que a repressão de células-autônoma da função TCF com dnTCF leva a um acentuado aumento nas metástases de órgãos distantes a partir dessas células, como acontece com todas as outras células testadas. Nós, assim, a hipótese de que o bloqueio da via de sinalização Wnt-TCF em células mCC11 poderia ser intrinsecamente e geralmente pró-metastático (em linha com os resultados em outras células testadas), mas que a sinalização de Wnt reforçada pode aumentar a metástases de células mCC11 através de um não-célula autónoma, mecanismo específico-mCC11.
Para testar se o fenótipo metastático melhorada do mCC11
Wnt1 dependia do meio, que alterou radicalmente o ambiente das células tumorais enxertadas, alterando a tensão dos anfitriões do rato ( Fig 8A). tumores subcutâneos mCC11
Wnt1 cresceu como controles fez em camundongos nus ou SHO (Fig 8B e 8C), mas, em contraste com o fenótipo metastático potente de mCC11
células Wnt1 em camundongos NSG descritos acima, mCC11
tumores Wnt1 não mostraram um aumento do número de metástases, em comparação com controlos em ratinhos nus enxertados ou SHO (Fig 8B e 8C). Estes resultados sugerem que as células mCC11 não exibem um aumento intrínseca metastático de células em resposta a um aumento da sinalização de Wnt.
(A) Diagrama do processo usado para enxertar células mCC11 subcutaneamente e as análises de metástases pulmonares resultante distantes. (B) Quantificação dos pesos tumorais metastáticas e índices que mostram a falta de promoção de metástases por mCC11
células Wnt1 enxertados anfitriões nuas ou SHO mouse.
Discussão
Noventa e três por cento dos cancros do cólon humanos abrigam hiperativação da via WNT canônica, na maioria das vezes através da perda de função da APC (https://cancergenome.nih.gov/). Isto, juntamente com os resultados obtidos com modelos de ratinho genética, tem proporcionado apoio a um papel funcional de sinalização Wnt-Tcf hiperactivo na iniciação e desenvolvimento de tumores intestinais com células em cultura in vitro e em modelos de murganho in vivo (por exemplo [2], [18], [25], [26]). Várias linhas de evidência derivada também a partir de trabalho com ratinhos transgénicos demonstraram sugerido que o aumento da actividade de Wnt, no nicho metastático através da acção de periostina [13] ou por promover o comportamento migratório das células tumorais [14] circulante, impulsiona metástases em diferentes tipos de câncer. Estes e outros dados foram tomadas para sugerir que a alta WNT canónica de sinalização em diferentes cancros humanos, incluindo os do cólon, é essencial para o crescimento de tumores e metástases em doentes, argumentando para o desenvolvimento de antagonistas terapêuticos via Wnt-TCF (por exemplo [3 ]).